0 引言

       肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）是最常见的肾癌病理类型，约占肾脏恶性肿瘤的70%~90%^[1]。依据病理学分级（Fuhrman分级），ccRCC分为Ⅰ~Ⅳ四个等级，其中Ⅰ级和Ⅱ级定性为低级别癌，Ⅲ级和Ⅳ级定性为高级别癌^[2]。ccRCC在常规MRI上表现为T1加权成像（T1-weighted imaging, T1WI）等、低信号，T2加权成像（T2-weighted imaging, T2WI）高信号，扩散加权成像（diffusion-weighted imaging, DWI）为高信号，且增强后呈不均匀强化^[3]。但在其临床诊断中，因肾乏脂血管平滑肌脂肪瘤（fat-poor angiomyolipoma, fpAML）脂肪含量少，加之体积偏小，导致该良性肿瘤的常规MRI表现与ccRCC的典型改变之间难以区分^[4]。虽然鉴别不同分级ccRCC和fpAML的金标准仍基于组织病理学检查，但该技术存在侵入性、潜在的取样误差及耗时等问题^{[5, 6]}。因此，如果能够在术前利用无创的影像学检查手段来区分ccRCC分级和鉴别fpAML，将有望显著提高病变的诊断效价。

       扩散谱成像（diffusion spectrum imaging, DSI）是一种通过将扩散编码梯度整合到经典自旋回波MRI中的技术，其创新性在于能够扩展传统MRI的采样空间维度^[7]。在ccRCC的影像研究中，DWI能够映射肿瘤组织的血管、细胞及微结构改变^[8]，且基于DWI的多参数扩散模型已应用于肾脏肿瘤的诊断与鉴别中，主要包括表观扩散系数（apparent diffusion coefficient, ADC）^[9]、体素内非相干成像（intravoxel incoherent motion, IVIM）^[10]和扩散峰度成像（diffusion kurtosis imaging, DKI）^[11]等。既往的研究表明，在此基础上，研究者们将MRI图像与图像分析技术相结合，以影像组学的方式，有效地增强了ccRCC的影像指标在鉴别诊断和预测分级等方面临床应用的有效性^{[12, 13, 14]}。例如，fpAML与ccRCC的鉴别可借助ADC放射组学特征来实现^[9]。然而，鉴于既往放射组学指标与生物学特征的相关性尚不明确，导致其存在临床可解释性较低等问题^[15]。新近多项研究基于影像数据，将相似体素聚集成“生境”来分割肿瘤，实现了可解释性较高的生境成像^[16]，能够从定性角度（各生境的空间分布）和定量角度（各生境的占比）来评估肿瘤的组成。然而，融合多参数的生境成像，能否较为高效地应用于ccRCC的临床诊断中，尚亟待研究论证。据此，本研究通过整合ADC、IVIM、DKI、分数阶微积分（the fractional order calculus, FROC）等多个定量指标，依据参数所对应的细胞密度、血流灌注和组织异质性等信息，对ccRCC及fpAML进行生境分析，旨在评估基于DWI的生境成像技术在鉴别诊断不同分级ccRCC及fpAML中的价值，这种方法有望带来新的鉴别诊断指标。因此，可用来监测肿瘤组成的动态变化。这有助于提高肿瘤鉴别诊断的准确性、治疗效果评估以及组织病理学的预测能力^{[17, 18]}。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       本研究遵照《赫尔辛基宣言》，经苏北人民医院伦理委员会批准，批准文号：2021ky235，全体受试者均签署了知情同意书。前瞻性招募江苏省苏北人民医院2021年8月至2023年9月期间ccRCC及fpAML患者共59例，术前行肾脏MRI检查。其中，fpAML组15例、低级别ccRCC组（Fuhrman Ⅰ+Ⅱ级）29例、高级别ccRCC组（Fuhrman Ⅲ+Ⅳ级）15例。纳入标准：（1）手术病理结果为ccRCC或fpAML；（2）术前行常规MRI及多b值DWI检查；（3）病变为首发且单发；（4）ccRCC病灶均为无明显囊变、坏死，fpAML在常规CT上无法观察到明显的脂肪成分。排除标准：（1）无法获得组织学结果及临床资料不完整；（2）图像有明显伪影，影响诊断。

1.2 检查和诊断方法

1.2.1 扫描方法

       本研究采用联影3.0 T uMR780 MRI系统对肾脏进行扫描，配备12通道体部相控阵线圈，扫描序列及参数如下：（1）轴位T1WI，采用梯度回波序列，重复时间（repetition time, TR）3.27 ms，回波时间（echo time, TE）1.45 ms，视野（field of view, FOV）40 mm×30 mm，层厚5 mm，层间距0 mm。（2）轴位T2WI，采用快速自旋回波序列，TR 1502 ms，TE 80.08 ms，FOV 38 mm×38 mm，层厚5 mm，层间距1 mm。（3）冠状位T2WI，采用快速自旋回波序列，TR 1450 ms，TE 82.88 ms，FOV 38 mm×38 mm，层厚5 mm，层间距1 mm。（4）多b值DWI，采用单次激发自旋平面回波序列，b值分别为0、20、50、100、300、500、800、1000、1500、2000、3000 s/mm²，激励次数分别为1、1、1、1、1、1、1、2、4、4、4，TR 2500 ms，TE 87.5 ms，FOV 38 mm×30 mm，层厚5 mm，层间距1 mm。两个扩散梯度波瓣之间的间隔（∆）为27.69 ms，每个扩散梯度脉冲宽度（δ）为20.98 ms。此外，为了减少呼吸运动对图像质量的影响，本研究在多b值DWI扫描过程中采用呼吸门控触发方法。

1.2.2 数据后处理

       本研究将原始DWI图像导入后处理软件Body-Diffusion Lab（BoDiLab，成都众影医疗科技有限公司），在对不同b值图像进行配准后，计算各DWI参数。DWI数据的单指数模型ADC值是从b值为0和800 s/mm²的图像中拟合得到的。DKI、IVIM、FROC三种模型的参数，是通过应用Levenberg-Marquardt非线性拟合方法，基于不同多b值（范围从0~3000 s/mm²）扩散加权图像的信号衰减数据来计算得出的。以下方程与先前发表的文章中描述的方程相似^{[19, 20, 21]}。

       （1）DKI DWI模型采用以下方程进行数据拟合：

       其中S（0）表示没有扩散加权的信号强度，S（b）表示在特定b处的信号强度，MD为非高斯校正后的ADC，MK是反映水分子运动偏离高斯分布程度的定量指标。

       （2）IVIM DWI模型采用以下方程进行数据拟合：

       其中Dt代表真实扩散系数，反映水分子在细胞内外的扩散情况，D^*为伪扩散系数，f为灌注分数。

       （3）FROC DWI模型采用以下方程进行数据拟合：

       其中Gd是扩散梯度幅值，δ为每个扩散梯度脉冲宽度，∆为两个扩散梯度波瓣之间的间隔，D（单位为10^-3 mm²/s）是等效于常规ADC的参数，β（无量纲；0<β≤1）是与体素内组织异质性相关的空间分数阶导数，μ（单位为μm）是空间参数，与组织微观结构有关。

1.2.3 肿瘤分割

       影像学分析由一名对病理结果不知情的放射科主治医师完成（具有>5年的肾脏影像学经验）。参考T2WI图像，在DWI图像（b值=1000 s/mm²）上逐层手动勾画感兴趣区（region of interest, ROI），并参考其他MRI序列（图1），这些ROI最终构成感兴趣体积（volume of interest, VOI）。最终的VOI由具有10年以上经验的第二位放射科副主任医师验证。然后将VOI传播到相应的参数图，包括D、μ、β、MD、MK、Dt、D^*、f和ADC图。最后，得到各VOI在不同参数下的均值，进一步分析。

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图1  感兴趣区（ROI）勾画示意图。1A：男，66岁，右肾高级别透明透明细胞癌（Fuhrman Ⅳ级），病灶在T2WI上呈混杂高信号，T1WI呈低信号，Habitat Map为相应的生境图像；1B：女，49岁，右肾低级别透明细胞癌（Fuhrman Ⅱ级），病灶在T2WI上呈稍高信号，T1WI呈稍低信号，Habitat Map为相应的生境图像；1C：女，74岁，右肾乏脂血管平滑肌脂肪瘤，病灶在T2WI上呈稍高信号，T1WI呈稍低信号，Habitat Map为相应的生境图像。
Fig. 1  Region of interest (ROI) delineation schematic diagram. 1A: Male, 66-year-old, patient with high-grade clear cell renal cell carcinoma (Fuhrman grade Ⅳ) in the right kidney, the lesion exhibits heterogeneous hyperintensity on T2-weighted imaging and hypointensity on T1-weighted imaging; the Habitat Map represents the corresponding habitat imaging. 1B: Female, 49-year-old, patient with low-grade clear cell renal cell carcinoma (Fuhrman grade Ⅱ) in the right kidney, the lesion appears mildly hyperintense on T2-weighted imaging and mildly hypointense on T1-weighted imaging; the Habitat Map represents the corresponding habitat imaging. 1C: Female, 74-year-old, patient with a fat-poor angiomyolipoma in the right kidney, the lesion shows mildly hyperintense signal on T2-weighted imaging and mildly hypointense signal on T1-weighted imaging; the Habitat Map represents the corresponding habitat imaging.

1.2.4 生境分析

       为了实现数据的高效聚类分析，本研究选用了K-means算法，该算法是当前应用最广泛的聚类方法之一^[22]。在K-means算法中，输入了所有受试者肾脏肿瘤区域内里每个体素对应的D、μ、β、MD、MK、Dt、D^*、f和ADC等参数的成对数据，详细数据见表1。在应用K-means算法后，当K设置为4时，如图2所示，最大曲率点出现。所以，本研究将肾脏肿瘤划分为四个不同的生境。肘部法的核心指标是误差平方和（sum of squared errors, SSE），其公式如下：

       在聚类分析中，ci代表第i个簇，p是ci中的样本点，而mi是ci的质心（即该簇中所有样本点的平均值）。

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图2  根据平方误差总和选择的最优聚类数。
Fig. 2  The optimal cluster number selection according to sum of squared error.

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表1  4种生境的数量特征
Tab. 1  Quantitative characteristics of 4 habitats

1.3 统计学分析

       本研究使用SPSS（27.0）和MedCalc（20.0.22）软件进行数据分析。首先采用Shapiro-Wilk检验和Levene's检验对数据正态性及方差齐性进行检验。对满足正态性及方差齐性的数据采用单因素方差分析判断各组间的生境参数是否存在显著差异，当差异显著时使用LSD法对其进行事后检验比较各组生境参数间的差异。对不满足正态性或方差齐性的数据采用Kruskal-Wallis检验判断各组间的生境参数是否存在显著差异，当差异显著时使用Dunn检验对其进行事后检验比较各组生境参数间的差异。使用组内相关系数（intra-class correlation coefficient, ICC）用于计算不同放射科医生获取的参数结果一致性，ICC>0.75定义为一致性良好（表1）。使用受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线以及曲线下面积（area under the curve, AUC）评估各生境体积占比，并采用DeLong检验比较各模型间AUC的差异。使用G*Power 3.1软件评估每组受试者的最低样本量，基于效应量f=0.4，α=0.05和检验效能80%的统计学假设，最低样本量为66例，本研究最终共纳入59例。以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

       共59名患者纳入本研究，fpAML组包括15名患者（男5名，女10名，平均年龄59.40岁），低级别ccRCC组包括29名患者（男22名，女7名，平均年龄62.03岁），高级别ccRCC组包括15名患者（男12名，女3名，平均年龄59.27岁）。详见表2。

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表2  三组患者临床资料特征
Tab. 2  Clinical data characteristics of the three groups of patients

2.2 各组生境的比例和定量参数比较

       将病灶VOI分为4个亚区，生境1（P<0.001）和4（P<0.001）在鉴别三组肿瘤中存在差异，而生境2（P=0.060）和生境3（P=0.310）在fpAML及不同分级ccRCC中差异无统计学意义（表3）。此外，本项研究发现，在生境1中，低级别ccRCC的占比显著高于高级别ccRCC（P<0.01），而高级别ccRCC的占比显著高于fpAML（P<0.05）；在生境2中，fpAML显著高于高级别ccRCC（P<0.05）；在生境4中，fpAML显著的占比高于低级别（P<0.01）及高级别ccRCC（P<0.01）（表4、图3）。

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图3  柱状图显示了各生境参数在三组肿瘤的差异。***表示P＜0.01，**表示P＜0.05；fpAML：肾乏脂肪血管平滑肌脂肪瘤；ccRCC：肾透明细胞癌。
Fig. 3  The bar chart shows the differences of each habitat parameter among the three groups of tumors. *** indicates P < 0.01, ** indicates P < 0.05; fpAML: fat-poor angiomyolipoma; ccRCC: clear cell renal cell carcinoma.

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表3  各生境占比在fpAML、高低级别ccRCC组间差异比较
Tab. 3  Comparison of differences in the proportion of each habitat between fpAML and high and low-grade ccRCC

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表4  各生境占比在fpAML、高低级别ccRCC间两两比较结果
Tab. 4  The pairwise comparison results of each habitat between fpAML and high and low grade ccRCC

2.3 生境1和4的诊断效能

       fp-AML组和低级别组、fp-AML组和高级别组和低级别组和高级别组的ROC分析结果显示，生境1 [AUC=0.90，95%置信区间（confidence interval, CI）：0.77~0.97]在鉴别fp-AML和低级别ccRCC的效能优于生境4（AUC=0.84，95% CI：0.70~0.94），但生境4（AUC=0.76，95% CI：0.61~0.88）鉴别低级别和高级别ccRCC的效能高于生境1（AUC=0.73，95% CI：0.57~0.85）。生境1和4结合（AUC=0.72，95% CI：0.53~0.87）对于鉴别fp-AML和高级别ccRCC比单独运用一种生境参数效能更高。但对AUC差异的DeLong检验结果显示生境1、生境4及生境1+生境4在鉴别fpAML和不同级别透明细胞癌之间差异无统计学意义（P>0.05），具体数据可见图4、表5, 表6, 表7, 表8。

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图4  生境1、4 及联合生境1 和4 鉴别fp-AML 和不同分级ccRCC 的效能。fpAML：肾乏脂血管平滑肌脂肪瘤；ccRCC：肾透明细胞癌。
Fig. 4  The efficacy of habitat 1, habitat 4 and the combined habitat 1 and habitat 4 in differentiating fp-AML from different grades of ccRCC. fpAML: fat-poor angiomyolipoma; ccRCC: clear cell renal cell carcinoma.

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表5  生境1、4及其组合预测鉴别fp-AML和低级别ccRCC的效能
Tab. 5  Habitat 1, 4 and their combinations predict the effectiveness of identifying fp-AML and low-grade ccRCC

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表6  生境1、4及其组合预测鉴别fp-AML和高级别ccRCC的效能
Tab. 6  Habitat 1, 4 and their combinations predict the effectiveness of identifying fp-AML and high-grade ccRCC

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表7  生境1、4及其组合预测鉴别低级别和高级别ccRCC的效能
Tab. 7  Habitat 1, 4 and their combinations predict the effectiveness of identifying low and high- grade ccRCC

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表8  鉴别fp-AML和不同分级ccRCC预测模型的ROC曲线分析
Tab. 8  ROC curve analysis of prediction models for differentiating fp-AML from different grades of ccRCC

3 讨论

       本研究首次提出基于扩散谱技术的生境成像用于区分fpAML和不同分级的ccRCC。该方法为定量评估病灶的空间异质性提供了一种创新途径，实现了对具有相似特征的亚区的精准识别，并最终达到“虚拟活检”的目的。我们的研究结果表明，以低异质性、高灌注和低扩散为特征的生境1和以高度异质性、高灌注和高扩散为特征的生境4在fpAML和不同分级的ccRCC中有差异性，并且这两个生境亚区在区分fpAML和不同分级的ccRCC方面具有优越的能力。因此，本研究验证了生境成像技术在肾脏肿瘤鉴别诊断中的潜力。

3.1 DSI应用的优越性

       考虑到不同肿瘤之间的生物学行为及预后存在差距，因此从影像学视角有效鉴别不同分级ccRCC和fpAML对临床治疗方案的选择具有重要的指导作用。既往研究多集中于一种或少数几种扩散模型参数分析肿瘤的异质性，例如，ZHANG等^[23]应用IVIM及DKI结合生境分析来术前预测肝细胞癌微血管侵犯。而本研究中，我们采用ADC、IVIM、DKI、FROC等多种定量参数图进行生境分析，主要考虑到以下几个方面：首先，上述参数均源自同一高级扩散序列，具有相同的空间和时间信息，能够避免不同序列之间的错配所带来的干扰，从而获得特定成像体素的可靠配对，保证了生境分析的准确性；其次，ADC^[24]及其他三种DWI扩展模型可以提供肿瘤内部各种特征的具体生物学信息^{[25, 26, 27]}，通过多元信息可以在更高维度上对不同分级ccRCC和fpAML进行生境编码，有利于提升临床的可解释性。

3.2 生境成像技术能够量化肿瘤异质性

       既往研究已证实了生境成像技术在量化肿瘤异质性方面的价值。本研究基于扩散谱技术的生境分析结果显示，生境4可用于不同分级ccRCC和fpAML的鉴别，以高异质性、高灌注和高扩散为特征。ccRCC通常起源于肾近曲小管，其内部由紧密的巢状结构组成，导致较高的细胞密度^[28]。这种高细胞密度限制了水分子的自由扩散，在DWI中表现为扩散受限，即ADC值和MD值降低^[29]。高级别ccRCC的特征主要包括生长速度快、较大的肿瘤体积、细胞核多形性明显、较强的侵袭力以及更复杂的组织微结构^[30]。HU等^[31]研究发现，侵袭性强的直肠癌与肿瘤环境的微观结构异质性和组织复杂性相关，间接导致了更高的MK值。据此，考虑到ccRCC有更强的侵袭性，我们推测生境4的成分与肾脏肿瘤中的恶性成分更为契合。此外，ccRCC毛细血管网丰富^[32]，表现出较高的灌注特征。在IVIM模型中，D^*和f值与灌注密切相关，能反映组织血管通畅程度，且D^*和f值会随着ccRCC病理分级的增加而增加^[33]。因此，生境4中的数据参数表明组织内水分子扩散受限和血管灌注较为显著，这进一步验证了ccRCC中由于肿瘤组织增殖活跃，导致细胞密集以及结构复杂性增加和毛细血管网丰富的特征。

       fpAML是指脂肪含量低于20%的血管平滑肌脂肪瘤，主要由血管和平滑肌细胞组成^[34]。所以，在DWI中，fpAML通常表现为扩散不受限，即ADC值和MD值升高。由于fpAML肿瘤的组织异质性较低，质地较软，且缺乏恶性肿瘤的浸润性生长特征^[35]，导致相对较低的MK值。在本研究中，生境1中的D^*及f值显著增高，这可能是因为与ccRCC相比，fpAML中可能存在更丰富的曲折血管增生，这一发现与GAING等^[36]的研究结果一致。相应地，生境1被推测为肿瘤主要良性成分的区域，因其比例相似且具有相对较低的异质性、高灌注和高扩散特征。总之，我们的结果证实肾肿瘤的空间异质性，为后续虚拟活检相关研究提供了理论依据。

3.3 生境成像技术的潜在价值

       生境成像不仅能够量化肿瘤的异质性成分，达到无创分生境分析肿瘤异质性成分的效果，还能够将其应用到临床诊断工作中。最近有研究表明，将T2WI、ADC图和对比增强T1WI等多种MRI序列相结合，并在个体水平和队列水平分别进行聚类分析，构建的生境模型能够有效鉴别子宫肉瘤和非典型平滑肌瘤。通过这种方式，能够更精准地识别两种疾病，为临床诊断提供有力支持^[37]。此外，ZHANG等^[23]通过结合生境分析与扩散成像技术对肝癌的微血管浸润进行术前评估，结果显示生境分析的AUC值为0.777，表明其具有较好的诊断效能。本研究将生境分析应用于鉴别不同等级的ccRCC与fpAML，结果表明AUC可达0.90，这进一步证实了生境分析在临床诊断中的价值。

3.4 局限性

       本研究尚存在以下不足：首先，我们这项初步研究的样本量相对较少，这可能会对统计结果造成一定的偏倚，未来还需更为丰富的样本量来验证我们的初步结论；其次，本研究中ROI勾画采用双盲法勾画，但仍存在手工误差，亟需后续自动勾画算法来进一步提升ROI的精确性；再次，虽然本研究从微观结构的视角分析ccRCC和fpAML的异质性，但需要结合其他的序列，从更多方面准确解释其病理变化，如连续时间随机游走模型和拉伸指数模型；最后，本研究为单中心研究，一定程度上降低了研究结论的普适性，未来研究可通过在多中心进行外部验证来提升我们结论的可信度。

4 结论

       本研究初步揭示了不同分级的ccRCC和fpAML在微结构上表现出异质性变化，包括不同组别间的生境差异以及诊断效能。本研究结果表明，生境成像技术在识别ccRCC与fpAML的微结构异常方面具有显著潜力，该技术可为肾脏肿瘤患者的临床分级、个体化治疗方案制订及预后评估提供重要的影像学依据。