0 引言

       新生儿缺氧缺血性脑病（neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）是导致新生儿死亡和一系列严重长期神经系统后遗症的重要原因，例如脑瘫、癫痫、学习困难以及神经行为和认知功能障碍^{[1, 2, 3]}。其核心病理生理机制是缺氧缺血（hypoxia-Ischemia, HI）触发的一系列级联反应，包括兴奋性毒性、氧化应激及神经炎症等，最终导致神经元死亡和白质损伤^{[4, 5, 6]}。特别是在发育中的大脑，脑白质对HI脑损伤尤为敏感，其微观结构的完整性破坏是造成远期神经功能障碍的结构基础；同时，HI后激活的神经炎症反应是加剧白质损伤的关键驱动因素^{[7, 8, 9]}。​目前，作为评估脑损伤金标准的组织病理学检查具有侵入性，无法进行活体动态观察。常规磁共振成像虽能显示明显的结构性病变，但对早期、微观的白质变化敏感性不足^{[10, 11]}。弥散张量成像（diffusion tensor imaging, DTI）作为一种无创的活体成像技术，能够通过参数如各向异性分数（fractional anisotropy, FA）、平均扩散率（mean diffusivity, MD）、轴向扩散系数（axial diffusivity, AD）和径向扩散系数（radial diffusivity, RD），定量评估白质纤维束的微观结构完整性和方向性，为在体研究白质损伤提供了强有力的工具^{[12, 13, 14, 15]}。然而，在新生动物HI脑损伤模型中，现有DTI研究多局限于单一时间点的观察，缺乏对白质损伤动态变化的系统纵向揭示。更为关键的是，白质微观结构的时序性改变与不同时期、不同维度的神经行为功能结局之间的内在联系，尤其是其是否存在特异脑区的关联，目前尚不明确。因此，本研究通过建立新生大鼠HI模型，结合纵向DTI扫描动态监测不同脑区白质微观结构的时序性演变，并同步评估神经炎症反应及神经行为功能变化，旨在系统揭示白质损伤的动态变化趋势及其与神经功能预后的特异脑区关联。我们假设，早期DTI参数不仅能敏感地监测白质进行性损伤，更能作为预测长期神经行为功能障碍的有效影像学生物标志物，从而为临床早期干预提供关键的实验依据和时间窗。

1 材料与方法

       本实验于2025年1月至7月期间开展，动物实验已获得郑州大学第三附属医院实验管理和伦理委员会批准，（伦）审编号：2024-388-01。

1.1 实验动物及分组

       成年无特定病原体（SPF）级斯普拉格-道利（Sprague-Dawley, SD）大鼠（12只，雌雄各半）购自河南省实验动物中心[许可证号：SCXK (豫) 2025-0005]，饲养于郑州大学第三附属医院科研中心屏障动物设施内。饲养环境严格受控：温度（22±2） ℃，湿度55%~65%，笼内铺垫软木屑；采用12 h光照/12 h黑暗昼夜周期，标准啮齿类饲料与饮用水均自由获取。实验设计流程图所示（图1），​通过雌雄SD大鼠自然交配制备子代，选取第4胎次的健康幼鼠，从中随机选取出生后7日龄（P7）新生雄性大鼠为实验对象（体质量12~15 g），采用缺氧缺血法建立模型。将大鼠幼崽随机分为2组：假手术组（Sham组，n=13）与缺氧缺血组（HI组，n=13），实验全程无动物死亡。根据不同的实验，每组中随机选取10只大鼠被分配用于后续的生长发育检测、磁共振扫描及长期神经行为学评估，其余3只则在HI后24 h处死并取脑，用于蛋白质印迹（Western blot, WB）和定量逆转录聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）。所有实验操作均严格遵循实验动物伦理3R原则[替代（Replacement）、减少（Reduction）、优化（Refinement）]，实验中已采取充分措施减少动物痛苦，且使用满足统计学检验效力所需的最少动物数量。

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图1  HI模型大鼠实验流程示意图。大鼠于出生后第7天进行模型构建。上方时间轴标注急性期检测的时间点（造模后24 h、3天和7天），包括体质量测定、T2WI、WB、qRT-PCR及DTI。其中每组随机取3只大鼠在术后24 h开展 WB、qRT-PCR 检测，其余10只大鼠继续完成所有后续的生长发育监测，影像学及神经行为学评估。下方时间轴标注神经行为学评估的时间安排（第1~30天），具体包括：负向趋地性实验（1~7天）、转棒实验（21天）、28分神经功能评分（7~28天）、旷场实验（28天）、新物体识别实验（29天）和Y迷宫实验（30天）。HI：缺氧缺血性脑损伤；T2WI：T2加权成像；WB：蛋白印迹实验；qRT-PCR：定量逆转录聚合酶链式反应；DTI：扩散张量成像。
Fig. 1  Schematic diagram of the experimental procedure for HI model rats. The model was established on postnatal day 7. The upper timeline indicates the time points for acute phase assessments (24 h, 3 d, and 7 d after modeling), including body weight measurement, T2WI, WB, qRT-PCR, and DTI. Among them, 3 rats were randomly selected from each group to perform WB and qRT-PCR assays at 24 h post-HI, while the remaining 10 rats proceeded to complete all subsequent assessments, including growth monitoring, imaging tests, and neurobehavioral evaluations. The lower timeline shows the schedule for neurobehavioral evaluations (days 1 to 30), specifically including: negative geotaxis test (days 1 to 7), rotarod test (day 21), 28-point neurological function score (days 7 to 28), open field test (day 28), novel object recognition test (day 29), and Y-maze test (day 30). HI: Hypoxic-Ischemic brain injury; T2WI: T2-weighted imaging; WB: Western blot; qRT-PCR: quantitative reverse transcription polymerase chain reaction; DTI: diffusion tensor imaging.

1.2 HI动物模型建立​

       新生大鼠HI模型采用改良的Rice-Vannucci法建立。将P7雄性大鼠幼崽用5%异氟烷（RWD生命科学，深圳，中国）诱导麻醉，并维持在1.5%异氟烷下。幼崽仰卧位，沿中线切开颈部，暴露右侧颈总动脉（common carotid artery, CCA），用5-0手术丝线双重结扎，结扎线之间切断动脉。整个手术过程在5 min内完成，并使用温控垫将每只幼鼠的核心温度维持在（37±0.5） ℃。术后幼崽在恒温加热垫上恢复，然后放回母鼠处。恢复1 h后，将动物置于37 °C的舱内，暴露于8%氧气/92%氮气的全身缺氧环境中1.5 h，其间需每隔5 min观察记录一次缺氧情况，确保维持氧浓度及温度稳定。Sham组动物接受相同的手术暴露，但不进行动脉结扎和缺氧处理。根据实验分组（Sham组、HI组），在HI脑损伤模型的不同时间点，终止实验动物的处理并进行相应的实验分析。

1.3 生长发育监测

       为评估发育进程，Sham组与HI组在缺氧缺血后连续7天每天定量监测体质量。随后使用公式（1）计算体质量增长率（WGR）：

1.4 MRI扫描

       Sham组与HI组的大鼠于指定时间点进行磁共振成像扫描。

1.4.1 T2加权成像

       所有磁共振成像均在一台4.7 T水平孔径无制冷剂临床前磁共振系统（MR Solutions，英国萨里郡盖福德）上进行，使用四通道啮齿动物脑部线圈。动物在异氟烷麻醉下（诱导浓度3.5%，维持浓度1.5%）完成所有扫描。每次扫描结束后，大鼠立即被移至温暖的独立笼中，直至完全苏醒并恢复自主活动。采集包含20层连续1 mm切片的解剖T2加权快速自旋回波图像，具体参数如下：TR 5000，TE 51 ms，回波链长度7，平均次数3，矩阵256×238，FOV 25 mm×25 mm，层/参数=20层/1 mm，层间隔0 mm，总扫描时间为7 min。扫描时间点为HI后24 h。

1.4.2 DTI

       采用自旋回波梯度回波序列进行白质评估，使用2次激发、带导航条及读取方向交错的采集模式，包括1幅b0图像及66个扩散方向（b=1000 s/mm²）。DTI扫描覆盖20层连续1 mm切片，平面分辨率为0.172×0.172 mm²（采集矩阵=100×114，部分傅里叶相位编码，重建为128×128），TR 5000，TE 27 ms，扩散时间δ/Δ=5/13 ms，接收带宽200 kHz，总扫描时间为22 min 40 s。扫描时间点分别为HI后1天、3天和7天。

1.5 感兴趣区选择与图像处理

       在DTI扫描中，研究选取三个大脑区域划定为感兴趣区（region of interest, ROI），包括双侧大脑皮层、海马和胼胝体。所有ROI均由一名具有6年诊断经验的放射科主治医师基于DTI图像手工勾画，该医师对实验流程及动物分组信息不知情；勾画结果随后由一名经验超过10年的放射科副主任医师进行审核，以确保区域一致性，组内相关系数（intra-class correlation coefficient, ICC）均>0.90。采用DSI Studio 软件（http://dsi-studio.labsolver.org）计算各ROI的DTI指标，来评估白质完整性^{[16, 17, 18]}，包括FA、MD、AD和RD。为了确保解剖学的准确性，所有分析均在脑组织掩膜内进行。随后，利用确定性纤维追踪算法（参数设置为默认：FA阈值=0.2，角度阈值=45°，步长0.5 mm，最小长度5 mm）生成白质纤维束的三维可视化图像。

1.6 梗死体积测量

       使用RadiAnt DICOM查看器（v2020.2；Medixant，波兰）对T2WI图像进行分析，以量化脑梗死体积。在每个轴位切片上，手动勾画全脑区域（包括双侧大脑皮层、海马、纹状体等结构）以及梗死高信号区域。通过将每个切片上勾画的面积（cm²）乘以切片厚度（0.1 cm），并累加全部20个连续切片，分别得到总脑体积与总梗死体积（cm³）。最终，按公式（2）计算相对梗死体积占全脑体积的百分比：

       为评估测量可靠性，随机选取6个样本（Sham与HI组各3例）进行信度分析。由两名盲态研究者独立完成全脑及梗死灶勾画。一周后，其中一名研究者对样本进行重复测量。采用ICC评估一致性，结果显示观察者内与观察者间ICC值均>0.95，表明测量方法可靠性极佳。

1.7 WB

       在HI术后24 h，将大鼠右侧梗死侧脑组织迅速分离。采用预冷的含100 μM PMSF的RIPA裂解缓冲液，在冰浴条件下将组织充分匀浆；随后将匀浆液于4 °C、12 000 rpm离心5 min，收集上清液。使用BCA法蛋白浓度测定试剂盒（贝伊奥泰斯公司，中国）严格按照说明书测定总蛋白浓度。取蛋白10 μg经6%~12% SDS-PAGE电泳分离后，转印至PVDF膜。转印后的膜在4 °C下与以下一抗孵育过夜：IL-1β（1∶1000，货号YM8498，ImmunoWay，美国）、TNF-α（1∶1000，货号YM8306，ImmunoWay，美国）和GAPDH（1∶5000，货号10494-1-AP，武汉三鹰，中国）。孵育后使用TBST清洗膜片，并于25 °C下与HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶1000，货号SA00001-1，武汉三鹰，中国）反应1 h，再用TBST洗涤3次，每次10 min。采用增强型化学发光试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）对蛋白条带进行显色，通过Tanon-5200化学发光成像系统（天能，中国）采集图像。最后使用ImageJ软件对条带灰度进行分析，以GAPDH作为内参进行标准化。

1.8 qRT-PCR

       在HI术后24 h，在冰上迅速分离大鼠右侧脑组织，使用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）从其右侧脑组织中提取总RNA。随后，依照PrimeScript™ RT试剂盒（奕圣生物，中国）说明书将RNA反转录为cDNA。cDNA的扩增反应使用SYBR Green qPCR试剂盒（奕圣生物，中国）进行，操作步骤严格遵循试剂盒说明。以β-actin作为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达水平。所用引物由北京擎科生物技术有限公司合成，序列详见表1。​

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表1  目的基因引物序列​
Tab. 1  Sequence of Target Gene Primers

1.9 神经功能与认知行为学测试​

1.9.1 负向趋地实验

       为评估幼鼠姿势反射与运动协调功能的恢复情况，本研究采用负向趋地实验进行检测。​在HI后第1日至第7日，每日进行测试。该实验设备为一长方形平板（长 30 cm，宽 40 cm），倾斜角度固定为20°。具体操作如下：将幼鼠头部朝向斜坡下方放置于底板，经历5 s适应稳定期后开始计时，记录其完成180°转身至头部朝向斜坡上方所需时间（潜伏期），单次测试最长时限为60 s。每只幼鼠每日进行3次重复测试，每次间隔5 min，取其平均潜伏期作为该日的最终记录值。所有测试结束后，使用70%乙醇对设备表面进行彻底擦拭消毒，以消除遗留气味对后续实验结果的干扰。

1.9.2 转棒实验

       为评估运动协调能力，于HI后第21天进行转棒实验。正式测试前，大鼠首先在固定转速为10 rpm的转棒上进行10 s的适应性训练。正式实验时，转棒转速在300 s内由10 rpm匀速增加至30 rpm，记录大鼠从转棒上跌落的时间。若大鼠在300 s内未跌落，则记录成绩为300 s。每只大鼠共进行3次测试，每次间隔1 h。在各次测试之间，使用75%乙醇对转棒表面进行彻底清洁，以排除嗅觉线索对后续实验的干扰。

1.9.3 28分神经功能评分

       在HI后第7、14、21及28天，采用改良的28分神经行为量表对其感觉运动功能进行系统评估。该量表共包含11项子测试，分别为：（1）圆周运动（0~4分），（2）自主活动能力（0~3分），（3）整体状态（0~3分），（4）仰卧翻身反射（0~1分），（5）双前肢桌面放置能力（0~4分），（6）水平横杆自主攀爬能力（0~3分），（7）倾斜平台攀爬能力（0~3分），（8）前肢抓握力（0~2分），（9）对侧反射（0~1分），（10）尾基悬吊对侧旋转（0~2分），（11）视觉引导前肢伸展（0~2分）。各项得分相加为总分，最高28分，分数越高提示神经功能恢复越好，0分则表示存在严重神经损伤^[19]。

1.9.4 旷场实验

       为评估大鼠在新环境中的探索行为、自发活动水平及焦虑样行为，本研究于术后第28天进行旷场实验测定。实验装置为100 cm×100 cm×40 cm的黑色亚克力敞箱，箱底均匀划分为16个方格，其中包括4个中央方格和12个周边方格。正式测试前，将所有大鼠提前30 min置于实验环境中进行适应。实验时，将单只大鼠背向操作者轻柔放置于敞箱中央区域，允许其自由探索10 min，整个行为过程通过视频追踪系统实时记录。分析的关键指标包括总运动距离和在中央区域的停留时间，分别用于评价大鼠的自发活动强度和焦虑样行为水平。所有行为数据均采用ANY-maze软件进行分析。每只大鼠测试结束后，立即使用75%乙醇对实验箱内壁及底部进行彻底清洁，以消除气味痕迹和排泄物对后续实验的干扰。

1.9.5 新物体识别测试

       本研究采用新物体识别测试评估术后第29天大鼠的识别记忆能力。实验在与旷场测试相同的环境条件下开展，以确保实验条件的一致性和结果的可靠性。实验所用刺激物为体积相同的几何异构体（立方体与圆柱体）。实验流程如下：在熟悉化阶段，将大鼠置于空箱内自由探索10 min，以建立对环境的空间认知。第2天为正式测试日，分为两个阶段：训练阶段，将两个完全相同的物体以轴对称方式（距箱体中心25 cm）放置，将大鼠从中央释放并允许其自由探索10 min；测试阶段于训练阶段结束1 h后进行，将训练阶段中的一个物体替换为一个新物体，大鼠再次被引入箱体探索10 min。所有探索行为均通过Anymaze软件记录，有效探索定义为鼻尖与物体距离≤1 cm或发生直接物理接触。实验结束后，计算辨别指数（discrimination index, DI）以评估记忆能力，计算方法见公式（3）^[20]：

       每只大鼠测试结束后，均依次进行以下清理程序：使用无菌吸水纸清除排泄物，以75%乙醇擦拭箱体内壁3次消毒，以彻底消除遗留嗅觉痕迹。

1.9.6 Y迷宫 (Y-maze test)

       为评估空间工作记忆能力，本研究采用Y迷宫（三臂规格：100 cm×20 cm×40 cm）检测大鼠自发交替行为。正式测试时，将术后30天的大鼠置于迷宫中央交叉区，允许其自由探索10 min，所有行为学数据均通过Anymaze软件记录并进行分析。实验前所有动物均接受迷宫环境适应性训练以确保充分熟悉测试装置。自发交替行为通过大鼠连续进入三个不同臂而不重复的百分比进行量化，计算方法见公式（4）^[21]：

1.10 统计学分析

       本研究所有符合正态分布、方差齐的数据均以平均值±标准差表示。统计分析使用SPSS 27.0和GraphPad Prism 9.5软件进行。首先，使用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性，并通过Levene检验验证方差齐性，​​以确定适用参数检验的前提条件是否满足​​。对于​​Sham组与HI组​​在​​同一时间点​​的连续变量比较，​​采用独立样本t检验；​​对于变量间的相关性分析，根据数据正态性检验结果，分别采用Pearson检验或Spearman检验。为控制梗死体积的混杂效应，对主要相关性进行了偏相关分析。​测量数据的可靠性采用ICC进行评估。ICC值大于0.90被认为一致性极佳，0.75~0.90为良好，小于0.75则一致性较差。本研究以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HI脑损伤模型的生理与结构学评估

       纵向体质量监测显示，与Sham组相比，HI组大鼠术后体质量增长率降低（0.954±0.157，P<0.05）。动态变化曲线表明，HI组体质量增长自术后早期即持续落后；事后分析发现，术后第1、3天两组差异无统计学意义，直至第7天，HI组体质量低于Sham组[（24.000±2.383） g vs.​（25.889±1.244） g，P<0.05]，具体结果见图2。术后24 h脑部T2WI显示，HI组右侧大脑半球出现弥漫性T2高信号，而Sham组结构正常、信号均匀。梗死体积定量分析证实，HI组梗死百分比（26.60%±4.34%）高于Sham组（P<0.001）。​​以上从生理发育到脑部结构的综合评估表明，HI手术成功构建了兼具生长发育障碍与明确结构性脑损伤的动物模型，详见图3。

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图2  HI脑损伤对新生大鼠体质量增长的影响。2A：Sham组与HI组在术后7天的体质量增长率比较；2B：两组在术后1、3、7天的体质量动态变化曲线（横坐标为造模后的时间点，纵坐标为体质量）。*：P<0.05。HI：缺氧缺血性脑损伤；Sham：假手术。
Fig. 2  Effect of HI brain injury on body weight gain in neonatal rats. 2A: Comparison of weight gain rates between the Sham and HI groups 7 days after surgery; 2B: Dynamic changes in body weight at 1, 3 and 7 days post-surgery (The x-axis represents post-modeling time points, and the y-axis represents body weight). *: P < 0.05. HI: Hypoxic-Ischemic brain injury; Sham: Sham operation.

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图3  HI后新生大鼠脑损伤及梗死体积定量分析。​​​​3A：术后24 h Sham组与HI组脑部冠状位T2WI代表性图像。Sham组脑组织信号均匀、结构完整；HI组患侧大脑半球可见明显T2高信号，提示广泛脑水肿及梗死。3B：梗死体积定量分析。T2WI：T2加权成像；HI：缺氧缺血性脑损伤；Sham：假手术。
Fig. 3  Quantitative analysis of brain damage and infarct volume in neonatal rats after HI. 3A: Representative coronal T2WI images of the brain from Sham and HI groups at 24 h post-surgery. The Sham group showed uniform signal intensity and intact structure; the HI group exhibited marked T2 hyperintensity in the affected cerebral hemisphere, indicating extensive brain edema and infarction. 3B: Quantitative analysis of infarct volume. T2WI: T2-weighted imaging; HI: Hypoxic-Ischemic brain injury; Sham: Sham operation.

2.2 DTI评估HI脑损伤后白质微观结构变化​

       大鼠脑部特定区域的白质微观结构变化如图4所示。纵向比较显示，与Sham组相比，HI组三个脑区的FA值自术后呈现随时间持续下降的趋势，至术后第7天降至最低；而MD、AD及RD值则随病程进展呈持续升高趋势。大脑皮层作为代表性区域，其损伤模式尤为典型：其FA值自术后第1天起降低（P<0.001），并随时间的推移呈进行性下降，至第7天时差异最为显著（0.269±0.038 vs. 0.154±0.015，P<0.001）。相应的，其MD、AD和RD值亦从第1天开始持续升高，于第7天达到峰，详见图5。

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图4  大鼠脑部特定区域与白质微观结构变化。4A：大鼠脑区ROI勾画示意图。左侧面板中红色区域标示双侧大脑皮层，蓝色区域标示双侧海马（白色箭头）；右侧面板中绿色区域标示胼胝体。4B：HI术后24 h各组代表性DTI参数图，包括FA、MD、AD及RD。ROI：感兴趣区；DTI：扩散张量成像；FA：各向异性分数；MD：平均扩散系数；AD：轴向扩散系数；RD：径向扩散系数；HI：缺氧缺血性脑损伤；Sham：假手术组。
Fig. 4  Changes in specific brain regions and white matter microstructure in rats. 4A: Schematic diagram of ROI delineation in rat brain regions. In the left panel, the red areas indicate the bilateral cerebral cortex, and the blue areas indicate the bilateral hippocampus (white arrows); in the right panel, the green area indicates the corpus callosum. 4B: Representative DTI parameter maps of each group 24 h after HI surgery, including FA, MD, AD and RD. ROI: region of interest; DTI: diffusion tensor imaging; FA: fractional anisotropy; MD: mean diffusivity; AD: axial diffusivity; RD: radial diffusivity; HI: Hypoxic-Ischemic brain injury; Sham: Sham operation.

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图5  两组大鼠不同脑区微观结构指标的时序性变化。比较Sham组与HI组术后第1、3、7天大脑皮层、海马及胼胝体的DTI参数（FA、MD、AD、RD），以评估白质微观结构的动态演变。横坐标表示术后时间点（天）。*：P＜0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。DTI：扩散张量成像；FA：各向异性分数；MD：平均扩散系数；AD：轴向扩散系数；RD：径向扩散系数；HI：缺氧缺血性脑损伤；Sham：假手术。
Fig. 5  The temporal changes of microstructure indicators in different brain regions of two groups of rats. The DTI parameters (FA, MD, AD, RD) of the cerebral cortex, hippocampus and corpus callosum on the 1st, 3rd and 7th days after surgery were compared between the Sham group and the HI group to evaluate the dynamic evolution of white matter microstructure. The x-axis represents the time points after surgery (d). *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001.​​ DTI: diffusion tensor imaging; FA: fractional anisotropy; MD: mean diffusivity; AD: axial diffusivity; RD: radial diffusivity; HI: Hypoxic-Ischemic brain injury; Sham: Sham operation.

2.3 炎症因子 IL-1β与TNF-α的表达水平比较

       蛋白质免疫印迹分析显示，与Sham组相比，HI组大鼠脑组织中TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平明显升高。进一步的定量分析证实，上述两种炎症因子的蛋白相对表达量均高于Sham组（P<0.001）。与此一致，qRT-PCR结果显示，HI组TNF-α与IL-1β的mRNA表达水平也发生上调（P<0.001），详见图6。

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图6  HI后24 h炎症因子表达上调​。6A：各组新生大鼠脑组织中IL-1β、TNF-α的蛋白表达WB条带图；6B： 蛋白表达定量统计结果；6C​​：IL-1β和TNF-α mRNA相对表达量的qRT-PCR分析结果。***：P<0.001。IL-1β：白细胞介素-1β；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；WB：蛋白印迹实验；qRT-PCR：实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应；HI：缺氧缺血性脑损伤；Sham：假手术。
Fig. 6  Upregulation of inflammatory factors at 24 h after HI. 6A: Western blot bands of IL-1β and TNF-α protein expression in the brain tissue of neonatal rats from each group; 6B: Quantitative statistical analysis of protein expression; 6C: qRT-PCR analysis of the relative mRNA expression levels of IL-1β and TNF-α. ***: P<0.001.IL-1β: Interleukin-1β; TNF-α: Tumor Necrosis Factor-α; WB: Western blot; qRT-PCR: real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction; HI: Hypoxic-Ischemic brain injury; Sham: Sham operation.

2.4 HI脑损伤大鼠短期与长期神经行为学评估​

       在术后1~7天的连续监测中，HI组的负向趋地性潜伏期显著高于Sham组，具体表现为HI组动物从斜坡装置中逃出的时间明显延长。术后第7天进行的28分神经功能评分显示，HI组的神经功能评分（17.4±1.5）低于Sham组（26.4±1.3）（P<0.001）。

       术后第21天进行的转棒实验结果显示，HI组的跌落潜伏期[（80.7±10.8） s]短于Sham组[（123.8±22.1 ）s]（P<0.001）。在术后第28天进行的旷场实验中，运动轨迹图显示HI组动物主要沿场地边缘活动，而Sham组则表现出更广泛的中央区域探索行为。进一步量化分析表明，HI组的中央区停留时间占比（5.9%±2.5%）低于Sham组（15.5%±2.5%）（P<0.001）；同时HI组的总运动距离[（24.9±7.6 ）m]较Sham组[（38.1±7.8）m]减少（P<0.01）（图7F）。术后第29天进行的新物体识别测试显示，HI组的探索轨迹明显受限，对新物体的探索行为减少。定量分析表明，HI组的辨别指数（-0.03±0.24）低于Sham组（0.62±0.25）（P<0.001）。术后第30天进行的Y迷宫测试显示，HI组的自发交替率（29.8%±5.1%）低于Sham组（50.5%±8.6%）（P<0.001），详见图7。

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图7  HI 模型对大鼠神经行为功能的长期影响。7A：负向趋地实验潜伏期；7B：在术后指定时间点评估的28 分神经功能评分（7A、7B横坐标均表示术后时间点）；7C：转棒实验中跌落潜伏期（术后第21 天）；7D：旷场实验中代表性运动轨迹（术后第28 天）；7E：旷场实验中央区停留时间占比；7F：旷场实验中总运动距离；7G：新物体识别测试期运动轨迹（术后第29 天）；7H：新物体识别辨别指数；7I：Y迷宫自发交替率（术后第30 天）。**：P<0.01；***：P<0.001。HI：缺氧缺血性脑损伤；Sham：假手术。
Fig. 7  Long-term effects of HI model on neurobehavioral functions in rats. 7A: Latency in the negative geotaxis test; 7B: 28-point neurological score assessed at specified time points after surgery (The x-axes in both panels 7A and 7B represent the time points after surgery); 7C: Latency to fall in the rotarod test (post-HI day 21); 7D: Representative locomotor trajectories in the open field test (post-HI day 28); 7E: Percentage of time spent in the central zone of the open field; 7F: Total distance traveled in the open field test; 7G: Locomotor trajectories during the novel object recognition test (post-HI day 29); 7H: Discrimination index in the novel object recognition test; 7I: Spontaneous alternation rate in the Y-maze (post-HI day 30). **: P < 0.01; ***: P < 0.001.​​ HI: Hypoxic-Ischemic brain injury; Sham: Sham operation.

2.5 相关性分析

2.5.1 白质完整性与行为功能的时序相关性​

2.5.1.1 白质完整性与短期行为的相关性

       各脑区白质指标与短期神经行为功能的相关性随时间变化显著。损伤后1天至第7天，多数指标的相关性强度逐渐增强，尤以第7天的相关性最为显著（如大脑皮层FA与28分神经功能评分：r=0.86，P<0.001）。纵观整个观察期，FA值与28分神经功能评分普遍呈正相关，与负向趋地潜伏期呈负相关；而MD、AD、RD值则与神经功能评分呈负相关，与负向趋地潜伏期呈正相关（表2）。

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表2  不同脑区白质微观结构指标与短期神经行为学功能的相关性分析
Tab. 2  Correlation analysis of microstructural indicators of white matter in different brain regions and neurobehavioral functions

2.5.1.2 白质完整性与长期行为的相关性

       术后第7天的DTI参数与长期行为结果的相关性分析显示，大脑皮层、海马和胼胝体的FA值与转棒实验跌落潜伏期（P<0.001）及28分神经功能评分（P<0.001）均呈显著正相关。相反，上述脑区的MD与AD值与这两项行为指标均呈显著负相关（P<0.001）。未发现皮层RD值与上述行为指标的显著相关性。在认知功能方面，三个脑区的FA值与Y迷宫自发交替率呈正相关（r值分别为0.69、0.77、0.75，P<0.001），而MD值与新物体识别指数呈负相关（r值分别为-0.70、-0.66、-0.68，P<0.001）。此外，胼胝体的AD值与Y迷宫自发交替率呈负相关（P<0.01）。在旷场实验中，三个脑区的FA值与中心停留时间百分比呈正相关（P<0.001），而MD与AD值与之呈负相关（P<0.01）。海马与胼胝体的RD值也与该指标呈负相关（P<0.001），详见图8。

       为排除脑损伤程度对上述关联的潜在混杂影响，我们进一步以梗死体积为控制变量，对以上所有相关进行了偏相关分析。结果显示，即使在控制梗死体积后，上述各项关联依然保持极显著水平（所有P<0.05），表明大脑皮层、海马与胼胝体的白质微观结构损伤与行为功能障碍之间的关联具有稳健性，并非由总体梗死范围所驱动。

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图8  术后第7 天大脑皮层、海马及胼胝体的DTI 参数（FA、MD、AD、RD）与长期行为学指标的相关性热图。图中数字为r值，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。DTI：扩散张量成像；FA：各向异性分数；MD：平均扩散系数；AD：轴向扩散系数；RD：径向扩散系数；Ctx:大脑皮层；Hipp:海马；CC：胼胝体；28-point neuroscore：术后28 天的28 分神经功能评分；Rotarod Test:转棒跌落潜伏期；OFT：旷场中心区停留占比；NOR：新物体识别辨别指数；Y maze：Y迷宫自发交替率。
Fig. 8  Heatmap showing the correlations between the DTI parameters (FA, MD, AD, RD) of the cerebral cortex, hippocampus and corpus callosum and the long-term behavioral indicators on the 7th postoperative day. The numbers in the figure represent the r values, *: P < 0.05, **: P< 0.01, ***: P< 0.001. DTI: diffusion tensor imaging; FA: fractional anisotropy; MD: mean diffusion coefficient; AD: axial diffusion coefficient; RD: radial diffusion coefficient; Ctx: cerebral cortex; Hipp: hippocampus; CC: corpus callosum; 28-point neuroscore: 28-day postoperative neurofunctional score; Rotarod Test: latency of falling on the rotating rod; OFT: percentage of time spent in the center of the open field; NOR: discrimination index for new object recognition; Y maze: spontaneous alternation rate in the Y-maze.

2.5.2 白质损伤与行为功能的特异脑区相关​

       大脑皮层FA值与负向趋地性潜伏期呈显著负相关（r=-0.84，P<0.001）；与转棒实验跌落潜伏期呈显著正相关（r=0.82，P<0.001）；同时与旷场实验中央区停留时间占比亦呈显著正相关（r=0.66，P=0.002）。海马FA值与Y迷宫自发交替率显著正相关（r=0.77，P<0.001）；与新物体识别辨别指数显著正相关（r=0.63，P=0.003）；同时与旷场实验中央区停留时间占比同样呈显著正相关（r=0.66，P=0.002），详见图9。

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图9  脑白质微观结构与对应脑区功能行为的相关性分析。9A~9C：大脑皮层FA值（术后第7 天）与运动协调功能（负向趋地性潜伏期、转棒跌落潜伏期）及焦虑样行为（旷场中央区停留时间占比）的相关性；9D~9F：海马FA 值（术后第7 天）与认知功能（Y迷宫自发交替率、新物体识别辨别指数）及焦虑样行为（旷场中央区停留时间占比）的相关性。FA：各向异性分数。
Fig. 9  Correlation analysis of the microscopic structure of white matter and the corresponding functional and behavioral characteristics of brain regions. 9A to 9C: Correlation between the FA values of the cerebral cortex (post-HI day 7) and the motor coordination function (negative approach latency, rod turning fall latency) and anxiety-like behavior (percentage of time spent in the central area of the open field); 9D to 9F: Correlation between the FA values of the hippocampus (post-HI day 7) and cognitive function (spontaneous alternation rate in the Y-maze, new object recognition discrimination index) and anxiety-like behavior (percentage of time spent in the central area of the open field). FA: fractional anisotropy.

3 讨论

       本研究通过建立新生大鼠HI模型，结合纵向DTI扫描、神经炎症指标检测以及多时间点神经行为学评估，探讨了脑白质微观结构的动态演变及其与神经功能预后的关联。结果显示，HI后早期即出现显著的神经炎症反应；在术后第1、3、7天，大脑皮层、海马及胼胝体的​​白质微观结构​​呈进行性损伤，且损伤程度与​​短期及长期​​的神经行为功能障碍均密切相关，此关联具有明确的脑区特异性。本研究的创新点在于，系统性地​​揭示了在新生大鼠HI模型中，通过纵向DTI扫描系统描绘了多个关键脑区白质微观结构的动态变化趋势​​，并将其特定脑区的参数值分别与短期及长期的运动、认知和焦虑样行为等多种神经行为学结果进行关联。临床价值方面​​，早期的DTI参数与远期神经行为预后存在显著相关性，这使其有望成为​​预测HIE新生儿长期神经功能预后的影像学标志物​​。

3.1 HI后白质损伤的DTI动态演变规律及神经炎症作用​

       新生大鼠HI后可触发一系列病理级联反应，包括能量代谢障碍、兴奋性毒性及神经炎症等，导致少突胶质前体细胞损伤和轴索结构破坏，最终引起白质微观结构的紊乱^{[22, 23]}。白质微观结构的损伤，具体体现为轴突完整性受损、髓鞘化状态改变及轴突密度下降等^[24]。这类结构改变会直接影响组织内水分子的扩散运动，而DTI技术能够无创、定量地检测FA、MD等参数的改变^[25]。其中，FA值降低通常提示纤维结构完整性和有序性的破坏，MD值的升高则反映组织内水分子扩散整体障碍。因此，本研究中FA、MD等DTI参数的动态变化，正是上述白质微观结构进行性损伤的直接、敏感的在体影像学标志，从而为在体评估HI后白质损伤提供敏感指标^{[16, 26, 27]}。本研究结果显示，HI早期大鼠已出现体质量增长减缓以及T2WI图像上的脑梗死表现，提示存在明显的发育障碍和形态学损伤。进一步通过纵向DTI扫描发现，白质损伤在亚急性期呈现持续恶化的趋势，具体表现为FA值逐渐下降，MD等参数逐步上升，并在HI后第7天达到高峰^[18]。这种动态演变提示，HI对白质的损害并非停留在初始状态，而是持续进展的病理过程^{[6, 28]}。白质损伤的恶化趋势与HI后24 h神经炎症因子IL-1β、TNF-α的显著上调在时间上高度一致。作为核心炎症介质^[22]，IL-1β与TNF-α不仅可直接损害少突胶质前体细胞并抑制髓鞘形成^{[29, 30, 31]}，还能进一步放大炎症级联、破坏血脑屏障完整性，加剧血管源性水肿与细胞毒性水肿^{[32, 33]}，这些病理改变可能是导致DTI参数中MD与RD值升高的直接原因。因此，HI后早期出现的神经炎症反应很可能在推动白质微观结构的进行性恶化中起到核心作用^[34]。

3.2 HI后白质损伤与神经行为功能障碍关联的广泛性与脑区特异性

       HI可导致实验动物出现持续性的神经行为异常，其功能缺损随病程进展而动态演变^{[35, 36]}：在损伤早期主要表现为负向趋地性潜伏期延长和神经功能评分降低等短期障碍；而在远期则发展为转棒实验中的运动协调失调、旷场实验中的探索活动减少与焦虑样行为，以及Y迷宫和新物体识别测试所揭示的认知记忆受损等复杂行为异常^[37]。本研究结果表明，神经行为功能障碍与白质损伤的时序关联特征明确，其特征表现为：​​术后第7天各脑区的DTI参数与绝大多数长期行为学指标的相关性最为显著。​这可能是由于至术后第7天，继发性脑损伤已趋于稳定，使得DTI能够更特异地反映白质结构的损伤程度^{[38, 39]}。为进一步验证该关联的可靠性，以梗死体积为控制变量进行了偏相关性分析，研究结果证实，DTI 参数与行为学指标的显著关联主要反映了白质结构性损伤与神经功能缺损之间的内在联系，并非由对DTI参数影响较小的水肿等混杂因素所主导^{[40, 41]}，而是真实反映了白质结构性损伤与神经功能缺损之间的内在联系。同时，本研究行为数据显示，至术后第七天大鼠的行为学缺陷也趋于稳定，减少了急性期非特异性因素的干扰^[42]。因此，该时间点能更准确地揭示脑白质结构性损伤与神经功能障碍之间的本质联系。

       FA作为DTI技术中量化白质纤维结构完整性的关键参数，其数值高低直接反映水分子沿白质纤维定向扩散的限制程度，是评估轴索完整性与髓鞘化程度的经典影像学生物标志物^{[25, 43]}。基于此，本研究重点分析不同脑区FA值与行为学表现的相关性。研究结果显示，HI后第7天的白质微结构损伤与神经功能障碍的关联不仅存在明确的时序规律，更表现出显著的脑区特异性。具体而言，大脑皮层的白质完整性与运动功能密切相关，其FA值与转棒实验跌落潜伏期呈强正相关，与负向趋地性潜伏期呈强负相关，表明大脑皮层及其下行投射纤维的微观结构完整性是维持精细运动协调与姿势反射控制的神经基础^[44]。与之相比，海马区的白质完整性则与认知功能高度相关^[45]，其FA值分别与Y迷宫自发交替率和新物体识别辨别指数呈显著正相关，从影像学层面提示，海马区白质纤维束的微观结构完整性对于支撑空间工作记忆与识别记忆的信息处理过程至关重要^[46]。此外，旷场实验中央区停留时间同时与皮层及海马FA值相关，表明焦虑样行为可能源于感觉运动整合高级皮层与边缘系统情绪调控网络之间协同作用的障碍^[47]。

       综上所述，本研究从“广泛性”和“特异性”两个维度，系统阐述了HI后白质损伤与神经行为功能障碍的内在联系。这为理解HI脑损伤后异质性神经功能后遗症的结构基础提供了新的视角，也强调了未来针对特定功能缺损进行精准干预时，需要考虑其对应的关键脑区白质作为潜在靶点。

3.3 研究的局限性

       本研究存在一些局限性：第一，本研究的观察周期有限。影像学观察至HI后第7天及部分行为学测试至第30天，虽能有效捕捉亚急性期的白质进行性损伤，但无法评估白质损伤的长期演变轨迹及其对成年高级认知功能的远在影响。第二，缺乏组织学的直接验证。本研究主要依赖DTI间接评估白质微观结构的改变，但我们并未通过髓鞘染色或透射电镜等金标准方法，在组织层面直接证实DTI异常所对应的具体超微结构改变。第三，实验动物性别单一。本研究仅选用雄性新生大鼠，以排除性别差异对实验结果的干扰；其结论在雌性群体中的适用性尚需验证。

4 结论

       本研究通过纵向DTI成像和多时间点行为学评估，系统揭示了新生大鼠HI后脑白质损伤的动态演变规律及其与神经功能预后的内在联系。结果表明，HI可引发白质进行性损伤，且神经炎症可能是驱动该过程的关键病理机制之一。进一步分析显示，白质损伤与神经行为功能障碍的关联，在早期阶段呈现出明确的动态演变特征与关联的脑区差异性。​​这些发现证实，早期的DTI参数可作为评估HI损伤严重程度和预测长期神经行为预后的潜在影像学生物标志物。鉴于HIE患儿在发病机理、脑发育阶段及白质易损性上与新生大鼠模型高度相似，且DTI技术已成熟应用于临床新生儿脑成像，本研究所确立的DTI参数动态变化规律及其与预后的强关联性，为将此类参数转化为评估HIE患儿早期病情、预测神经发育预后的临床影像学生物标志物，提供了关键的临床前实验依据。