0 引言

       疼痛是一种多维体验，涉及感官辨别、情感动机和认知评估成分^[1]，其慢性化过程对个体和社会均造成深远负担。尽管急性疼痛是人体的正常保护机制，但持续或反复疼痛超过3个月即发展为慢性疼痛^[2]，导致个体生活质量下降、医疗成本激增^[3]。在各类慢性疼痛中，颈痛因其高发病率与病情的反复性尤为突出。全球有超过三分之一的人遭受颈部疼痛至少3个月^[4]，且每年的患病率高达10%~15%^[5]，颈痛被列为非致命性残疾的第二大原因^[6]。然而，当前颈痛慢性化的病理机制尚未明确，尤其是急性颈痛向慢性颈痛转变的中枢机制缺乏系统研究，导致临床缺乏针对性的干预靶点。已有研究证实，急性疼痛到慢性疼痛的转变与应激反应最为密切^{[7, 8]}，且这一过程可以通过大脑结构和功能活动的变化来表征^{[9, 10]}。其中，下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic pituitary adrenal, HPA）被认为是应激反应和疼痛慢性化的关键通路。下丘脑（hypothalamus, HYP）作为HPA轴的启动区域，通过释放促肾上腺皮质激素释放激素激活垂体－肾上腺系统，调控机体对应激的反应，在疼痛慢性化中扮演关键角色。神经成像研究进一步提示，包括HYP在内的边缘系统可能通过功能连接（functional connectivity, FC）参与疼痛的慢性化进程^{[11, 12]}。例如，研究显示，慢性疼痛患者的HYP与杏仁核、前扣带回等脑区连通性降低，且和临床症状相关^[13]。然而，目前关于HYP FC如何具体影响疼痛慢性化患者大脑宏观连接的机制仍不明确。此外，疼痛慢性化作为一种涉及大脑“断连”的疾病^[12]，遗传因素对脑连接组的调控作用已得到广泛验证^{[14, 15]}，但现有研究多局限于大脑宏观功能或微观基因表达的单一尺度分析，尚未有研究将两者跨尺度有效结合。这一研究领域的空白，亟待我们进一步地探索和填补。

       全脑基因表达图谱弥合了脑连接组与转录组之间的差距^[16]，基于此，研究者们确定了与慢性疼痛相关的许多基因变异^[17]。其中，艾伦人脑图谱（Allen Human Brain Atlas, AHBA）微阵列数据集包含了人类全基因组微阵列数据集和RNA测序数据集，常被用于识别与人类神经成像相关的转录组信息^[18]。通过结合神经成像和基因转录本分析，我们能够更深入地理解微观变化是如何影响宏观大脑活动，从而导致急性疼痛向慢性疼痛的转变。然而，目前尚未有研究对急性颈痛和慢性颈痛患者队列进行分析，描绘疼痛慢性化过程中颈痛患者大脑FC的异常模式。此外，关于与疼痛慢性化相关的关键基因的识别也尚未得到充分的研究。本研究旨在填补这一空白，以颈痛慢性化为切入点，通过比较急性颈痛和慢性颈痛患者的大脑FC，并运用影像转录组学技术识别可能参与颈痛慢性化过程的关键基因。通过这一研究，希望能够为理解疼痛慢性化的跨尺度中枢机制提供新的视角。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       于2023年3月至2024年5月在山西中医药大学校园和山西省针灸医院招募受试者。本研究遵守《赫尔辛基宣言》，经山西省针灸研究所生物医学研究伦理委员会批准（批准文号：伦审科2023第007号）。所有受试者均签署了知情同意书。

       颈痛诊断标准：参照中国康复医学会制定的《颈椎病诊治与康复指南》和美国物理治疗协会骨科分会制定的《颈部疼痛功能、残疾和健康国际分类相关临床实践指南》进行诊断^[19]。其中，急性颈痛患者病程小于1个月，慢性颈痛患者病程超过3个月。

       颈痛患者纳入标准：（1）符合颈型颈椎病诊断标准；（2）视觉模拟量表评分大于3分（范围为0~10分）；（3）18~60岁；（4）右利手。排除标准：（1）妊娠期或哺乳期女性；（2）有精神、神经系统疾病，无法正常交流者；（3）MRI扫描禁忌证者，如幽闭恐惧症等；（4）正在参加其他临床试验者；（5）MRI数据最大头部运动平移>2.0 mm或旋转>2°者。

1.2 MRI数据采集

       本研究患者于山西省人民医院采用3.0 T MR扫描仪（Siemens 3 T Tim trio, Germany）进行MRI扫描，具体参数如下：

       三维T1加权成像，采用磁化准备快速梯度回波（magnetization prepared rapid gradient echo, MPRAGE）：TR 1900 ms，TE 2.26 ms，FOV 256 mm×256 mm，矩阵256×256。静息态功能磁共振成像（resting-state functional magnetic resonance imaging, rs-fMRI）扫描，采用回波平面成像：TR 2000 ms，TE 30 ms，FOV 240 mm×240mm，矩阵64×64，翻转角90°，扫描层数31，层厚5 mm，共扫描240个时间点。

1.3 MRI数据分析

       本研究使用运行于MATLAB 2018a平台的SPM12（https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm）和DPARSF软件（http://rfmri.org/DPABI）对数据进行预处理，包括格式转换，去除扫描的前10个时间点，以中间时间点的图像作为参考层进行时间层校正，剔除了头动在X、Y、Z轴三个方向的平移大于2.0 mm及围绕这三个轴的旋转大于2°的数据，采用T1配准，将高分辨率的T1结构像与标准模板进行配准，并应用于功能像上。

       FC分析：以HYP作为种子点，根据文献定义的HYP的蒙特利尔神经学研究所坐标系统（Montreal Neurological Institute Coordinate System，MNI）坐标^[20]，左侧（X=-4，Y=-1，Z=-13），右侧（X=5，Y=-1，Z=-13）构建半径为2 mm的球形种子点，将种子点的平均时间序列与全脑所有体素的时间序列做Pearson相关分析，计算Pearson相关系数r，正态化处理后进行Fisher's Z变换得出种子点的FC映射图。

1.4 影像转录组分析

1.4.1 转录图谱数据的处理

       本研究使用AHBA转录组数据集（human.brain-map.org）进行转录组分析，该数据集对6个24~57岁的尸体大脑进行了基因表达测量^[21]。AHBA转录图谱数据进行了以下预处理：首先，利用Re-Annotator工具包验证探针到基因的注释准确性；随后，过滤探针，保留在至少50%样本中表达水平超过背景水平的探针，并基于微阵列数据集与RNA测序数据的相关性（相关系数>0.2）选择代表性探针；接着，将组织样本配准至AAL90大脑图谱，并应用缩放稳健的S型归一化方法，以最小化样本内基因间及基因内样本间的表达差异；最后，基于差异稳定性对基因集进行过滤。鉴于所有遗体捐赠者均包含大脑左半球数据，分析中仅保留左半球样本，以确保数据一致性和可比性。

1.4.2 大脑功能活动和基因表达的区域变化

       为了确定颈痛慢性化患者的遗传基础，本研究进行了转录组-神经影像关联分析。其中，偏最小二乘（partial least squares, PLS）回归被用于确定慢性颈痛和急性颈痛患者区域变化（来自左半球58个大脑区域的t值）与所有15 633个基因转录活性之间的关系。在PLS回归中，基因表达数据被用作脑区功能活动变化的预测变量。PLS的第一个成分（PLS1）是与大脑活动变化最强烈相关的基因表达值的线性组合。

       考虑到空间自相关，使用基于功能活动统计图（进行5000次排列）的球形旋转的排列测试来检验PLS1是否比随机预期更多地解释了功能活动统计图与全基因组表达之间的协方差的原假设。使用Bootstrapping估计每个基因的PLS1的变异性，每个基因的权重与其Bootstrapping标准误差的比值被用来计算Z分数，并根据它们对PLS1的贡献对基因进行排名。

1.4.3 富集分析

       Metascape analysis（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）提供自动化的Meta分析工具，以了解40个独立知识库中的共同或独特途径。本研究使用Metascape将基因本体论（gene ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路与负权重PLS1-和正权重PLS1＋基因列表对齐。将Z值排在前5%的PLS1+或PLS1-输入Metascape网站，设置显著性阈值为5%，并通过FDR进行校正。为了探索PLS1-基因列表与颈痛慢性化的多基因风险之间的联系，为共享基因创建了一个蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络。

1.5 统计学分析

       临床数据分析使用SPSS 26.0统计软件进行统计分析。正态分布的计量资料用x¯±s形式表示，非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用两独立样本t检验或Mann-Whitney U检验。计数资料用频数或百分数表示，组间比较采用χ²检验。以P<0.05为差异有统计学意义。神经影像数据使用运行于MATLAB 2018a平台的SPM8软件对受试者的FC值进行两样本t检验。所有分析均采用高斯随机场（Gaussian random field, GRF）校正，体素水平P<0.01，簇水平P<0.05。

2 结果

2.1 一般资料

       本研究共纳入受试者180例，其中，4例急性颈痛患者和1例慢性颈痛患者因头动过大而停止了神经影像学分析。最终纳入分析急性颈痛患者86例，慢性颈痛患者89例。急性颈痛患者和慢性颈痛患者的性别、年龄、身高和体质量差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

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表1  急性颈痛患者与慢性颈痛患者一般资料
Tab. 1  General information of patients with acute neck pain and chronic neck pain

2.2 两组患者FC差异

       与急性颈痛患者相比，慢性颈痛患者存在左侧HYP和右侧眶部额上回FC值的增高，及右侧额中回FC值的降低（表2，图1）。

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图1  急性颈痛患者与慢性颈痛患者相比功能连接差异脑区。蓝色显示对比急性颈痛，慢性颈痛患者功能连接明显下降的脑区；红色显示对比急性颈痛，慢性颈痛患者功能连接明显升高的脑区；基于GRF校正（体素水平P<0.01，簇水平P<0.05）。
Fig. 1  Brain regions with functional connectivity differences between patients with acute neck pain and chronic neck pain. The blue areas indicate brain regions where functional connectivity significantly decreased in chronic neck pain patients compared to acute neck pain patients; The red areas show brain regions where functional connectivity significantly increased in chronic neck pain patients compared to acute neck pain patients; based on GRF correction (voxel level P < 0.01, cluster level P < 0.05).

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表2  急性颈痛患者与慢性颈痛患者相比功能连接差异脑区
Tab. 2  Brain regions with functional connectivity differences between patients with acute neck pain and chronic neck pain

2.3 与FC区域变化相关的基因表达

       本研究预处理后，获得了58×15 633的转录矩阵用于后续分析。PLS分析证实PLS1成分可解释转录组-脑功能影像关联中43.43%的方差。随机置换检验结果显示该解释率显著超越随机置换背景下的预期值（P<0.05），表明基因表达与左半球脑功能活动差异的关联具有稳健的统计学基础（图2A）。球形旋转检验进一步证实，PLS1加权基因表达呈现出从下丘脑至前额叶的显著梯度分布模式（图2B），且该模式独立于脑区空间邻近性（P<0.001）。此梯度特征与人类皮层转录组架构的已知区域变异高度吻合，被解释为人类皮层转录架构的区域性变化。此外，本研究发现PLS1加权基因表达图谱与病例对照t图空间正相关（皮尔逊r=0.491，P<0.05）（图2C）。根据单变量单样本Z检验对PLS1的标准化权重进行排名（图2D），发现181个PLS1+和182个PLS1-加权基因表达分别随着功能活动变化地增加（或减少）而过表达（或低表达）。

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图2  与功能连接差异相关的基因表达谱。2A显示左半球功能连接网络的变化，色彩条颜色越深表示功能连接值越高；2B显示左半球PLS1评分的加权基因表达图谱，色彩条颜色越浅代表PLS1分数越大；2C显示PLS1分数和功能连接区域变化（皮尔逊r=0.491，P<0.05）的散点图；2D显示PLS1上正加权和负加权基因。PLS1：偏最小二乘第一成分。
Fig. 2  The gene expression profile associated with functional connectivity differences. 2A shows the changes in the functional connectivity network of the left hemisphere, darker colors on the color bar indicate higher functional connectivity value; 2B shows the weighted gene expression map of the left hemisphere PLS1 scores, lighter colors on the color bar indicate higher PLS1 scores; 2C displays a scatter plot of the PLS1 scores and the changes in functional connectivity regions (Pearson r = 0.491, P < 0.05); 2D shows the positively weighted and negatively weighted genes on PLS1. PLS1: partial least squares first component.

2.4 与FC变化相关的富集分析

       在校正富集项（PFDR<0.05）并丢弃离散的富集簇后，PLS1＋最显著的细胞组成包括“突触后”“谷氨酸能突触”“树突”和“轴突”等；分子功能包括肌动蛋白结合；生物过程主要参与“化学突触传递的调节”“突触信号传导”“突触结构或活动的调节”“膜电位的调节”“轴突发育”“细胞投射组织调节”和“大脑发育”等（图3A）。

       PLS1-的结果显示，最显著的细胞组成包括“中间丝细胞骨架”“中心粒”等；分子功能包括“DNA结合转录激活活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性”“染色质结合”等；生物过程主要参与“生长激素分泌的调节”“感觉器官发育”“白细胞凋亡过程的负调节”和“上皮细胞分化”等（图3B）。

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图3  富集分析。3A显示正权重排名前5%基因的PPI网络；3B显示负权重排名前5%基因的PPI网络。Metascape富集网络可视化展示了富集术语的簇内和簇间相似性。每个术语用一个圆形节点表示，其大小与包含在该术语中的输入基因数量成比例，颜色代表其簇身份（相同颜色的节点属于同一簇）。PPI：蛋白质-蛋白质相互作用。
Fig. 3  Enrichment analysis. 3A shows the PPI network of the top 5% positively weighted genes. 3B shows the PPI network of the top 5% negatively weighted genes. The Metascape enrichment network visualization demonstrates the intra-cluster and inter-cluster similarities of enrichment terms. Each term is represented by a circular node, with its size proportional to the number of input genes included in the term, and its color representing its cluster identity (nodes of the same color belong to the same cluster). PPI: protein-protein interaction.

3 讨论

       本研究首次联合宏观全脑FC及微观艾伦人脑图谱基因表达的分析方法，研究了急性颈痛向慢性颈痛转变的跨尺度中枢机制。研究结果表明，颈痛慢性化的致病机制可能与微观层面基因表达的异常密切相关。这些基因表达的异常在宏观层面上“驱动”了HYP与前额叶（prefrontal cortex, PFC）脑区FC的异常变化，进而促进了颈痛的慢性化过程。这一发现为理解颈痛慢性化的病理机制提供了新的视角，具有重要的临床价值，为开发针对颈痛慢性化的诊断和治疗策略提供了理论基础。

3.1 “HYP-PFC”环路介导急性颈痛向慢性颈痛的转变

       急性疼痛到慢性疼痛的转变与应激反应最为密切^[7]，一项发表在Science的研究发现，应激后HYP背内侧核逆行投射到PFC亚区的神经元激活数量增加，提出HYP与PFC之间存在参与应激反应的神经环路^[22]。此外，研究证实长期暴露于应激刺激会导致疼痛小鼠PFC中广泛的树突棘丢失^[23]，而PFC作为HPA轴负反馈作用的靶点^[24]，存在一群响应外周伤害性刺激的神经元，能通过影响下游脑区处理和外周伤害性刺激信息的调制导致疼痛的慢性化发展。可见，“HYP-PFC”环路FC异常是疼痛慢性化的关键中枢病理特征。与其研究结果一致，本研究发现与急性颈痛患者相比，慢性颈痛患者确实存在“HYP-PFC”环路中HYP到PFC眶部额上回和额中回FC的异常，这与慢性化患者应激反应的持续异常有关。

       另一方面，慢性疼痛是疼痛记忆的持续存在和损伤后疼痛记忆无法消除的结果^{[25, 26]}，PFC作为参与疼痛情绪和认知处理的关键区域，其异常的功能活动可能导致皮层下驱动的恐惧行为消除失败^[27]；同时，PFC可通过下行疼痛调节通路与脑干和脊髓中的疼痛处理中心相联系，调节疼痛信号的传递。本研究中“HYP-PFC”环路FC受损，下行疼痛抑制机制可能减弱，导致疼痛感知的增强，从而促进了颈痛的慢性化进程。这一发现或为颈痛慢性化的治疗提供新的靶点。

3.2 基因表达失调与疼痛慢性化紧密相关

       疼痛慢性化是一个涉及多种细胞成分、分子功能及生物过程变化的复杂现象^{[28, 29]}。基因表达的异常是疼痛疾病中的一个可重复观察到的现象^[17]。本研究通过GO和KEGG富集分析发现，PLS1+与PLS1-分别涉及不同的生物学过程。PLS1+显著富集于“谷氨酸能突触”“树突发育”及“轴突生成”等过程；PLS1-则主要关联“中间丝细胞骨架”“染色质结合”等基础代谢过程。尽管两者均与疼痛慢性化存在一定关联，但PLS1+与疼痛信号的传递和调节紧密相连，为我们深入理解颈痛慢性化的机理提供了关键的视角。特别是谷氨酸，在疼痛慢性化的形成中起着决定性作用^{[30, 31, 32]}。谷氨酸作为一种主要的兴奋性神经递质，其过度活跃会引发神经细胞的敏化，在维持慢性疼痛中至关重要。有学者提出，疼痛慢性化的潜在机制可能与谷氨酸失活诱导的机械性痛觉过敏有关^{[30, 33]}，其通过与神经元上的特定受体结合，神经元的兴奋性和突触传递的效率被改变，从而影响疼痛信号的传递^{[34, 35]}。大量证据也表明，谷氨酸信号通路和谷氨酸受体介导的神经可塑性变化是慢性疼痛发生和进展的重要神经生物学机制^[36]。可见，谷氨酸的异常、中枢敏化进程的加速是疼痛慢性化的重要机制。

       值得关注的是，负责处理疼痛的谷氨酸递质在HYP和PFC区域有着重要的分布。其中，HYP作为连接大脑皮层和脑干的重要枢纽，通过释放谷氨酸递质，接收谷氨酸能神经的传入，参与了对疼痛反应的整合和情绪反应的调节过程。HYP谷氨酸递质的过度活动可能导致疼痛敏感性的增加，使得个体对疼痛刺激的反应更加剧烈。同时，PFC负责评估疼痛的威胁程度，并通过谷氨酸介导的神经通路影响个体的疼痛感知和行为反应^[37]。研究发现在急性疼痛阶段，内侧前额叶谷氨酸水平最初会上升，然而随着疼痛从急性阶段转变为慢性阶段，其水平将逐渐降低。加之，在一项针对腰痛的研究中，发现内侧前额叶皮质与HYP室旁核之间的神经连接通过谷氨酸作为主要递质，激活这一谷氨酸能神经环路能够引发中枢敏化，从而推动疼痛由急性向慢性状态的转变^[38]。这和本研究结果一致，谷氨酸异常释放影响“HYP-PFC”环路的连接状态，导致疼痛信号的持续和放大，是颈痛慢性化发病的重要机制。

3.3 局限性

       本研究的局限性主要体现在以下几个方面：首先，本研究主要关注于疼痛程度，未对颈痛的疼痛侧别进行分析，这可能会影响对疼痛特异性的深入理解。其次，本研究采用的是资料的横向比较方法，虽然能够提供一定时间点的信息，但未能捕捉到急性颈痛向慢性颈痛转变的动态过程。为了更全面地揭示这一转变机制，我们计划在未来的研究中开展纵向的长时间观察，以便更准确地追踪和阐明颈痛慢性化的动态变化机制。

4 结论

       综上所述，本研究首次在颈痛中整合影像转录组学，通过创新性地结合宏观全脑FC与微观基因表达分析，揭示了颈痛慢性化的跨尺度中枢机制，发现颈痛慢性化与HYP与PFC脑区FC的异常以及基因表达失调密切相关，为深入理解颈痛慢性化的病理过程提供了新视角，并有望为开发新的诊断和治疗策略指明方向。