0 引言

       锰（manganese, Mn）是人体不可或缺的营养物质，作为多种酶的辅助因子，对生长发育、神经功能、免疫调节等具有重要作用^{[1, 2]}。然而，在采矿、焊接等工作中，长期或过量吸入含锰颗粒会导致其在大脑中累积，引发神经毒性，表现为类帕金森病症状，如中枢神经系统功能异常和运动障碍^[3]，这已经成为公共卫生领域的重要问题。近年来，随着锰矿开采、钢铁冶炼及焊接工业的快速发展，从业人数不断增加，长期低剂量锰暴露所致的慢性中毒已成为该群体面临的重要职业健康风险^[4]。目前锰暴露的致病机制尚未完全阐明，早期临床症状较为隐匿，因此寻找锰暴露焊工早期生物标志物尤为重要。

       功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, fMRI）通过测量血氧水平依赖信号来无创获取大脑的活动信息。它作为神经元功能的间接指标，为脑功能研究提供了关键支持，目前已成为神经影像领域的研究热点之一^[5]。一项基于种子点的静息态fMRI研究发现，青少年生命早期锰暴露与认知和运动控制相关脑网络之间的功能连接存在显著关联^[6]。如今，功能连接已成为诊断神经退行性疾病及探索其病理机制潜在的重要影像标志物。传统的静态功能连接分析通常假定大脑区域间的连接是静态的^{[7, 8, 9]}。然而，越来越多的证据表明，大脑功能连接具有显著的时变特征，这种动态变化对于理解认知功能和疾病机制至关重要^[10]。动态脑功能网络连接（dynamic functional connectivity network, dFNC）是通过滑动窗口法重复计算网络间的功能连接指标，分析重复出现的功能连接模式、平均滞留时间及状态间的转换次数，扩展了之前对静态网络的观察，从而捕捉更多的信息^{[11, 12]}，为研究大脑动态整合以及对外部刺激与内部状态变化的反应提供有价值的信息。然而，锰暴露如何影响大脑功能连接的时变特征，目前仍属未知。因此，本研究基于全脑dFNC方法，探究锰暴露焊工动态功能连接及时变特征的变化。

1 材料与方法

1.1 一般资料

       本研究前瞻性纳入2023年7月至2024年6月于西安市中心医院进行职业体检的32例慢性锰暴露焊工作为研究对象，同期在周边社区公开招募30例健康志愿者（healthy controls, HCs）作为对照组。研究方案遵照《赫尔辛基宣言》的伦理准则严格执行，并经过西安市中心医院伦理委员会批准（批件号：LW-2023-035），所有被试在试验开始前均签署了知情同意书。

1.2 纳入标准

       职业性慢性锰暴露焊工组：（1）参与相关锰暴露工作>10年；（2）年龄范围为30到50岁，性别男；（3）受试者知情同意，且自愿参加研究；（4）右利手；（5）具有普通高等教育学历。

       健康对照（healthy controls, HCs）组：（1）未接触过任何形式的金属暴露；（2）年龄、性别与对应患者匹配；（3）日常生活能力正常，认知功能正常；（4）右利手；（5）具有普通高等教育学历。

1.3 排除标准

       （1）存在磁共振扫描禁忌证；（2）药物或酒精、尼古丁依赖者；（3）有脑外科手术、严重脑创伤、脑肿瘤、脑卒中、帕金森病或其他神经系统疾病史；（4）液体衰减反转恢复成像显示大量的脑白质呈高信号改变。

1.4 静息态fMRI图像数据采集

       本研究采用荷兰Philips 3.0 T Ingenia磁共振扫描仪及配套32通道头部线圈进行图像采集。扫描过程中，受试者需佩戴隔音耳塞，保持平躺姿势，处于清醒而平静的状态，同时闭目并尽可能减少思维活动。若出现杂念，无需紧张，自然放松即可。fMRI采用血氧水平依赖序列，具体参数如下：TE 35 ms，TR 2500 ms，层间距0 mm，扫描层数40层，层厚4 mm，翻转角90°，FOV 240 mm×240 mm。三维T1加权成像参数如下：TE 3 ms，TR 6600 ms，层间距0 mm，扫描层数170层，层厚1 mm，FA 8°，FOV 240 mm×240 mm。

1.5 fMRI数据预处理

       静息态fMRI图像在Matlab 2020a (MathWorks, USA,https://www.mathworks.com)平台中使用DPABI_V 8.2（中国科学院心理研究所，http://rfmri.org/dpabi）和SPM12 (Functional Imaging Laboratory, UCL Queen Square Institute of Neurology, UK,https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/software/spm12/)进行预处理。首先，排除数据中前10个不稳定时间点的图像。其次，对所有功能像进行时间层校正及头动校正，剔除头动>2 mm或旋转角度>2°的异常样本。第三，将高清晰度的功能像进行配准，并在此过程中通过重采样统一图像分辨率（3 mm×3 mm×3 mm）。最后，使用6 mm半高宽高斯核进行空间校正。

1.6 独立成分分析

       对预处理后的磁共振数据，借助GIFT (TReNDS, USA,https://trendscenter.org/software/gift/)工具箱开展独立成分分析，具体流程如下：首先基于最小描述长度准则估计独立成分（independent component, IC）的最佳数量，随后采用主成分分析进行特征提取以降低数据维度并减少计算量与噪声。在此基础上，使用信息最大化算法（information maximization algorithm, informax）进行空间独立成分分析，并借助ICASSO工具重复20次计算以验证结果的稳定性。之后，通过反向重建和Fisher z变换获取z值标准化后的个体水平IC的时间序列及空间图谱。最终，通过多重线性回归计算各成分与已知静息态网络图谱间的皮尔逊相关系数，并结合人工视觉检查，综合筛选并识别出有意义的IC。

1.7 动态功能连接分析

       动态功能连接采用GIFT工具箱中的dFNC模块，首先，采用滑动窗口分析方法，对静息态时间序列数据进一步进行预处理，包括去线性趋势、去除全局信号、灰白质及脑脊液在内的噪声协变量及低通滤波（截止频率为0.15 Hz）。其次按每窗30个TR、步长3 TR的方式划分窗口，通过在各时间窗应用L1正则化最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator, LASSO）回归计算节点间均值序列的回归系数，构建dFNC矩阵。

       基于窗口功能连接矩阵，本研究采用k-means聚类识别重复出现的功能状态，计算相关性距离，再通过肘部法则确定最佳聚类数目^[13]。同时计算各受试者的dFNC指标，包括时间分数（fraction time, FT）平均滞留时间（mean dwell time, MDT）及状态间的转换次数（number of transitions, NT）。

1.8 统计学分析

       对一般统计资料采用SPSS 19 (IBM Corp., USA,http://www.spss.com/software/statistics/)软件进行统计分析。应用Shapiro-Wilk方法检验年龄、尿锰值、暴露年限等计量资料的正态性，符合正态分布者使用独立样本t检验，不符合者则使用Mann-Whitney U检验进行分析。dFNC相关指标也采用Mann-Whitney U检验，设定P<0.05为差异具有统计学意义。在脑网络功能连接分析中，使用GIFT工具包进行统计分析，纳入年龄作为协变量，采用双样本t检验并进行错误发现率（false discovery rate, FDR）校正，评估dFNC的组间差异。提取有差异的功能连接值和dFNC指标，与临床资料进行皮尔逊相关性分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

1.9 样本量估算方法

       本研究采用G Power 3.1 (Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Germany,http://www.gpower.hhu.de/)软件进行回顾性检验效能分析。根据研究需要，设定第一类错误概率（α）=0.05，并通过公式（1）计算得到的效应量（Cohen's d=0.90），计算本研究的检验功效，以确保结果可靠性。

       注：公式中，d为Cohen's d效应量，t为独立样本t检验的统计量值，n1为锰暴露焊工组样本量，n2为健康对照组样本量。

2 结果

2.1 样本量计算结果

       计算结果得出检验功效（1-β）=89.91%。计算结果显示，本研究的检验功效高于常规要求的80%标准，提示本研究的检测能力充足。

2.2 临床资料统计结果

       本研究经过严格的纳入与排除后，共招募62例受试者，其中8例因头动过大或图像伪影被剔除，最终共54名受试者的数据进入后续分析，其中锰暴露焊工组25例，HCs组29例。两组受试者在年龄这一连续变量上的比较，因Shapiro-Wilk检验提示其分布不符合正态性，故采用Mann-Whitney U检验。结果显示，两组年龄差异无统计学意义（P=0.332），见表1。

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表1  Mn welders组与HCs组临床资料统计结果
Tab. 1  Clinical data of Manganese-exposed welders and HCs group

2.3 独立成分分析结果

       本研究从20个初始成分中识别出12个有意义的成分，并将其分类为8个脑功能网络。具体为视觉网络（visual network, VN，包括IC2和IC16），执行控制网络（executive control network, ECN，包括IC3和IC6），听觉网络（auditory network, AUN，包括IC4），楔前叶网络（precuneus network, PCUN，包括IC7），语言网络（language network, LAN，包括IC10），默认模式网络（default mode network, DMN，包括IC11，IC15和IC17），感觉运动网络（sensorimotor network, SMN，包括IC12）和突显网络（salience network, SN，包括IC20）。各个脑功能网络独立成分的空间分布图如图1所示。

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图1  20个独立成分对应脑功能网络的空间分布图。VN：视觉网络；ECN：执行控制网络；AUN：听觉网络；PCUN：楔前叶网络；LAN：语言网络；DMN：默认模式网络；SMN：感觉运动网络；SN：突显网络；IC：独立成分。
Fig. 1  Spatial distribution map of the brain functional network corresponding to 20 independent components. VN: visual network; ECN: executive control network; AUN: auditory network; PCUN: precuneus network; LAN: language network; DMN: default mode network; SMN: sensorimotor network; SN: salience network; IC: independent component.

2.4 动态功能网络连接分析结果

       本研究使用k-means方法提取反复出现的dFNC模式，利用肘部法则确定最佳聚类数目为4，如图2所示。4种状态的矩阵如图3所示。其中状态3的出现频率最高，各网络成分间的功能连接较弱，状态4也表现出相似的特征。相反，状态1的出现频率最低，但脑区间呈现广泛且显著的正向连接。状态2则表现为特定网络的增长或减弱，但整体网络间的功能连接性较强。与HCs组相比，锰暴露焊工组状态1中SN-ECN和DMN-LAN功能连接显著降低；状态2中SN-DMN功能连接显著降低；状态4中SN-AUN和DMN-LAN功能连接显著降低（P<0.05）（图4）。锰暴露焊工组的转换次数高于健康对照组（图5）。

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图2  通过肘部法则估计出最佳聚类数目为4。根据肘部法则，选择曲线拐点处对应的K值作为最终聚类数。
Fig. 2  The optimal number of clusters was estimated as 4 via the elbow method. According to this criterion, the K value corresponding to the elbow point of the curve was selected as the final cluster number.

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图3  通过K-means聚类方法提取的4种动态功能连接状态。VN：视觉网络；ECN：执行控制网络；AUN：听觉网络；PCUN：楔前叶网络；LAN：语言网络；DMN：默认模式网络；SMN：感觉运动网络；SN：突显网络；矩阵内的色阶代表网络之间功能连接的相关关系。
Fig. 3  Four dynamic functional connectivity states estimated by K-means clustering algorithm. VN: visual network; ECN: executive control network; AUN: auditory network; PCUN: precuneus network; LAN: language network; DMN: default mode network; SMN: sensorimotor network; SN: salience network. The color levels in the matrix represent the correlation between functional connections between networks.

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图4  锰暴露焊工组和健康对照组在state1、state2 和state4 中网络间功能连接对比。VN：视觉网络；ECN：执行控制网络；AUN：听觉网络；PCUN：楔前叶网络；LAN：语言网络；DMN：默认模式网络；SMN：感觉运动网络；SN：突显网络。
Fig. 4  Matrixs show differences of internetwork FC between Mn welders and HCs in state1, state2 and state4. VN: visual network; ECN: executive control network; AUN: auditory network; PCUN: precuneus network; LAN: language network; DMN: default mode network; SMN: sensorimotor network; SN: salience network.

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图5  两组转换次数对比。HCs：健康对照；Mn welders：锰暴露焊工。
Fig. 5  Comparisons of number of transitions between groups. HCs: healthy controls; Mn welders: manganese-exposed welders.

2.5 相关性分析

       然而，在锰暴露焊工组中，未检测到上述具有差异有统计学意义的dFNC指标与各项临床指标之间存在显著关联，但存在线性趋势。其中，锰暴露组状态3的时间分数与尿锰值之间的相关系数为0.14（P=0.52）（图6A）；状态3的平均滞留时间与尿锰值之间的相关系数为0.07（P=0.76）（图6B）。

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图6  相关性分析散点图。6A：状态3的时间分数与尿锰值的相关性；6B：状态3的平均滞留时间与尿锰值的相关性。
Fig. 6  Scatter plot of correlation analysis. 6A: Correlation of fraction time and urine manganese value in state 3; 6B: Correlation of mean dwell time and urine manganese value in state 3.

3 讨论

       本研究基于独立成分分析，应用dFNC方法探讨了长期职业性锰暴露对焊工群体大脑网络动态功能连接网络的影响。结果显示，与HCs组相比，锰暴露焊工在特定状态下表现出SN、ECN与DMN间的功能连接显著降低，但两组间dFNC指标的组间差异无统计学意义。先前已有研究指出，大脑动态功能连接具有显著的时变特征^{[14, 15]}。本研究进一步证实，dFNC分析方法能够有效捕捉常规静态功能连接分析无法揭示的动态特征。该方法突破了传统静态功能连接的局限，揭示了锰暴露人群动态脑网络连接的异常模式，为理解其神经病理机制补充了新的影像学证据。

3.1 基于聚类分析的锰暴露焊工动态功能连接模式的“稀疏连接状态”

       本研究基于k-means聚类方法共聚类出4种动态功能连接网络模式。其中状态3是出现频率最高的脑网络连接模式，表现为脑网络内部及网络间广泛存在的弱连接。该模式被定义为稀疏连接状态，其本质反映了大脑的基线连接模式——即整合了其他出现频率较低或特征不显著的瞬态连接状态^{[16, 17, 18, 19]}。现有研究表明，该状态与自我参照思维及困倦感密切相关^[20]，其稳定性较高，可能通过增强内感受意识同时降低警觉性来维持认知平衡^{[17, 21]}。值得注意的是，大量实证研究证实，无论是健康人群还是神经精神疾病患者（如帕金森病^{[11, 22]}、2型糖尿病^[19]、强迫症^[23]等），在静息状态下均表现出对该状态的显著偏好。我们的研究发现，状态3的平均滞留时间高于健康对照组，所以我们推测，锰暴露焊工长期处于单调重复的作业环境，可能更易进入这种低连接状态，从而表现为状态3的时间占比增高。这一现象既可能与职业环境所诱发的心智游移倾向有关，也可能与锰暴露人群大脑功能代偿性调节有关。

3.2 基于dFNC的锰暴露焊工脑动态网络特征异常

       本研究发现，在锰暴露焊工组中，状态1下SN-ECN的功能连接性降低，同时DMN-LAN的功能连接性也降低；状态2下，SN-DMN的功能连接性同样降低。既往研究表明，SN、ECN和DMN共同构成了与认知功能密切相关的核心脑网络^{[24, 25, 26]}。具体而言，SN作为大脑的调节器，主要负责监测新异刺激和情绪调节，并协调其他网络间的切换^[27]；ECN主导外源性认知控制，涉及工作记忆、注意力分配和执行功能；而DMN在静息状态下活跃，支持内源性思维、自我参照、记忆提取及未来规划等默认认知活动^[28]。因此，SN与ECN、DMN的连接减弱，可能反映了网络间协调与切换效率的受损。这种连接异常模式与多种神经疾病中观察到的网络失调具有相似性。例如，SN与DMN连接降低不仅是晚发性抑郁症患者认知下降的机制之一^[29]，也在轻度认知障碍患者中被发现，并被视为潜在的生物标志物^{[30, 31]}。此外，CHEN等^[32]的研究发现精神分裂症患者的SN与ECN之间的连接也发生异常。这表明，锰暴露可能通过损害SN的功能，破坏大脑在内部思维（DMN）与外部任务（ECN）之间灵活转换的能力，这一机制可能是多种认知障碍共有的病理通路。关于语言网络，其核心功能包括语言处理、语义理解和表达；尽管目前尚无直接证据探讨LAN与DMN间的功能连接性变化，但已有研究提示两者存在复杂相互作用，例如LAN异常可能与DMN失调协同影响认知功能^{[33, 34]}。因此，监测这些特定网络间的动态连接，有望为亚临床期识别锰暴露所致的脑功能损害提供可能的潜在影像学生物标志物，从而推动职业病临床诊断策略从传统症状依赖向客观影像定量评估转变。

       此外，我们发现锰暴露焊工较健康对照组表现出增高的转换次数，转换次数衡量的是大脑功能连接的整体动态灵活性和变异性，当其降低会导致大脑的活动模式变得“僵化”^[35]。既往研究表明，轻度认知障碍早期患者可能通过增强脑网络变异性，提升功能网络的灵活性与适应性，以代偿认知功能下降^{[36, 37]}。这种机制可视为大脑应对神经损伤的保护性代偿策略。因此，该结果提示锰暴露焊工可能存在一种通过脑网络功能连接的优化与重组来维持正常认知功能的神经可塑性机制。

3.3 基于相关分析的锰暴露焊工dFNC指标与临床特征的关联

       在相关性分析中，本研究并未发现MDT、FT以及NT与尿锰值、锰暴露年限之间存在显著相关性，可能是由于本研究纳入的被试是长期慢性锰暴露焊工，其尿锰值均处于正常范围内。值得注意的是，焊接烟尘中的锰微粒可通过嗅神经直接转运入脑，绕过了体循环和肾脏排泄。这一途径可能导致“脑内负荷高而尿锰水平正常”的脱节现象^{[38, 39]}。未来我们将纳入大量锰中毒患者，并结合神经心理学量表、血锰指标等多模态数据进行分析，深化锰中毒神经机制与临床表征的相关性，以提高本研究的科学价值。

3.4 局限性

       本研究仍存在一定的局限性。首先，样本规模相对有限，基于当前数据得出的统计结果论证力度有限，未来将进一步扩大样本量以验证我们的结论。其次，本研究为横断面设计，在阐述疾病病程对脑功能动态变异性影响的方面尚不充分。后续研究将通过更为精细的亚组分析和纵向追踪设计，深入探讨其动态规律及潜在机制。

4 结论

       本研究基于独立成分分析，发现与认知相关的脑网络存在动态功能连接异常，这可能成为识别锰暴露相关神经功能损害的潜在生物标志物。本研究属于初步探索，未来将在扩大样本、多中心研究中对该标志物进行标准化与验证。我们期望，基于此类无创、客观的影像指标，能够构建一个适用于基层职业健康监护场景的早期预警模型，推动职业锰暴露评估从传统生化监测向无创性的影像生物标志物转变，从而为高危人群的早期识别与干预提供参考依据。