0 引言

       肝外胆管癌（extrahepatic cholangiocarcinoma, ECCA）是起源于左右肝管汇合部至胆总管下端的恶性肿瘤，通常分为肝门部胆管癌及远端胆管癌，两者分别约占所有胆管癌的50%~60%、20%~30%^{[1, 2]}。ECCA发病率和死亡率一直在增加，严重威胁人类健康^[3]。根治性手术切除是可能治愈胆管癌的唯一有效手段^{[4, 5]}，依赖于病变局部穿刺活检或肿瘤根治术的病理分级是判断病变侵袭性和疾病预后最可靠的因素^{[6, 7]}。在肿瘤研究中，病理性血管新生数量的增加表明肿瘤组织的侵袭和转移能力进一步增强^{[8, 9, 10]}。目前临床评价肿瘤新生血管的重要手段是病理标本经染色后测定微血管密度（micro vascular density, MVD）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）^{[11, 12, 13]}。由于患者接受度低导致在临床实践中ECCA病变侵袭性和疾病预后的评估仍是难点，因此无创性地评估ECCA的侵袭性及预后是临床所迫切需要的。

       动态对比增强磁共振成像（dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging, DCE-MRI）不仅能对实质脏器进行观察，还可监测对比剂在血管与肿瘤组织间的动态传输，通过多期图像获取的定量灌注参数，包括容积转移常数（volume transport constant, K^trans）、血管外细胞外间隙容积比（extravascular extracellular volume fraction, Ve）、速率常数（rate constant, Kep），从微循环层面定量分析对比剂在肿瘤组织的动态分布。MEYER等^[14]、张蕊等^[15]研究动脉期、门脉期、肝胆期的MRI信号强度量化方式与胆管癌的关系，但关于ECCA患者定量灌注参数的研究极少。基于此，本研究观察ECCA患者的定量灌注参数K^trans、Kep、Ve值，分析其与ECCA病理分化程度及血管生成的相关性，探讨运用非侵入式检查手段评估病灶分子病理特征的可行性，以期为临床制订个体化治疗方案提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       纳入2020年01月至2024年12月在兰州市第二人民医院收治的50例ECCA患者。术后标本根据Steiner分类系统进行病理评估，将ECCA患者分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级，即高分化、中分化、低分化，如果同一病理组织存在不同程度的分化，则以主要的分化程度作为代表。

       纳入标准：（1）具有病理结果且诊断为ECCA的患者；（2）有免疫组织化学染色VEGF的表达量及抗原簇34（cluster of differentiation 34, CD34）染色测定MVD的结果；（3）行术前DCE-MRI检查。排除标准：（1）合并其他肿瘤；（2）对比剂过敏致检查中断者；（3）肝肾功能严重受损；（4）影像图像质量无法进行分析测定者。

       本研究严格遵守《赫尔辛基宣言》的伦理原则，经兰州市第二人民医院医学伦理委员会同意，免除受试者知情同意，批准文号：lzsdermyyxllwyh202018。

1.2 DCE-MRI检查

       采用SIEMENS Prisma 3.0 T MRI（西门子医疗，德国）进行上腹部检查。检查前告知患者禁食、禁水4 h；按要求摘除身上的金属物品；指导患者仰卧于检查床，并训练患者跟随指令控制呼吸，告知患者检查过程中需要保持静止。对比剂使用钆喷酸葡胺注射液（商品名：莫迪司，上海博莱科信谊药业有限责任公司），药物浓度为529 mg/mL。MRI常规扫描参数及DCE-MRI扫描流程详见表1。常规平扫完成后行DCE-MRI扫描，扫描流程详见图1，其中每期扫描包括憋气口令6秒、单期扫描4秒、期相间休息5秒。结束后检查图像，保证图像清晰、符合诊断需求。

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图1  DCE-MRI扫描流程图。
Fig. 1  Flowchart of DCE-MRI scan.

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表1  MRI常规扫描参数
Tab. 1  Conventional MRI scanning parameters

1.3 图像数据采集及处理

       由具有10年诊断经验的中级职称和18年诊断经验的高级职称医师（未接触病例病理资料）对原始影像进行筛选。将病例数据导入Omni-Kinetics 2.0软件（GE药业，中国）进行处理，具体流程包括：首先应用配准算法消除运动伪影，随后基于双室扩展Tofts药代动力学模型建立数学分析框架。动静脉输入函数分别选取腹主动脉及门静脉主干勾画感兴趣区（region of interest, ROI），勾画直径约5~8 mm²的圆形ROI区域后系统自动生成对比剂时间-信号强度曲线，曲线拟合后最终输出包括K^trans、Kep、Ve等参数的伪彩色分布图。为确保测量准确性，依然由以上两位医师分别进行ROI勾画，避开血管断面及伪影干扰各自标记2个标准测量点，各参数最终取4次测量值的算术平均数作为分析依据。

1.4 MVD及VEGF测定

       所有病理切片由固定包埋组织得到，经抗原修复、封闭后，使用抗VEGF和抗CD34抗体（用于MVD计数）进行病理读片。由不知样本分组的2名分别具有5年及10年以上工作经验的病理医师对病理标本进行诊断，如有差异经讨论达成一致意见。

       MVD测定：血管内皮细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性判定标准。计数需先在光学显微镜低倍视野（×40，×100）观察整个组织切片染成棕黄色的条带状和间隙状的结构并选取三个血管密度最高的区域，再于高倍显微镜视野（×200）计数这三个区域的染色微血管，其数量平均值即为MVD的最终结果值。

       VEGF测定：细胞质内观察到棕黄色颗粒被视为VEGF阳性表达的判断标准。全片经低倍镜（×40，×100）初扫定位阳性热点区域，切换高倍镜（×200）观察3个阳性细胞分布密集的视野，以平均数为最终值进行阳性细胞与总细胞计数，计算阳性率。表达强度分级：阴性（无阳性细胞）、低表达（阳性率<25%）、中度表达（25%~50%）、高表达（>50%）。

1.5 统计学方法

       采用SPSS 27.0软件进行数据处理，符合正态分布且方差齐的计量资料用均数±标准差（x¯±s）表示，不符合正态分布的数据用中位数和上下四分位数M（P25，P75）表示，计数资料采用频率n表示。计数资料组间比较采用Mann-Whitney U检验，计量资料组间比较采用单因素方差分析、Kruskal-Wallis H检验；采用Spearman检验分析计量资料与病理分化程度的组间相关性。P<0.05为数据差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

       不同分化级别的ECCA患者的性别、年龄进行组间比较，差异无统计学意义（P>0.05），详见表2。高倍视野下VEGF无表达21例，低表达15例，中表达14例，未检测到高表达病例。50例ECCA患者标本组织的MVD为53（50，63），在各分化组MVD的差异具有统计学意义（P<0.05）。病理及影像图见图2。

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图2  男，45岁，肝外胆管癌，中分化。2A：冠状位T2WI；2B：轴位T1WI增强图像病灶强化较明显；2C：MRCP示胆总管内充盈缺损伴此水平以上肝内外胆管明显扩张；2D：微血管较丰富；2E：VEGF呈低表达。MRCP：磁共振胰胆管成像；VEGF：血管内皮生长因子。
Fig. 2  Male, 45 years old, extrahepatic cholangiocarcinoma, moderately differentiated. 2A: Coronal T2WI; 2B: The lesion enhancement in the axial T1WI enhanced image is relatively obvious; 2C: MRCP shows filling defect in the common bile duct accompanied by significant dilation of the intrahepatic and extrahepatic bile ducts above this level; 2D: The microvessels are relatively abundant; 2E: VEGF is expressed at a low level. MRCP: magnetic resonance cholangiopancreatography; VEGF: vascular endothelial growth factor.

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表2  不同病理分化程度患者一般资料比较
Tab. 2  Comparison of general data of patients with different pathological grades

2.2 病灶DCE-MRI定量参数与病理分化程度的相关性

       50例不同分化级别的ECCA病灶的K^trans、Kep、Ve值与分化程度无相关性（P>0.05），详见表3。

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表3  DCE-MRI参数与病理分化程度的相关性
Tab. 3  The correlation between DCE-MRI parameters and pathological grades

2.3 病灶的定量参数与VEGF表达量及MVD的相关性

       50例ECCA患者的K^trans、Kep、Ve值与VEGF表达量均无相关性（P>0.05）；Kep值、Ve值与MVD值差异均无统计学意义（P>0.05）；K^trans值与MVD值呈正相关（r=0.524，P<0.001），详见表4。

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表4  DCE-MRI参数与VEGF表达及MVD的相关性
Tab. 4  The correlation between DCE-MRI parameters and VEGF, MVD

3 讨论

       既往研究中，DCE-MRI定量参数研究多在乳腺癌、前列腺的病理分级与血管生成^{[16, 17]}。本研究以50例ECCA患者为对象，通过DCE-MRI定量参数分析方法，探究了ECCA患者微循环参数（K^trans、Kep、Ve）与肿瘤分化程度、血管生成标志物（MVD、VEGF）的关系，利用相关性分析揭示其对ECCA侵袭性及预后的预测价值。结果显示，ECCA患者的K^trans值与MVD值呈正相关；K^trans、Kep、Ve值与分化程度、VEGF表达量无相关性。本研究表明，在无创性评估ECCA患者病灶侵袭性及预后方面，肿瘤K^trans值具有一定的潜能。

3.1 DCE-MRI参数

       DCE-MRI是一种在采集T1加权图像的时间序列之前或期间，将示踪剂或对比剂注射到血流中，测量目标组织的体积元件（体素）中MR信号强度变化的成像技术，通过药代动力学模型将信号变化转换为对比剂浓度，可量化组织的血流动力学特征（如血管通透性、血流量、血管外细胞外间隙容积）^[18]。DCE-MRI的转运模型基于描述组织和血管中对比剂浓度的线性常微分方程的隔室模型^[19]。肝脏因兼具肝动脉与门静脉双重供血系统，其血流动力学建模需采用双输入血管函数，能准确量化病理生理状态下的微循环变化。双室扩展Tofts模型将血浆室、血管外细胞间隙看作两个独立间隙，测量两室之间的血流动力学参数。定量灌注参数的含义如下：Ve量化肿瘤组织中血管外细胞外区域的空间占比，即该间隙在肿瘤总体积中的比例；K^trans是指对比剂从血管间隙经内皮渗透至肿瘤间质的速率；Kep为对比剂从外细胞外空间返回至血管内的反向转运参数，即对比剂的廓清。

3.2 DCE-MRI参数与分化程度的表达关系

       分化程度是病理学评估肿瘤恶性程度的核心指标，反映癌细胞与正常胆管上皮细胞的形态和功能相似性。本研究结果显示K^trans、Kep、Ve值与分化程度无相关性，与本结果不同的是通过影像组学的方式能较好预测ECCA的分化程度^[20]。这可能与ECCA患者的DCE-MRI参数主要由间质纤维化程度和血管受压状态驱动反映血流动力学，而分化程度反映细胞形态学，细胞形态学对肿瘤的影响关系可能在血流动力学中显现不敏感有关。其内在的分子机制值得学者通过基础实验进行深入探索与验证。此外，组织学上绝大多数肝门部胆管癌和远端胆管癌是产生黏蛋白的肿瘤^[21]，ECCA可能因黏液分泌阻塞微血管而掩盖血流动力学，导致分化程度信号不明显。

3.3 DCE-MRI参数与血管生成的表达关系

       病理性血管生成是指由于促血管生成信号传导和抗血管生成信号传导之间的不平衡，导致肿瘤内形成异常血管网络，是癌症的一个标志，也是肿瘤生长和转移的关键过程^[22]。FOLKMAN^[23]于1971年通过直接或间接证据验证肿瘤中新形成的血管是维持肿瘤营养供应所需的关键，新生血管的形态转变也是肿瘤细胞迁移并定居在其他组织或器官中的唯一途径。组织的血液供应依赖于MVD，而循环血液与周围组织之间的物质交换则受控于微血管通透性，MVD在肿瘤学中的核心价值在于直接反映血管生成活性，与肿瘤生长、侵袭及转移密切相关。VEGF是调控血管生成的核心细胞因子，在肿瘤学中是驱动恶性肿瘤血供扩张和转移的关键分子^[24]。CD34抗体在检测肿瘤和小血管内皮细胞中的毛细血管生长方面产生稳定且可重复的结果，具有高度特异性^{[11, 25, 26]}。然而免疫组织化学染色检测结果存在观察者间差异、易受取样部位及每个标本的样本量的影响、活检不能随意重复等局限^{[27, 28]}。此外，ECCA存在通过其他非VEGF依赖性通路驱动血管生成，或者处于VEGF表达下调的生物学阶段的可能，影响VEGF表达量的测定^[29]。

       多项研究^{[30, 31, 32, 33, 34]}表明DCE-MRI在一系列肿瘤的诊断评估中具有一定的诊断价值。与既往研究^[35]相似的是K^trans值与MVD呈正相关，其数值可反映肿瘤微血管通透性及间质对对比剂的吸收能力，K^trans值越高，表明肿瘤组织的灌注水平和血管通透性越强，其恶性程度也相对更高。值得注意的是本研究中Kep、Ve值与病理分化程度、MVD、VEGF表达量无明确的相关性，与LIU等^[36]研究结果不同，从灌注成像角度分析原因：一是对于双室扩展Tofts模型，参数中影响最小的是K^trans；二是DCE-MRI定量分析与药代动力学模型选择密切相关，本研究选择的双室扩展Tofts模型仅在高流量或高渗透限制性假设下有效，其参数的含义取决于该假设条件^{[34, 37]}；三是定量分析的药代动力学模型受限于设备及厂家技术的固定模型，无法任意调节，而某些病变组织可能存在间断供血或多次供血，可能无法与固定模型相匹配^{[19, 38]}。

3.4 不足与展望

       本研究仍然有一些局限：（1）本研究为单中心回顾性研究，可能存在潜在性选择偏移；（2）因纳入的病例有病理标本结果导致研究样本量较少，未来需扩大样本量进一步研究；（3）手动勾画ROI易引入操作者依赖误差并丢失肿瘤异质性，应用半自动或智能全自动分割技术可提升DCE-MRI特征提取精度与可重复性。

4 结论

       综上，DCE-MRI定量参数K^trans值与ECCA患者的MVD有一定联系，DCE-MRI通过量化微循环参数有望成为无创评估ECCA血管生成状态的工具，其预测肿瘤侵袭性以及预后的价值需大样本验证。在未来，关于K^trans值、Kep值、Ve值与ECCA的分化及分期的关系还有待深入研究。