0 引言

       胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是一种侵袭性极强、预后极差的消化系统恶性肿瘤，五年生存率远低于10%^[1]，近年来在全球范围内发病率和死亡率呈快速上升趋势，严重威胁着患者的生命健康。众所周知，PDAC是典型的乏氧性肿瘤，缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factors-1α, HIF-1α）作为乏氧激活的重要调控因子，在PDAC发生、发展中起着重要作用^{[2, 3, 4]}。PDAC组织中过表达的HIF-1α与患者的不良预后和侵袭性肿瘤表型密切相关^{[5, 6]}。针对HIF-1α寻找有效抑制物可为PDAC治疗提供新思路，研究发现，HIF-1α抑制剂已经被证明具有较高的抗癌作用，能够提高PDAC对化疗的敏感性^{[7, 8]}。因此，术前准确评估HIF-1α对PDAC患者术前分层及个体化治疗方案的选择具有重要的临床意义。目前，组织病理学仍是评价HIF-1α的金标准，需要对肿瘤进行穿刺或手术切除，存在操作有创、过程烦琐、诊断滞后的缺点^[9]。因此，开发有效、无创的方法来评估PDAC中HIF-1α表达是亟需解决的问题。

       磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）因其无电离辐射、出色的软组织对比度、可提供多角度和多参数成像等优点已成为PDAC重要的无创检查手段^[10]。磁共振扩散峰度成像（diffusional kurtosis imaging, DKI）是在传统扩散加权成像（diffusion weighted imaging, DWI）基础上改进和发展的，可以在多个方向上量化生物组织中偏离高斯分布的水分子运动的MRI新技术，较DWI的表观扩散系数（apparent diffusion coefficient, ADC）能更全面地反映肿瘤微结构的复杂程度^{[11, 12]}，其主要参数包括平均扩散峰度（mean kurtosis, MK）和平均扩散系数（average diffusion coefficient, MD）。DUAN等^[13]在小鼠纤维肉瘤模型中发现，ADC值、MD值和MK值中，只有MK值在肿瘤不同HIF-1α组别之间差异存在统计学意义，且与HIF-1α表达呈正相关。LI等^[14]将DKI技术用于软组织肉瘤的乏氧研究，发现HIF-1α表达水平与MK值呈正相关，与MD值呈负相关，并且通过分别绘制DWI、体素内不相干运动DWI和DKI各参数的ROC曲线，发现MK值的预测性能最好。然而，目前尚未发现应用DKI预测PDAC中HIF-1α表达的报道。本研究旨在探讨应用DKI技术术前预测PDAC中HIF-1α分级的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       回顾性分析2022年1月至2023年12月在山东大学齐鲁医院手术病理确诊为PDAC患者的临床及影像资料。纳入标准：（1）所有肿瘤均为手术切除，且术后病理结果证实为PDAC；（2）临床及病理资料完整；（3）术前1周内进行包含DKI-DWI序列的MRI平扫及增强检查；（4）可行病理免疫组化。排除标准：（1）DWI图像或DKI-DWI图像伪影较重影响测量；（2）病理切片不能满足评估要求；（3）术前接受过化疗、放疗、免疫治疗等其他类型的抗肿瘤治疗。最终，共纳入61例患者，年龄30~75（61.84±10.94）岁。本研究符合《赫尔辛基宣言》并获得了山东大学齐鲁医院伦理委员会审批同意，免除受试者知情同意，批文编号2021253。

1.2 临床及病理资料收集

       临床资料主要从电子病历系统中进行收集：（1）流行病学信息，包括性别、年龄、身体质量指数、有无糖尿病、高血压、吸烟和饮酒史等；（2）实验室资料，包括淋巴细胞比率、单核细胞比率、中性粒细胞比率、淋巴细胞计数、单核细胞计数、中心粒细胞计数、白蛋白、球蛋白、白球比、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、糖类抗原CA125（carbohydrate antigen 125, CA125）、糖类抗原CA19-9（carbohydrate antigen 19-9, CA19-9）等；（3）术后常规病理资料，包括肿瘤最大径、肿瘤位置、肿瘤分期[参考美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer, AJCC）TNM分期手册第8版^[15]]、分化程度（参考世界卫生组织2019年消化系统肿瘤分类^[16]，高分化导管腺癌：主要结构为分化较好的导管样结构；中分化导管腺癌：由不同分化程度的导管样结构组成，有些与高分化腺癌相似；低分化导管腺癌：只见少许不规则腺腔样结构，大部分为实性癌巢）、有无神经及微血管侵犯等。

1.3 免疫组织化学染色

       所有PDAC组织标本均经10%中性福尔马林溶液固定、石蜡包埋及4 μm连续切片。切片按说明书采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白‐过氧化物酶连结法（streptavidin‐perosidase, SP）法检测HIF-1α状态。免疫组织化学评分由两名具有6年以上工作经验的胰腺病理学医师采用双盲法进行评估，最终取两名病理科医生测量值的平均值纳入后续研究。HIF-1α阳性表达为肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒。每张切片随机选取癌细胞数目较多的5个高倍视野（×400），在每个视野中计数100个细胞。染色强度评分标准为0分（不着色）、1分（淡黄色）、2分（棕黄色）和3分（棕褐色/黑色）；阳性细胞染色百分比评分标准为0分（<5%）、1分（≥5%且<25%）、2分（≥25%且<50%）、3分（≥50%且<75%）和4分（≥75%）。通过将染色强度得分乘以阳性细胞染色的百分比来计算最终评分结果^[17]。评分≤4分为低表达，评分>4分为高表达。

1.4 检查方法

       所有符合纳排标准的患者均在术前采用1.5 T磁共振扫描仪（Siemens Healthcare, Erlangen, Germany）及16通道体部相控阵线圈进行腹部MRI扫描。检查前嘱患者禁食8~12小时，禁饮4小时，以避免因胃肠造成伪影影响图像的准确性。患者采取仰卧位扫描，序列包括：轴位T1WI序列、轴位T2WI序列、轴位T2WI脂肪抑制（fat saturation T2WI, FS-T2WI）序列、冠状位T2WI序列、轴位DWI（b值：0和800 s/mm²）序列、轴位DKI（b值分别为：0、500、1000、1500和2000 s/mm²）序列和T1WI动态对比增强序列。具体扫描方案详见表1。动态对比增强序列对比剂采用经肘静脉注射钆双胺注射液（欧乃影，GE药业，爱尔兰），注射剂量为0.1 mmol/kg，速率为2.5 mL/s，分别在15~20 s、60 s、180 s采集轴位动脉早、晚期、轴位门静脉期、轴位及冠状位延迟期图像。

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表1  MRI扫描参数
Tab. 1  MRI scan parameters

1.5 图像分析

       由两名具有5年以上腹部工作经验的放射学医师使用西门子后处理工作站和医学影像交互工具包（Medical Imaging Toolkit, MITK）采用双盲法分别对DWI和DKI数据进行处理。结合T2WI图像，选择最大层面绘制肿瘤实性区域感兴趣区（region of interest, ROI），避免囊变、坏死、钙化、出血、血管及胰管区域。根据单指数模型公式Sb/S0=exp（-b×ADC），采用b值为0和800 s/mm²拟合得到ADC值，根据非高斯扩散模型公式Sb/S0=exp（-b×D+1/6×b2×D2×k），采用从低到高5组b值拟合得到MD值和MK值。最终取两名放射科医生测量值的平均值纳入后续研究（图1、2）。

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图1  男，56岁，HIF-1α低表达的PDAC患者。1A：T2WI示胰腺体部稍高信号灶；1B：ADC图示病灶平均ADC值为0.65×10^-3 mm²/s；1C~1D：MD、MK平均值分别为2.88×10^-3 mm²/s、0.63；1E：免疫组织化学染色显示HIF-1α高表达（SP ×400）。
图2  男，71岁，HIF-1α高表达的PDAC患者。2A：T2WI示胰腺体部稍高信号灶；2B：ADC图示病灶平均ADC值为0.72×10^-3 mm²/s；2C~2D：MD、MK平均值分别为1.98×10^-3 mm²/s、0.72；2E：免疫组织化学染色显示HIF-1α高表达（SP ×400）。HIF-1α：缺氧诱导因子-1α；PDAC：胰腺导管腺癌；ADC：表观扩散系数；MD：平均扩散系数；MK：平均扩散峰度。
Fig. 1  Male, 56 years old, PDAC patient with low expression of HIF-1α. 1A: T2WI shows slightly high signal intensity in the body of the pancreatic; 1B: The average ADC value of the lesion in the ADC diagram is 0.65 × 10^-3 mm²/s; 1C-1D: The average values of MD and MK are 2.88 × 10^-3 mm²/s and 0.63, respectively; 1E: Immunohistochemical staining shows high expression of HIF-1α (SP × 400).
Fig. 2  Male, 71 years old, PDAC patient with low expression of HIF-1α. 2A: T2WI shows slightly high signal intensity in the body of the pancreatic; 2B: The average ADC value of the lesion in the ADC diagram is 0.72×10^-3 mm²/s; 2C-2D: The average values of MD and MK are 1.98 × 10^-3 mm²/s and 0.72, respectively; 2E: Immunohistochemical staining showed high expression of HIF-1α (SP × 400). HIF-1α: hypoxia-inducible factors-1α; PDAC: pancreatic ductal adenocarcinoma; ADC: apparent diffusion coefficient; MD: average diffusion coefficient; MK: average diffusion kurtosis.

1.6 统计学分析

       采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。符合正态分布的连续型数据采用均值±标准差表示，采用独立样本t检验，非正态分布的数据采用中位数（四分位间距）表示，采用Mann-Whitney U检验，分类变量用频数（百分比）表示，采用卡方检验（或Fisher精确检验）。将P<0.05的变量采用向前逐步分析法进行多因素logistic回归确定HIF-1α表达的独立影响因素。使用组内相关系数（intra-class correlation coefficient, ICC）检验两名放射科医生和病理科医生所测各MRI参数和HIF-1α免疫组化评分的一致性（ICC≤0.40：一致性差；0.40<ICC<0.75：一致性为中等；ICC≥0.75：一致性良好）。通过受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线评价各影像及临床、病理参数对不同HIF-1α分级的预测效能，确定曲线下面积（area under the curve, AUC），根据约登指数获得相应的敏感度、特异度和准确性评价预测性能。通过DeLong检验、基于logit模型的净重分类改善指数（Net reclassification improvement, NRI）与综合判别改善指数（integrated discrimination improvement, IDI）比较各参数预测效能。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般资料

       在61例PDAC患者中，HIF-1α低表达32例（0分9例，1分3例，2分4例，3分6例，4分10例），男21例，女11例，年龄30~75（63.85±9.99）岁；HIF-1α高表达29例（6分12例，8分3例，9分6例，12分8例），男17例，女12例，年龄46~74（59.61±11.79）岁。两组PDAC患者临床、病理资料比较见表2。HIF-1α高表达组肿瘤低分化的概率高于HIF-1α低表达组，差异具有统计学意义（P=0.031）；余两组间临床、病理资料差异均无统计学意义（P>0.05）。

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表2  HIF-1α表达与临床、病理指标的关系
Tab. 2  The relationship between HIF-1α expression and clinical, pathological indicators

2.2 两名放射科医师和病理科医师对各MRI参数值和HIF-1α免疫组化评分的一致性分析

       两名放射科医师对HIF-1α低表达组及HIF-1α高表达组患者ADC值、MD值和MK值的测量（表3）的一致性良好（ICC值均>0.75）。其次，两名病理医师对HIF-1α免疫组化评分的一致性良好（ICC值=0.826）。

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表3  MRI参数测量结果的一致性比较
Tab. 3  Comparison of consistency in measurement results of various MRI parameters

2.3 HIF-1α高表达组与HIF-1α低表达组组间各MRI参数差异性分析

       HIF-1α高表达组MD值低于低表达组[（1.17±0.26）×10^-3 mm²/s vs.（1.52±0.39）×10^-3 mm²/s]，MK值高于低表达组[（0.72±0.11）vs.（0.61±0.11）]，差异具有统计学意义（均P<0.001），两组间ADC值差异无统计学意义[（1.34±0.22）×10^-3 mm²/s vs.（1.40±0.20）×10^-3 mm²/s，P=0.230]，详见表4。

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表4  HIF-1α高表达组与HIF-1α低表达组各定量MRI参数值差异性比较结果
Tab. 4  Comparison of quantitative MRI parameters between HIF-1α high expression group and HIF-1α low expression group

2.4 不同HIF-1α表达的多因素回归分析

       将上述分析有统计学意义的因素作为自变量，HIF-1α表达作为因变量，经过多因素logistic回归分析结果显示，MD值、MK值和分化程度均为不同HIF-1α表达的独立影响因素（表5）。

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表5  HIF-1α表达logistic多因素回归分析
Tab. 5  Logistic multivariate regression analysis of HIF-1α expression

2.5 ROC曲线

       MD值、MK值和MD值联合MK值在预测HIF-1α高表达和HIF-1α低表达的AUC、敏感度、特异度分别为：0.751、74.7%、64.8%；0.814、84.4%、72.4%；0.862、82.8%、78.7%。二者联合显示出最好的预测效能。之后，我们将MD值和MK值与分化程度进行联合，其AUC、敏感度、特异度为0.872、78.1%、86.2%，具有最高的预测效能（表6及图3）。DeLong检验示MD值+MK值+分化程度的预测效能仅与MD值具有统计学差异（P=0.037），与其他参数的预测差异无统计学意义（P>0.05）（表6）。NRI和IDI结果显示MD值+MK值+分化程度联合的预测效能显著优于MD值、MK值及MD值+MK值（P<0.05）（表7）。

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图3  MD值、MK值、MD值+MK值及MD值+MK值+分化程度预测PDAC瘤内不同HIF-1α表达的ROC曲线图。MD：平均扩散系数；MK：平均扩散峰度；PDAC：胰腺导管腺癌；HIF-1α：缺氧诱导因子1α；ROC：受试者工作特征；AUC：曲线下面积；CI：置信区间。
Fig. 3  ROC curves of MD value, MK value, MD value + MK value and MD value + MK value + differentiation degree predicting different HIF-1α expression in PDAC tumors. MD: average diffusion coefficient; MK: mean diffusion kurtosis; PDAC: pancreatic ductal adenocarcinoma; HIF-1α: hypoxia-inducing factor 1α; ROC: receiver operating characteristic; AUC: area under the curve; CI: confidence interval.

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表6  各参数对不同HIF-1α表达的鉴别效能
Tab. 6  Efficiency of parameters in differentiating the expression of HIF-1α

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表7  净重新分类指数和综合判别改善指数用于各参数的比较
Tab. 7  Net reclassification improvement and integrated discrimination improvement for comparison among parameters

3 讨论

       本研究使用DKI技术对PDAC瘤内HIF-1α表达进行预测，并与DWI序列进行对比，结果发现HIF-1α低表达组中MD值高于HIF-1α高表达组，MK值低于HIF-1α高表达组，ADC值在两组之间差异无统计学意义，单参数诊断效能MK值最高；临床病理参数中，HIF-1α高表达组中肿瘤低分化比率高于HIF-1α低表达组高，MD值、MK值联合肿瘤分化程度具有最高的诊断效能。本研究首次在国内外报道DKI技术用于评估PDAC瘤内HIF-1α的表达，为术前预测HIF-1α提供了新方法。

3.1 HIF-1α表达与PDAC临床-病理特征的关系

       HIF是体内最主要的应答细胞内氧浓度降低而对多种基因表达进行调控的转录因子家族，是由氧依赖性α亚基（HIF-α）和氧非依赖性β亚基（HIF-β）组成的异源二聚体。HIF-α有三种亚型，HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α。HIF-β也称为芳香烃受体核转运蛋白（ARNT）有两种亚型，即HIF-1β和HIF-2β^{[18, 19]}，其中，HIF-1α是细胞低氧应答最重要的调控因子，负责在缺氧条件下激活转录反应^[20]。PDAC是最具典型的富含基质、血管贫乏、灌注不足的肿瘤。有观点认为，从正常的胰腺组织到胰腺上皮内瘤变再到PDAC的进展中，HIF-1α的表达水平会随之升高，且从多个角度发挥促进PDAC的发展、促进PDAC上皮间质转化的作用^{[21, 22]}。本研究发现肿瘤分化程度越低的PDAC瘤内HIF-1α表达越高，这与ABUDOUKERIMU等^[23]研究一致，可能是由于，HIF-1α和HIF-1β亚基结合后形成异源二聚体HIF-1，可结合到靶基因启动子区域的缺氧反应元件，使下游多种靶基因的转录、表达受到影响，包括细胞外基质重构、血管生成、细胞迁移、细胞侵袭、上皮-间质转化^[24]，同时，肿瘤低分化会呈现出更强的增殖和转移能力，使得肿瘤区域内的异质性更加显著，乏氧情况更明显，HIF-1α表达更高。

3.2 DWI及DKI参数预测PDAC瘤内不同HIF-1α表达的价值评估

       传统的DWI是基于活体组织内水分子随机运动的MRI技术，能够反映水分子的扩散^[25]，目前已逐渐用于评估HIF-1α在恶性肿瘤中的表达。然而，HIF-1α表达与ADC之间的相关性在不同类型的实体瘤中基本不一致^{[26, 27, 28]}。HUANG等^[27]在肝癌的研究中指出ADC值与瘤内HIF-1α水平呈正相关，缺氧可能通过早期衰老细胞收缩和衰老过程中细胞丧失导致细胞外水分子增加，从而使ADC值增加^[29]。在前列腺癌的研究中ADC值与HIF‐1α的表达呈负相关^[30]，在肿瘤生长过程中，缺氧会抑制肿瘤细胞的生长，导致细胞外水分子扩散程度减少，使ADC值降低。而在我们的研究中，ADC值与HIF-1α表达无显著相关性。造成这些不一致的结果可能是由于DWI是基于水分子布朗运动的理想状态进行成像，实际上水分子的扩散受多种细胞结构及成分（蛋白质、纤维、炎症等）限制呈非高斯扩散运动，且随着b值的升高非高斯运动越明显^{[31, 32]}，这导致仅使用低b值模型的传统DWI难以准确反映水分子的运动状态，从而不能反映细胞真实的乏氧微环境。

       DKI技术是基于非高斯分布模型的DWI衍生技术，可反映水分子在不同方向上的扩散特性，能更准确地评估组织微结构的复杂性^{[33, 34]}。本研究发现HIF-1α表达与MK值呈正相关，与MD值呈负相关，这与DUAN等^[13]和LI等^[14]利用DKI及DWI技术对小鼠纤维肉瘤、软组织肉瘤中HIF-1α表达进行预测的研究结果一致。可能的原因是，HIF-1α的稳定性和活性增加，会进一步促进血管内皮生长因子的产生，诱导血管生成，然而来自肿瘤组织的更多机械应力导致血管的厚度不均和结构变形，使它们以不规则的回旋方式表现出密集的出芽和形态各异的新生血管^{[29, 31, 35, 36]}，加剧局部结构的复杂性，而MK值与肿瘤内结构复杂性呈正相关，因此这种现象更能反映在MK值的变化上。由于MD值考虑到水分子向各个方向的扩散，因此较ADC值更准确反映PDAC中复杂成分引起的水分子的有限扩散运动^[37]，从而具有更高的HIF-1α预测效能。此外，MD值、MK值联合参数诊断效能较单一参数值预测效能升高，原因可能这是MD值和MK值从不同方面反映扩散相关的参数，对各自单一信息进行了互补。MD值、MK值联合分化程度预测HIF-1α效能最高，但较MD值、MK值诊断效能持平，提示分化程度数据的高变异性会增加噪音，降低统计效能，需加大样本量进一步统计。

3.3 局限性及展望

       本研究仍存在一些局限性：（1）是单中心回顾性研究，入组的样本量较少，可能造成选择偏倚，另外，HIF-1α高表达组与低表达组患者不均衡，可能导致结果产生混杂偏倚，之后我们会严格纳排标准并标准化数据采集流程，有效地控制偏倚，提高研究的可靠性和科学性；（2）ROC曲线是基于同一数据集构建，缺乏外部验证或交叉验证，可能导致过拟合，未来我们会在更大的多中心队列中进行模型的独立验证；（3）在绘制肿瘤ROI的过程中只选择最大截面、避开了囊变、坏死、钙化等区域，这可能不利于全面评估肿瘤特征，之后，我们会尝试多层面测量或体积分析进行更加深入的研究；（4）由于呼吸及胃肠道蠕动产生的伪影会影响DKI序列后处理图像的拟合结果，因此，ROI的选择采用在DKI后处理图像拟合好的位置进行测量取的方法；（5）未增加癌旁组织中HIF-1α的表达情况作为对比，在后续的研究中，将进一步进行研究。

4 结论

       综上所述，DKI定量参数MK及MD值均对无创预测PDAC瘤内HIF-1α分级具有较高的敏感度和特异度，尤其是MK值具有较高的预测效能，当MD值、MK值与肿瘤分化程度相结合时显示出最优的能力，这为PDAC患者临床分层诊疗提供巨大的帮助。