0 引言

       阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种进行性认知功能障碍和行为损害为特征的神经退行性疾病，亦是最常见的痴呆类型^{[1, 2]}，占所有痴呆症病例的60%~80%^[3]。目前，全球有超过5000万人患有痴呆症，预计到2050年，这一数字将达到约1.39亿^{[4, 5]}, 对患者家庭、社会乃至整个医疗保健系统构成了沉重的经济负担。然而，当下尚无有效预防或治愈AD的方法，医学界普遍认为在AD前驱期进行诊断与干预是关键策略。目前，业界已经探索了一系列治疗AD的策略^[6]，针刺疗法凭借显著疗效与较小副作用脱颖而出，已被广泛应用于治疗神经退行性疾病^[7]。根据中医理论，穴位选择对针刺治疗至关重要^[8]。合谷（LI4）、太冲（LIV3）构成的“四关”穴，具有疏肝解郁、安神定志、开窍醒神之功^{[9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]}，以往研究已证实针刺“四关”穴能有效改善AD症状^[18]。但与西药治疗不同，针刺“四关”穴从调节神经网络入手，展现独特治疗机制，其潜在神经机制仍待深入挖掘。既往研究表明，针刺“四关”穴可以调节皮层及皮层下核团的功能活动和脑网络，如默认网络（default mode network, DMN）、海马功能网络、额顶叶网络和感觉运动网络^[19]，提示针刺治疗后大脑可塑性的益处。

       海马（hippocampus, HPC）作为AD病理研究的关键脑区，其分为HPC前部（或腹侧，anterior HPC, aHPC）和HPC后部（或背部，posterior HPC, pHPC）^{[20, 21, 22]}。影像学研究证实了不同海马亚区在AD病理过程中受到的影响各异^{[23, 24]}，其异质性特征明显。此外，最新研究表明HPC相关的功能连接与皮层tau蛋白积聚有关，进而在AD相关的记忆功能损伤过程中发挥关键作用^[25]。既往针刺治疗AD的影像学研究多将HPC作为整体^[26]，缺乏对亚区层面的精细化探究，限制了对针刺作用机制的全面理解。鉴于HPC亚区在AD病理进展中的关键作用，深入研究针刺“四关”穴对其功能连接的调节意义重大。因此，本研究聚焦针刺“四关”穴对AD患者HPC亚区功能连接的调节作用。首先基于100例老年人的数据集，探索不同海马亚区的功能连接网络，并比较AD患者和正常对照组针刺的交互效应。假设针刺“四关”穴对 AD 患者与正常对照的 HPC 亚区功能连接网络存在不同的调节效果，力求填补现有研究空白，为针刺治疗 AD 的临床应用提供理论依据，助力探索更精准、有效的 AD 治疗策略。

1 材料与方法

1.1 研究对象及方法

       本研究遵守《赫尔辛基宣言》，经航天中心医院伦理委员会批准，全体受试者均签署了知情同意书，批准文号：京航医伦审2022第（008）号。

1.1.1 健康老年人数据采集

       本研究中招募的健康老年人主要来自北京海淀区永定路街道及田村街道社区。在招募过程中，严格筛选了招募对象，确保其符合健康老年人的定义，纳入标准：60~80岁之间，在生理和心理上相对稳定；认知正常，客观认知量表检查无异常；受教育年限≥8年，教育程度涵盖小学至高等教育；无心、肝、肾、肺等严重躯体疾病，血压、血糖、血脂等生理指标在正常范围内，无重大神经系统疾病史及精神疾病病史；无严重的听力或视力障碍。排除标准：头部创伤或颅脑手术史、神经或精神疾病史、MRI的任何禁忌证。最终本研究招募了100名健康老年人，受试者的数据采集时间为2023年1月至2024年10月。

       影像图像由德国SIEMENS TrioTim 3 T磁共振仪采集完成，高分辨率的T1结构像采用的序列为3D磁化准备快速梯度回波（magnetization-prepared rapid gradient echo, MPRAGE）序列，采集参数为：TR 2530 ms，TE 2.98 ms，TI 1100 ms，FA 7°，体素大小0.5 mm×0.5 mm×1.0 mm。静息态数据采集使用的序列为T2^*加权的平面回波成像（echo planar imaging, EPI），采集参数为：TR 2000 ms，TE 30 ms，FA 90°，体素大小2 mm×2 mm×2 mm，采集层数为62层，共计240个时间点。采集期间要求被试静卧，睁开眼睛，保证身体静止。场图数据采集使用双回波梯度回波序列，采集参数为：TR 620 ms，TE 4.92 ms/7.38 ms，FA 60°，体素大小2 mm×2 mm×2 mm，采集层数为62层。采集期间要求被试静卧，睁开眼睛，保证身体静止。

1.1.2 针刺组数据采集

       本研究AD患者来源于航天中心医院，正常对照（normal control, NC）组被试来源于医院周边社区。受试者的数据采集时间于2023年1月至2024年10月。根据纳入和排除标准进行筛查AD。AD的诊断依据为《精神障碍诊断与统计手册（第5版）》[Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-Ⅴ(DSM-Ⅴ)]中关于AD型痴呆的标准以及美国国家衰老研究所和阿尔茨海默病协会关于AD诊断指南的标准^[27]。NC组入组标准为：常规头颅MRI检查无异常发现；无神经和精神疾病病史；无记忆障碍或认知能力下降等主诉；简易精神状态检查量表（Mini-Mental State Examination, MMSE）总分≥28分。所有受试者的排除标准：（1）头部创伤或颅脑手术引起的认知障碍；（2）可能导致认知障碍的神经或精神疾病史；（3）MRI禁忌证。采用公式n=2×（Zα/2+Zβ/2）²/（δ²/σ²）对AD组和NC组进行样本量估算，其中Zα/2对应检验水准α=0.05时的1.96，Zβ/2对应检验功效1-β=0.8时的1.28。σ代表总体标准差，δ代表允许误差。

       所有受试者均接受了认知评估，其中，临床痴呆评分（Clinical Dementia Rating, CDR）、MMSE和蒙特利尔认知评估（Montreal Cognitive Assessment, MoCA）作为筛查量表，记忆功能则基于听觉言语学习测试（Auditory Verbal Learning Test, AVLT）^[28]进行了测量，所有人口统计学和神经心理学评估结果如表1所示。

       高分辨率的T1结构像采用的序列为3D MPRAGE，采集参数为：TR 1900 ms，TE 2.2 ms，TI 900 ms，FA 9°，体素大小1 mm×1 mm×1 mm。静息态数据采集使用的序列为EPI，采集参数为：TR 3000 ms，TE 30 ms，FA 90°，体素大小3.75 mm×3.75 mm×3.00 mm，采集层数为43层。基线静息态fMRI数据在最初的3分钟采集，接下来的3分钟内，所有受试者接受双侧太冲（LIV3，位于左右脚背）和合谷（LI4，位于左右手背）穴位的针刺，待针刺结束后，另采集10分钟的静息态fMRI数据。

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表1  被试人口学和神经心理学量表结果
Tab. 1  Demographic and neuropsychological assessments of participants

1.2 图像预处理

       静息态图像预处理采用的软件为SPM12和CONN-fMRI v22a工具包^[29]。具体而言，前10个数据点由于信号不稳定被去除，剩余的数据进行了时间校正和空间校正。基于头动，平动超过2.5 mm和转动超过2.5°的数据被剔除（1名AD患者基于此原因被排除）。对于健康老年人组及针刺组的数据，应用场图校正来改善扫描仪内磁场不均匀性引起的失真。幅度图像和相位图像用于磁化率失真校正，基于校正结果对所有功能图像进行沿相位编码方向的重采样，以此来弥补失真的图像。静息态数据接着基于T1图像进行空间标准化，为了避免平滑导致的信号模糊，进而产生假阳性结果，未平滑的数据用于后的分析。此外，数据还去除了白质和脑脊液信号的干扰，并进行了去线性漂移和滤波。

1.3 感兴趣区域的定义

       基于概率图谱对本研究关注的海马亚区进行了感兴趣区域（region of interest, ROI）的定义。双侧aHPC和pHPC基于Brainnetome图谱进行提取^[30]，根据该图谱，具体定义双侧aHPC和pHPC的ROIs位置有50%的概率位于对应区域内，具体的ROIs示意如图1所示。

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图1  基于图谱获取的感兴趣区。aHPC：海马前部；pHPC：海马后部。
Fig. 1  Illustration of ROIs which were obtained based on probabilistic atlas. aHPC: anterior hippocampus; pHPC: posterior hippocampus.

1.4 功能连接分析

       在数据预处理后，基于海马亚区的功能连接分析被用于刻画aHPC和pHPC的功能连接模式。首先，由aHPC和pHPC与全脑体素的Pearson连接系数生成了各自的偏相关图。接着，为提高相关分布的正态性，使用Fisher的r-to-Z变换将每个相关图转换为Z值图。之后，为了生成可靠稳定的aHPC和pHPC功能连接网络，对100名健康老年人的aHPC和pHPC功能连接图分别进行单样本t检验，显著性水平设置为FWE校正后P<0.05为差异具有统计学意义。aHPC和pHPC功能连接的显著结果随后被保存用于后续组分析的掩模。

       为了确定针刺“四关”穴对AD组和NC组海马亚区功能连接的影响，体素水平的2×2双因素重复测量方差分析被用于检验四组被试[具体为针刺治疗前AD组（Pre_AD）、针刺治疗前NC组（Pre_NC）、针刺治疗后AD组（Post_AD）和针刺治疗后NC组（Post_NC）]海马亚区功能连接的差异。上述得到的aHPC和pHPC掩模被用于限定显著结果的范围。我们首先关注组间的交互效应，一旦交互效应显著，则使用事后独立的双样本t检验来比较所有简单效应。

1.5 统计分析

       独立样本t检验和双尾卡方检验用于比较AD和NC组之间的人口统计学特征和神经心理评分，使用的软件为SPSS 22.0版本。

       在排除年龄、受教育年限、头动和总颅内容积的影响后，使用上述提到的海马亚区掩模，基于双因素重复测量方差分析确定两组针刺治疗前后的交互作用。交互作用采用的阈值为体素水平P<0.05，高斯随机场（Gaussian random field, GRF）校正后P<0.05为差异具有统计学意义。此外，为了探索功能连接改变和认知表现的关系，我们还基于Pearson相关分析，探讨针刺治疗前AD患者的行为数据与海马亚区功能连接的关系，显著性水平设定为P<0.05。

2 结果

2.1 人口统计学数据和神经心理学评估

       本研究根据样本量估算方法n=2×（1.96+1.28）²/[（11.07-2.64）²/6.28²]，计算出两组预估样本量为11.7，最终本研究共纳入28例受试者，其中AD组14例，NC组14例。人口学和神经心理学评估结果见表1。AD组和NC组的受试者在年龄、性别和受教育年限方面差异无统计学意义（P>0.05）。与NC组相比，AD组的MMSE、MoCA、CDR、AVLT以及AVLT分量表[包括即时回忆（AVLT immediate recall, AVLT_IR）、延迟回忆（AVLT delayed recall, AVLD_DR）和再认]得分均显著降低（P<0.001）。

2.2 海马亚区功能连接网络结果

       为了生成可靠的海马亚区功能连接网络，我们基于100名健康老年人的aHPC和pHPC相关图获得了双侧aHPC和pHPC的各自功能连接模式。双侧aHPC和pHPC均显示出与多个大脑皮层将皮层下区域的显著正连接（FWE校正，P<0.05），具体包括后扣带回、楔前叶、内侧前额叶、外侧顶叶、外侧颞叶和海马结构，这复制了DMN的经典连接网络（图2）。

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图2  100例健康老年人双侧HPC亚区的功能连接模式。aHPC_L：左侧海马前部；aHPC_R：右侧海马前部；pHPC_L：左侧海马后部；pHPC_R：右侧海马后部。
Fig. 2  The one-sample t test of functional connectivity patterns of bilateral aHPC and pHPC in 100 healthy participants. aHPC_L: left anterior hippocampus; aHPC_R: right anterior hippocampus; pHPC_L: left posterior hippocampus; pHPC_R: right posterior hippocampus.

2.3 针刺“四关”穴对AD和NC组海马亚区功能连接的影响

       AD和NC组针刺前后的海马亚区功能连接差异见图3，方差分析显示2组海马亚区功能连接在针刺前后存在显著的交互效应。比较针刺前后状态时，仅在NC组中发现双侧aHPC与右侧内侧额叶皮质（medial frontal cortex, MFC）在针刺后功能连接显著增强（图3 A1a~A1b、B1a~B1b和表2），而右侧pHPC与右侧PHG在针刺后功能连接显著降低（图3 C3a~C3b和表2），但在AD组中上述脑区间功能连接在针刺前后无显著差异（图3 A1a~A1b、B1a~B1b、C3a~C3b）。另外，事后成对比较表明，与针刺前相比，针刺后的AD组多个脑区之间的功能连接显著增强，具体包括右侧aHPC与左侧眶额叶皮质（orbitofrontal cortex, OFC）、右侧aHPC与右侧海马旁回（parahippocampal gyrus, PHG）、右侧pHPC与右侧颞上回（superior temporal gyrus, STG）以及侧pHPC与右侧岛叶，而与之相反，针刺后的NC组在上述区域间的功能连接却较针刺前显著下降（图3 B2a~B2b、B3a~B3b、C2a~C2b、C4a~C4b和表2）；另外，与针刺前相比，针刺后的AD组右侧pHPC与右侧额上回（superior frontal gyrus, SFG）之间的功能连接显著下降，而针刺后的NC组在上述2个脑区间的功能连接却较针刺前显著增强（图3 C1a~C1b和表2）。

       此外，针刺治疗前AD组在多个区域间的功能连接显著低于NC组，具体包括右侧aHPC与左侧OFC、右侧aHPC与右侧PHG、右侧pHPC与右侧STG以及右侧pHPC与右侧岛叶，但AD组在右侧aHPC与右侧MFC以及右侧pHPC与右侧SFG之间的功能连接却显著高于NC组（图3）；针刺治疗后，AD组在左侧aHPC与右侧MFC以及右侧aHPC与右侧SFG之间的功能连接显著低于NC组，但在右侧pHPC与右侧STG以及右侧pHPC与右侧PHG之间的功能连接显著高于NC组（图3）。

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图3  AD和NC组针刺前后海马亚区功能连接的变化。***表示P<0.001；**表示P<0.01；*表示P<0.05。aHPC_L：左侧海马前部；aHPC_R：右侧海马前部；pHPC_R：右侧海马后部；MFC：内侧额叶皮质；OFC：眶额叶皮质；PHG：海马旁回；SFG：额上回；STG：颞上回；AD：阿尔茨海默病；NC：正常对照。
Fig. 3  The effect of acupuncture on bilateral aHPC and pHPC connectivity in the AD and NC groups as revealed by atlas-based ROI analysis. ***: P < 0.001; **: P < 0.01; *: P < 0.05. aHPC_L: left anterior hippocampus; aHPC_R: right anterior hippocampus; pHPC_R: right posterior hippocampus; MFC: medial frontal cortex; OFC: orbitofrontal cortex; PHG: parahippocampal gyrus; SFG: superior frontal gyrus; STG: superior temporal gyrus; AD: Alzheimer's disease; NC: normal controls.

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表2  针刺“四关”穴引起的双侧海马亚区功能连接的变化
Tab. 2  Altered bilateral aHPC and pHPC functional connectivity by acupuncture stimulation of Si Guan points

2.4 AD组功能连接与认知能力的相关性

       基于针刺治疗前的数据，对AD组的海马亚区相关功能连接与神经心理量表得分进行了Pearson相关分析。显著结果见图4。右侧aHPC与左侧OFC之间的连接强度与AVLT_DR评分（r=0.70，P=0.016）呈正相关。

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图4  针刺前AD组海马亚区功能连接与神经心理量表的Pearson相关分析结果。aHPC_R：右侧海马前部；OFC：眶额叶皮质；AD：阿尔茨海默病；AVLT_DR：听觉言语学习测试延迟回忆。
Fig. 4  Pearson correlation analysis between the hippocampal subregions connectivity and neuropsychological scales in the AD group before acupuncture treatment. aHPC_R: right anterior hippocampus; OFC: orbitofrontal cortex; AD: Alzheimer's disease; AVLT_DR: auditory verbal learning test delayed recall.

3 讨论

       在本研究中，我们首先基于图谱生成了不同海马亚区的可靠功能连接模式，并用于评估针刺“四关”穴对AD患者和正常对照海马亚区功能连接的即刻效应。一些有趣的结果值得我们关注。首先，基于海马亚区的ROIs，我们复现了经典的默认网络模式；其次，在AD组和NC组中，针刺“四关”穴后，海马亚区和多个脑区的功能连接呈现显著的增强或减弱，这反映了针刺的双向调节作用。更有趣的是，对于AD患者和正常对照，针刺“四关”穴调节海马亚区的功能连接呈现出相反的效应；再次，针刺治疗前，AD组中海马亚区的功能连接与神经心理量表评分呈正相关。上述发现对于理解针刺“四关”穴调节AD患者海马亚区的功能连接至关重要。

3.1 针刺对海马亚区功能连接的非特异调节作用

       根据既往研究，针刺具有双向和有益的调节能力，可辅助身体从病理状态恢复至正常的生理状态^{[31, 32]}，其调节方向取决于身体的功能状态。我们的主要发现与这一理论一致，具体表现为针刺“四关”穴后，AD患者和正常对照的海马亚区功能连接呈现相反的变化模式。大量研究表明，AD患者大脑功能网络中同时存在功能失连接和功能代偿机制^[33]。与这些发现一致，本研究结果也显示，与针刺治疗前的NC组相比，治疗前的AD组海马亚区与多个区域间的功能连接显著降低，如OFC、PHG、STG以及岛叶，可能意味着患者在将海马的记忆信息整合到决策和情感反应过程中出现障碍，导致其决策能力下降、情感调节异常；同时，治疗前的AD组海马亚区也与多个区域间的功能连接显著增强，如MFC以及SFG，可能是大脑在试图代偿海马功能受损的一种表现，即通过加强与额叶皮层的联系，努力维持认知功能的稳定，然而，这种代偿机制可能随着疾病的进展逐渐失效。

       针刺“四关”穴后，两组的海马亚区与上述多个脑区（如OFC、PHG、SFG、STG以及岛叶）间功能连接均被针刺所调节，且调节的方向是相反的。对于AD患者，由于疾病的影响，上述被调节的功能连接或处于失连接状态或由于功能补偿处于过度增强状态，针刺可以改善脑区间的功能失连接亦可以抑制过度增强的功能连接。对于NC而言，针刺同样可以增强或抑制上述海马亚区的功能连接，这反映了针刺可以调控参与中枢整合、镇痛和情感处理的大规模功能网络^[34]。我们的相关性结果也支持这一观点，即海马前部与OFC之间的功能连接受损与AD患者的记忆功能减弱有关，在针刺调节后，失连接的状态得到了改善，这可能体现了针刺的良性调节作用，可使AD患者的受损功能状态得到恢复。总体而言，AD患者和正常对照均可以从针刺“四关”穴的非特异调节作用中受益，以达到机体的内稳态。

3.2 针刺对海马亚区功能连接的特异调节作用

       除了针刺对海马亚区功能连接的非特异调节作用，我们还检测到针刺“四关”穴对海马亚区功能连接的特异性调节。具体而言，在针刺治疗后，仅在NC中发现了海马前部和MFC之间的功能连接增强，针刺“四关”穴可能调节了与认知和记忆密切相关的神经递质系统，如乙酰胆碱（Ach），AD患者大脑中Ach水平降低，而针刺可能通过激活胆碱能神经元，增加乙酰胆碱的合成和释放，从而增强海马与相关脑区的功能连接，改善认知功能；针刺还可能激活了多种细胞信号通路，如PI3K/Akt通路、MAPK通路等，这些通路在神经元存活、突触可塑性等方面发挥重要作用，在AD患者中，这些通路的激活可能有助于减轻神经元损伤、促进神经元修复，从而改善海马亚区功能连接。两个区域在很多心理过程中起着关键作用，包括认知控制、情绪、疼痛和社会认知^[35]，且是大脑默认网络中的关键节点，这也进一步反映了针刺对机体自稳态的调节，能够影响个体的高级认知功能。

       更值得关注的是，目前的研究结果表明，针刺“四关”穴引起了AD组海马亚区和PHG之间功能连接的增强，AD患者通常存在乙酰胆碱水平降低的情况，而海马和PHG区域都存在丰富的胆碱能神经纤维，针刺“四关”穴可能通过激活胆碱能神经元，促进乙酰胆碱的合成与释放，增加海马亚区与PHG之间的乙酰胆碱浓度，从而增强两者之间的功能连接；PHG作为与海马密切相关的一个区域，在这个环路中也发挥着重要作用。针刺“四关”穴可能通过调节Papez环路中相关结构的功能活动，促进海马亚区与PHG之间的神经信号传递，修复受损的神经环路，从而增强功能连接。众所周知，HPC和PHG对情景记忆至关重要，最容易受到AD病理的影响^[36]。先前的研究也表明，针刺治疗后海马功能连接增加，且助于改善认知，因此，针刺“四关”穴可能会激活AD患者的大脑补偿机制，增强HPC和PHG之间的信息流动，从而改善AD患者的记忆功能。总之，所有结果都表明，针刺“四关”穴可以对两组海马亚区功能连接产生非特异和特异的调节作用，这种调节可能是针刺刺激穴位后引发的广泛性神经反应，为大脑提供了一种整体性的保护和调节效应，有助于提升大脑的功能储备和适应能力。

3.3 局限性

       本研究存在一定的局限性：（1）本研究中未包含假针刺组，无法确定针刺“四关”穴对海马亚区功能连接的调节作用是否与刺激本身相关，这可能使我们高估了针刺的特异性效果，影响对针刺治疗机制的准确理解，在后续研究中增加假针刺组，作为对照组与真实针刺组进行比较；（2）本研究的样本量相对较小，小样本量可能限制了研究结果的统计效力，增加了Ⅱ类错误的风险，使得一些实际存在的效应可能未被检测到，进而影响研究结论的普适性，未来研究将增加样本量，以提高统计效力，可参考既往类似研究的效应量，使用样本量计算公式来确定合适的样本数量；（3）本研究在种子点选择上仍存在局限性，仅关注海马亚区可能限制了对阿尔茨海默病全脑网络异常的全面理解，使得我们可能忽略了针刺“四关”穴对其他重要脑区的潜在影响，从而无法完整揭示针刺治疗的神经机制，未来研究还可选择其他与阿尔茨海默病密切相关的脑区作为种子点，或者采用多模态成像技术结合机器学习算法，更系统地描绘针刺治疗引起的复杂脑网络变化；（4）本研究侧重于针刺的即刻效应，无法确定针刺“四关”穴是否对AD患者产生长期的治疗效果，这限制了对针刺治疗AD的全面评价，未来开展纵向研究，对AD患者进行长期随访，评估针刺在不同治疗时间点（如短期1个月、中期6个月、长期12个月及以上）对患者认知功能和大脑功能网络的影响；（5）基于目前的共识，早期发现和干预是预防AD发展的关键，本研究未探索针刺在AD早期阶段（如遗忘性轻度认知障碍）的潜在治疗效果，无法确定针刺在AD早期干预中的作用，因此，未来的纵向研究有必要探索针刺遗忘性轻度认知障碍的疗效评价。

4 结论

       总之，本研究结果表明针刺“四关”穴对AD患者和正常对照的海马亚区功能连接具有特异和非特异的调节作用。这些发现可能加深我们对于针刺双向、良性调节机制的理解，针刺“四关”穴可能是未来治疗AD的一种潜在的补充疗法。