0 引言

       急性缺血性脑卒中是全球致残的首要病因之一^{[1, 2]}。尽管溶栓和机械取栓等再灌注疗法可恢复血流^[3]，但超过60%的幸存者仍遗留严重神经功能缺损，主要归因于缺血再灌注损伤诱导的氧化应激和神经炎症^{[4, 5, 6]}。

       神经炎症在缺血损伤后迅速启动^[7]，活化的小胶质细胞分泌炎性介质破坏血脑屏障^{[8, 9]}。随后外周免疫细胞浸润脑实质，导致继发性损伤和神经功能恶化^[10]。巨噬细胞是脑卒中缺血损伤的重要参与者^{[11, 12, 13]}，因此，对其进行精准可视化，并对其介导的炎症反应进行干预，有助于预测脑卒中预后，调整治疗策略。然而，目前临床常规影像学主要反映脑组织结构和灌注改变，尚难对卒中后神经炎症及炎症细胞的病灶富集进行在体评价。

       分子影像学为神经炎症的在体无创监测提供了新的技术手段^{[14, 15]}。目前已开发的炎症靶向探针包括过氧亚硝酸盐响应性探针^[16]、过氧化氢敏感探针^[17]及低密度脂蛋白受体相关蛋白-1靶向纳米粒^[18]等用于炎症成像，然而，现有研究多侧重于炎症诊断，如在缺血性脑卒中领域，兼具特定炎症细胞示踪和局部抗炎治疗功能的诊疗一体化探针报道较少。在多种分子影像技术中，磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）细胞示踪可通过磁性纳米颗粒标记特定细胞，在体显示其在目标区域的分布和富集^[19]，为评价巨噬细胞在炎症病灶中的募集提供新的影像学方法。MRI具有无电离辐射、高空间分辨率及多参数成像等优势，在细胞示踪中具有独特价值^[20]。超小超顺磁性氧化铁（ultrasmall superparamagnetic iron oxide, USPIO）纳米粒子作为T2阴性对比剂，已广泛用于细胞示踪^{[21, 22]}。

       沸石咪唑酯框架-8（zeolitic imidazolate framework-8, ZIF-8）具有pH敏感降解特性，可在酸性环境中响应性释放药物^{[23, 24, 25]}。米诺环素作为一种四环素类抗生素，除抗菌作用外，还具有多靶点神经抗炎效应^{[26, 27]}。且米诺环素的临床疗效也已经得到证实^[28]。然而，游离米诺环素不具备对缺血炎症病灶的主动靶向及微环境响应性释放能力，其在病灶区域的选择性富集和局部可控递送仍受到限制。

       基于此，本研究将米诺环素与USPIO共载于ZIF-8中，在此基础上，进一步利用巨噬细胞对缺血炎症区域的天然趋化能力，将载有米诺环素和USPIO的ZIF-8与巨噬细胞共孵育构建炎症靶向MRI探针（MA@Z-UMino）[其中MA表示巨噬细胞（macrophage）]，从而实现卒中后神经炎症的靶向可视化与同步抗炎干预。本研究评估其对小鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R）模型神经炎症中巨噬细胞的MRI示踪能力及靶向治疗效果，以期为缺血性脑卒中的精准诊疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物

       选择8~9周雄性C57BL/6小鼠100只，体质量23~25 g。其中，C57BL/6小鼠采用随机数字表法进行分组。首先对所有小鼠进行唯一编号，随机选取随机数字表中的起始位置并按固定方向依次读取数字，根据预先设定的各组样本量进行分配。分为正常对照组（n=10）和手术组（n=90）。手术组进一步分为假手术组（n=10）和MCAO/R模型组（n=80）。动物来源均为江苏集萃药康生物科技股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（苏）2023-0009。所有小鼠饲养于12 h光暗循环，温度控制在20~25 ℃，相对湿度维持在50%~60%，自由获取无菌饲料和水。本研究获得复旦大学实验动物科学部动物福利和伦理小组批准，伦理批准号为202205015S。本研究的样本量设计遵循3R原则（减少、优化、替代），并参考领域内及本课题组既往基础实验研究的标准方案^{[29, 30, 31]}。

       本研究以Z-UMino组与MA@Z-UMino组T2WI上梗死侧脑组织的信噪比（signal-to-noise ratio, SNR）下降率作为主要结局指标，根据前期预实验MRI数据，其中MA@Z-UMino组ΔSNR为32.69%±11.50%，Z-UMino组ΔSNR为13.23%±3.63%。考虑到效应量来源于小样本数据，采用小样本校正后的Hedges'g进行估算。Cohen's d=|均值1-均值2|/Spooled，Spooled（两组的合并标准差）=√[(SD1²+SD2²)/2]，Hedges'g=J×Cohen's d，J=1-3/(4×df-1)。经小样本校正后，Hedges'g约为2.19。样本量采用GPower软件计算，设定双侧检验，α=0.05，1-β=0.80，组间分配比例为1∶1，计算得到每组最小样本量约为5只。考虑到动物死亡和个体差异，最终每组纳入10只小鼠。本研究于2024年10月至2025年10月在复旦大学附属华山医院完成纳米探针制备、MRI扫描及数据分析、动物模型构建、行为学实验及组织学检测。

1.2 纳米探针制备

       将FeCl3·6H2O（2.7 g）、油酸钠（9.13 g）、乙醇（20 mL）、水（15 mL）和己烷（35 mL）混合，70 ℃反应后得到油酸铁络合物。取1.8 g油酸铁络合物，与油胺（24 mL）和油酸（8 mL）经过分步回流反应，得到超顺磁性氧化铁（SPIO），冰丙酮沉淀后分散于氯仿中保存。SPIO经柠檬酸修饰后得到水分散性超小超顺磁性氧化铁（USPIO）。

       160 mg Zn(NO3)2·6H2O与20 mg米诺环素（Mino）溶于2 mL超纯水中，记为溶液A。2 g 2-甲基咪唑溶于10 mL超纯水中，记为溶液B。将0.4 mL（16 mg/mL）USPIO溶液与溶液A逐滴加至溶液B中反应，经离心洗涤和冷冻干燥后，得到ZIF-8共负载USPIO和米诺环素的纳米颗粒，记为Z-UMino。

       在制备MA@Z-UMino前，对巨噬细胞（RAW 264.7）的培养状态进行评估。RAW 264.7细胞在显微镜下贴壁良好、形态完整、增殖状态稳定，未见明显细胞死亡或污染，表明其适合作为活细胞载体用于Z-UMino的负载。将巨噬细胞（RAW 264.7）接种在12孔板中，细胞贴壁后加入Z-UMino（100 μg/mL），与巨噬细胞共孵育2 h，孵育结束后用PBS洗涤3次以去除未被摄取的纳米颗粒，制得炎症靶向探针MA@Z-UMino，现用现配。巨噬细胞对Z-UMino中Fe的摄取效率约为14.3%。后续实验所用的MA@Z-UMino给药剂量为1×10⁶ cells/100 μL。

1.3 表征及体外成像

       透射电子显微镜（JEM-F200，JEOL）观察Z-UMino的形态。扫描电子显微镜（GeminiSEM 300）观察MA@Z-UMino的形态。纳米粒度电位仪（Malvern Zetasizer Nano ZS90）测量Z-UMino的水合粒径和Zeta电位。

       3.0 T磁共振扫描仪（uMR870，上海联影）测量Z-UMino的弛豫性能。将其配制成不同铁浓度的等体积溶液，纯水作为空白对照，获得T1 mapping、T2 mapping数据，铁浓度为横坐标，R1（1/T1）和R2（1/T2）为纵坐标进行线性拟合计算斜率r1、r2。采用T1加权成像（T1-weighted imaging, T1WI）和T2加权成像（T2-weighted imaging, T2WI）序列获得相应图像。

       T1WI：TR 499.0 ms，TE 24.9 ms，视野150 mm×150 mm，矩阵144×144，层厚1.0 mm，层间距0.0 mm；T2WI：TR 3703.0 ms，TE 92.6 ms，视野150 mm×150 mm，矩阵144×144，层厚1.0 mm，层间距0.0 mm；T1 mapping：TR 10 000 ms，TE 11.5 ms，反转时间（inversion time, TI）25、50、100、150、250、400、700、1000、1500、2000、2500 ms，视野150 mm×150 mm，矩阵144×144，层厚1.0 mm，层间距0.0 mm；T2 mapping：TR 2 355.0 ms，TE 15.2、30.4、45.6、60.8、76.0、91.2、106.4、121.6 ms，视野150 mm×150 mm，矩阵144×144，层厚1.0 mm，层间距0.0 mm。同样地，巨噬细胞和不同铁浓度的Z-UMino孵育后进行T2WI扫描。

1.4 细胞实验

       采用细胞增殖与毒性检测法检测Z-UMino对RAW 264.7的细胞毒性。探针浓度为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 µg/mL。每组设6个复孔。

       酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒检测Z-UMino处理后巨噬细胞分泌的精氨酸酶-1（Arginase-1, Arg-1）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）水平（MM-44685M2；MM-0135M2，江苏，中国）。设巨噬细胞组（n=5）和MA@Z-UMino组（n=5）。

       采用transwell共培养体系评价MA@Z-UMino对氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）损伤的神经元（PC12）细胞的保护作用。并检测细胞活性、白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）以及B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白表达。

1.5 MCAO/R模型构建

       选取8~9周23~25 g的C57BL/6雄鼠，注射三溴乙醇（1.25%）麻醉小鼠，分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。结扎左侧颈总动脉和颈外动脉，在颈总动脉远端剪一小口。经切口插入线栓至颈内动脉。闭塞60 min后拔出线栓恢复灌注。

1.6 体内MRI

       随机数字表将MCAO/R小鼠分为Z-UMino组和MA@Z-UMino组，各10只。两组均经尾静脉注射100 μL探针，并按照相同的外源性Fe总量进行给药。具体而言，Z-UMino组注射浓度为142.5 μg/mL，Z-UMino中Fe的质量分数约为4.21%，对应外源性Fe约0.60 μg/只。MA@Z-UMino组每只小鼠注射1×10⁶个负载Z-UMino的巨噬细胞，与Z-UMino共孵育后，单个细胞Fe负载量为0.60 pg Fe/cell，对应外源性Fe约0.60 μg/只。按照小鼠体质量25 g计算，两组给药剂量为0.024 mg Fe/kg。于注射前及注射后0.5、1、2 h行3.0 T MRI T2WI扫描。参数如下：TR 2612 ms，TE 86.7 ms，层厚2.0 mm，层间距0.1 mm，视野30 mm×30 mm，图像矩阵144×144。完成2 h末次扫描后立即处死取脑，用于后续普鲁士蓝染色和免疫荧光染色的组织学分析。体外MRI扫描用于评价探针的基本T2对比能力，体内MRI扫描用于比较不同处理组在相同扫描参数下的病灶侧脑组织信号变化。由于体外和体内成像环境不同，体外MRI结果不作为体内成像效果的直接定量外推依据。

       标准化采集T2WI图像后，采用RadiAnt DICOM Viewer（2025.1）软件，平扫及注射后0.5 h、1 h和2 h图像首先根据脑室等解剖标志进行层面匹配，确保同一只小鼠不同时间点选取相同或尽可能一致的解剖层面，感兴趣区（region of interest, ROI）的界定参照小鼠脑解剖结构，由两名具有5年影像诊断经验的放射科副主任医师在不知晓动物分组的情况下独立勾画。整个图像分析过程中评价者均对实验分组设盲，并采用统一的层面选择、ROI勾画及信号测量标准，以减少观察者偏倚和测量偏倚。在平扫、注射后0.5 h、1 h和2 h图像的对应解剖位置勾画ROI。ROI尽可能覆盖具有代表性的病灶区域，同时避开脑室、脑沟及图像伪影，以减少非病灶组织对信号测量的影响。对于同一只小鼠，各时间点ROI的位置、形状及面积保持一致。记录ROI信号强度（signal intensity, SI）。同时，于同层面邻近均匀肌肉组织内勾画ROI，其信号强度标准差（standard deviation, SD）作为噪声估计。计算病灶区脑组织的信噪比：SNR=SI病灶/SD肌肉，并计算信噪比下降率（ΔSNR）：ΔSNR=（SNR注射前-SNR注射后）/SNR注射前×100%。各时间点最终测量值取两名评价者测量结果的平均值用于后续统计分析。

1.7 组织学与治疗评价

       采用普鲁士蓝染色观察脑组织内的氧化铁纳米颗粒，免疫荧光染色用于定位MA@Z-UMino。

       为评价MA@Z-UMino的治疗效果，并排除游离米诺环素及单纯巨噬细胞载体本身的影响，实验小鼠通过随机数字表法被分为对照组、假手术组（Sham）、ZIF-8负载USPIO组（Z-U）、游离米诺环素组（Mino）、单纯巨噬细胞组（MA）、Z-UMino组和MA@Z-UMino组，每组10只。给药24 h后各组小鼠进行TTC染色评估各组脑梗死情况，ImageJ软件测量水肿校正后梗死面积占比。给药72 h后评估脑组织主要炎症因子含量。此外，选取正常对照组、MCAO/R组、Z-U组、Z-UMino组和MA@Z-UMino组小鼠进行圆筒实验、旷场实验及Bederson评分观察小鼠行为学。实验结束后取脑，苏木精-伊红（H&E）染色评估组织损伤。TNF-α、白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、IL-10和Arg-1免疫组化染色评估炎症水平。TTC染色、行为学评分、H&E及免疫组化染色均由对实验分组设盲的研究人员完成，各组采用统一的图像采集和定量分析标准，以减少观察者偏倚和测量偏倚。

1.8 统计学分析

       所有数据均使用平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 9软件进行数据的可视化绘图。采用Shapiro-Wilk方法并结合Q-Q图检验数据正态性。对于符合正态分布且方差齐性的数据，两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，事后经Bonferroni校正。对于不符合正态分布的数据，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，并采用Dunn's法进行事后比较。P<0.050表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 炎症靶向分子探针的表征

       透射电镜图像显示Z-UMino为较规则的多面体结构，粒径约100 nm（图1A）。与巨噬细胞孵育后，细胞形态由规则圆形转变为吞噬激活状态，表面可见伪足（图1B）。Z-UMino水合粒径为（260.00±12.64）nm，Zeta电位为（19.83±0.61）mV（图1C）。进一步的体外释放实验表明，Z-UMino具有明显的酸响应释放行为。在pH=7.4条件下，米诺环素释放较为缓慢，24 h累计释放率为13.80%，而在pH=5.5条件下，米诺环素释放显著加快，24 h累计释放率达到62.42%，约为pH=7.4条件下的4.5倍（图1D），表明酸性环境可促进ZIF-8结构降解并触发药物释放。上述结果进一步证实了Z-UMino的pH响应性药物释放特性。

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图1  Z-UMino的形貌、理化性质及pH响应性释药特征与MA@Z-UMino的形貌表征。1A：Z-UMino的透射电镜图像。1B：未负载Z-UMino的巨噬细胞和MA@Z-UMino的扫描电镜图像。1C：Z-UMino的水合粒径和Zeta电位。1D：Z-UMino在不同pH条件下的米诺环素体外释放曲线。
Fig. 1  Morphology, physicochemical properties, pH-responsive drug release characteristics of Z-UMino, and morphology characterization of MA@Z-UMino. 1A: Transmission electron microscopy image of Z-UMino. 1B: Scanning electron microscopy images of macrophages without Z-UMino loading and MA@Z-UMino. 1C: Hydrated particle size and zeta potential of Z-UMino. 1D: In vitro minocycline release profiles of Z-UMino under different pH conditions.

2.2 细胞实验

       在12.5~200.0 μg/mL浓度范围内，巨噬细胞的细胞活性均高于80%，说明Z-UMino对巨噬细胞无明显毒性（图2A）。

       ELISA结果显示，MA@Z-UMino组Arg-1和TGF-β表达均高于单纯巨噬细胞组（1.97±0.33 vs. 1.13±0.12，P<0.001；199.70±56.84 vs. 125.10±27.77，P=0.030），差异具有统计学意义，提示Z-UMino可促进巨噬细胞向抗炎表型转变（图2B~2C）。

       PC12细胞与MA@Z-UMino共培养后，相比于其他对照组，PC12细胞活性最高（图2D）。IL-10分泌量增加，TNF-α分泌量减少（图2E~2F）。蛋白印迹结果（图3A~3B）显示，MA@Z-UMino处理上调了抗凋亡蛋白Bcl-2表达，下调了促凋亡蛋白Bax表达，提示其具有神经保护作用。

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图2  Z-UMino 对巨噬细胞的细胞毒性评估、促巨噬细胞抗炎表型极化作用及MA@Z-UMino 对OGD/R 损伤PC12 细胞的保护作用。2A：不同浓度Z-UMino与巨噬细胞共孵育后的细胞存活率。2B、2C：Z-UMino 与巨噬细胞共孵育后Arg-1 和TGF-β 的含量变化。2D：不同处理条件下PC12 细胞的细胞活性。2E、2F:不同处理条件下PC12 细胞IL-10 和TNF- α 的分泌量。Arg-1：精氨酸酶-1；TGF-β：转化生长因子-β；IL-10：白细胞介素-10；TNF-α：肿瘤坏死因子-α。
Fig. 2  Cytotoxicity and anti-inflammatory polarization effects of Z-UMino in macrophages, and the neuroprotective effect of MA@Z-UMino on OGD/R-injured PC12 cells. 2A: Viability of macrophages after incubation with different concentrations of Z-UMino. 2B and 2C: Arg-1 and TGF-β levels in macrophages after Z-UMino treatment. 2D: Viability of PC12 cells under different treatment conditions. 2E and 2F: IL-10 and TNF- α secretion by PC12 cells under different treatment conditions. Arg-1: arginase-1; TGF- β: transforming growth factor-β; IL-10: interleukin-10. TNF-α: tumor necrosis factor-α.

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图3  蛋白印迹及其统计图。3A：不同组Bax和Bcl-2表达的蛋白印迹图。3B：蛋白印迹测得的Bax和Bcl-2的定量统计图。Bax：Bcl-2相关X蛋白；Bcl-2：B细胞淋巴瘤-2。
Fig. 3  Western blots and their statistical plots. 3A: Western blot of Bax and Bcl-2 expression across different groups. 3B: Statistical plot of Bax and Bcl-2 measured by western blot. Bax: Bcl-2-associated X protein; Bcl-2: B-cell lymphoma-2.

2.3 体外MRI

       体外MRI结果显示，Z-UMino的r1=1.29 mM^-1s^-1，r2=17.08 mM^-1s^-1，r2/r1=13.24，表明Z-UMino具有良好的T2弛豫性能。T2WI及T2 mapping图像显示，随着铁浓度增加，Z-UMino信号逐渐减低（图4A~4C）。巨噬细胞摄取不同浓度Z-UMino后，其T2横向弛豫时间亦随铁浓度增加而缩短，表明MA@Z-UMino在体外仍保持良好的T2成像性能（图4D）。

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图4  体外MRI 结果。4A：等体积不同铁浓度的Z-UMino 的T1WI、T2WI、T1 mapping 和T2 mapping。4B：Z-UMino的T1 纵向弛豫率曲线。4C：Z-UMino的T2 横向弛豫率曲线。4D：巨噬细胞与不同浓度Z-UMino 共孵育后的T2 mapping。
Fig. 4  In vitro MRI results. 4A: T1WI, T2WI, T1 mapping and T2 mapping of Z-UMino at equal volumes with varying iron concentrations. 4B: T1 relaxivity curve of Z-UMino. 4C: T2 relaxivity curve of Z-UMino. 4D: T2 mapping of macrophages after incubation with different concentrations of Z-UMino.

2.4 体内MRI和组织学结果

       两名观察者对不同时间点病灶侧脑组织SNR测量结果一致性较好，ICC值为0.775~0.938。小鼠注射Z-UMino和MA@Z-UMino纳米探针后，梗死侧脑部信号强度均下降，基于T2WI的SNR半定量分析显示，与Z-UMino组（n=10）相比，MA@Z-UMino组（n=10）病灶区SNR下降率更高（2 h，31.24±9.30 vs. 15.88±6.79，P<0.001）（图5），提示MA@Z-UMino在梗死炎症区域的富集程度更高，出现更明显的T2WI低信号改变。

       普鲁士蓝染色显示MA@Z-UMino组脑部有明显蓝色铁颗粒沉积（图6），免疫荧光图像显示MA@Z-UMino和离子化钙结合适配分子1（Ionized calcium-binding adaptor molecule 1, Iba-1）标记的小胶质细胞共定位（图7）。共定位定量分析显示，MA@Z-UMino信号与Iba-1阳性区域的Pearson相关系数为0.63±0.11，Manders系数M1为0.80±0.17，M2为0.86±0.12，提示探针与活化小胶质细胞存在明确的空间共定位，表明MA@Z-UMino富集于梗死炎症区域。为进一步评价探针的体内分布情况，我们采用电感耦合等离子体发射光谱法（inductively coupled plasma optical emission spectroscopy, ICP-OES）检测给药后不同时间点主要器官中的Fe含量。结果显示，给药后2 h脑组织Fe含量较给药前有所升高，提示MA@Z-UMino可在一定时间内进入并滞留于脑组织（图8）。此外，MCAO/R后血脑屏障（blood brain barrier, BBB）通透性增加也可能在一定程度上促进纳米颗粒进入病灶区域。因此，MA@Z-UMino在梗死区域的富集可能由巨噬细胞炎症趋化以及BBB通透性增加共同影响。与游离Z-UMino相比，MA@Z-UMino表现出更强的病灶富集能力，提示巨噬细胞载体在提高炎症区域递送效率方面发挥了重要作用。

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图5  Z-UMino 和MA@Z-UMino 在MCAO/R小鼠中的体内T2 加权MRI 及病灶区信号变化。5A：小鼠注射Z-UMino 或MA@Z-UMino 前及注射后0.5、1、2 h 的磁共振图像，红圈示信号改变区域。5B：两组小鼠基于T2WI 图像的病灶侧SNR半定量分析图。5C：两组小鼠病灶侧SNR下降率随时间变化的折线图。ΔSNR=（SNR注射前−SNR注射后）/SNR注射前×100%。MCAO/R：大脑中动脉阻塞/再灌注；SNR：信噪比；ΔSNR：信噪比下降率。***表示P<0.001。
Fig. 5  In vivo T2-weighted MRI and quantitative analysis of signal intensity in the ischemic lesions of MCAO/R mice following administration of Z-UMino or MA@Z-UMino. 5A: MR images of mice before and at 0.5, 1, and 2 h after injection of Z-UMino or MA@Z-UMino. Red circles indicate regions of signal change. 5B: Semi-quantitative analysis of lesion-side SNR based on T2WI images in the two groups of mice. 5C: Analysis of the lesion-side SNR reduction rate in the two groups of mice. ΔSNR = (SNRpre-SNRpost)/SNRpre × 100%. MCAO/R: middle cerebral artery occlusion/reperfusion. SNR: signal-to-noise ratio; ΔSNR: SNR reduction rate. *** indicates P < 0.001.

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图6  两组小鼠脑组织普鲁士蓝染色结果。6A：Z-UMino组与MA@Z-UMino组脑组织普鲁士蓝染色结果的代表性图像。蓝色信号表示铁沉积，红色箭头标示普鲁士蓝阳性区域。比例尺：100 μm。6B：Z-UMino组与MA@Z-UMino组脑组织普鲁士蓝阳性面积百分比的定量分析。**表示P<0.010。
Fig. 6  Prussian blue staining in brain tissues from two groups of mice. 6A: Representative images of Prussian blue staining in brain tissues from the Z-UMino and MA@Z-UMino groups. Scale bar: 100 μm. Blue signals indicate iron deposition, and red arrows indicate Prussian blue-positive areas. 6B: Quantitative analysis of the percentage of Prussian blue-positive area in brain tissues from the Z-UMino and MA@Z-UMino groups. ** indicates P < 0.010.

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图7  MA@Z-UMino和小胶质细胞共定位的免疫荧光图片。代表性免疫荧光图像显示MA@Z-UMino在病灶侧脑组织中的分布及其与小胶质细胞的空间关系。蓝色为DAPI标记的细胞核，绿色为Iba-1阳性细胞，红色为MA@Z-UMino信号，黄色箭头标示MA@Z-UMino与Iba-1阳性细胞邻近区域。比例尺：50 μm。Iba-1表示离子化钙结合适配分子1，小胶质细胞的标志物。DAPI表示4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚，细胞核荧光染料。
Fig. 7  Immunofluorescence images of colocalization between MA@Z-UMino and microglia. Representative immunofluorescence images show the distribution of MA@Z-UMino in the ischemic brain tissue and its spatial relationship with microglia. Blue indicates DAPI-stained nuclei, green indicates Iba-1-positive cells, and red indicates MA@Z-UMino signals. Yellow arrows indicate regions where MA@Z-UMino is adjacent to Iba-1-positive cells. Scale bar: 50 μm. Iba-1 denotes ionized calcium-binding adaptor molecule 1, a marker of microglia. DAPI, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole, a fluorescent nuclear stain.

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图8  不同时间点小鼠主要器官中Fe含量分布。采用ICP-OES测定注射MA@Z-UMino后0 h和2 h心、肝、脾、肺、肾和脑组织中的Fe含量。ICP-OES：电感耦合等离子体发射光谱。
Fig. 8  Biodistribution of Fe in major organs of mice at different time points. Fe contents in the heart, liver, spleen, lung, kidney, and brain were measured by ICP-OES at 0 h and 2 h after administration. ICP-OES: inductively coupled plasma optical emission spectrometry.

2.5 体内治疗效果

2.5.1 MA@Z-UMino减小脑梗死面积并调节炎症因子水平

       TTC染色结果显示，Sham组未见明显脑梗死灶。与MCAO/R组相比，MA组和Mino组脑梗死面积虽有一定程度的减小，但未达到与MA@Z-UMino组相当的水平，相比之下，MA@Z-UMino组表现出更显著的梗死面积减少，明显小于MCAO/R组（15.72±4.78 vs. 36.42±5.49，P<0.001）（图9）。

       炎症因子检测结果进一步显示，MCAO/R组脑组织中促炎因子IL-6水平明显升高，而抗炎因子IL-10水平降低（图10）。与MCAO/R组相比，Mino组、Z-U组、Z-UMino组、MA组及MA@Z-UMino组IL-6水平均有不同程度下降，其中MA@Z-UMino组下降更为明显；同时，MA@Z-UMino组相比于各治疗组表现出较高的IL-10表达水平。这些结果提示，MA@Z-UMino的治疗效应并非单纯来源于巨噬细胞载体本身或游离米诺环素，而更可能与递送系统各组成部分的协同作用有关。

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图9  TTC 染色及其统计图。9A：不同处理组小鼠脑组织的TTC 染色图。9B：各组小鼠水肿校正后脑梗死面积占比的定量分析。TTC 表示2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑，常用于脑梗死组织染色。** 表示P<0.010，*** 表示P<0.001。MCAO/R：左侧大脑中动脉闭塞/再灌注。
Fig. 9  TTC staining and the corresponding statistical graph. 9A: TTC staining images of brain tissues from different treatment groups of mice. 9B: Quantitative analysis of the edema-corrected infarct area percentage in each group. TTC denotes 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride, which is commonly used for staining cerebral infarct tissue. ** indicates P < 0.010, *** indicates P < 0.001. MCAO/R: middle cerebral artery occlusion/reperfusion.

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图10  炎症因子表达水平。10A：不同处理组小鼠脑组织的IL-6水平。10B：不同处理组小鼠脑组织的IL-10水平。***表示P<0.001。IL-6：白细胞介素-6；MCAO/R：左侧大脑中动脉闭塞/再灌注。
Fig. 10  Expression levels of inflammatory cytokines. 10A: IL-6 levels in brain tissues of mice from different treatment groups. 10B: IL-10 levels in brain tissues of mice from different treatment groups. *** indicates P < 0.001. IL-6: interleukin-6; MCAO/R: middle cerebral artery occlusion/reperfusion.

2.5.2 MA@Z-UMino减轻脑组织病理损伤和神经炎症

       根据前述TTC染色和炎症因子检测的全分组比较结果，单纯巨噬细胞组和游离米诺环素组的改善作用均弱于MA@Z-UMino组。为进一步比较材料载体、药物负载纳米颗粒及巨噬细胞介导递送对组织病理损伤和神经功能的影响，我们选取了正常对照组、MCAO/R组、Z-U组、Z-UMino组和MA@Z-UMino组进行组织学评价和行为学评价。H&E染色显示MA@Z-UMino可减轻神经元损伤（图11）。免疫组化结果显示，MA@Z-UMino可降低TNF-α和IL-6表达，提高IL-10和Arg-1表达（图12），表明MA@Z-UMino一定程度上缓解了脑卒中后的神经炎症。

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图11  H&E 染色及坏死细胞定量分析。11A：小鼠脑组织的H&E 染色图。上排为脑组织低倍图像，用于显示整体病灶区域。红框及虚线标示高倍观察区域。下排为病灶侧脑组织对应区域的高倍图像，用于观察细胞形态学改变。比例尺：上排为1 mm；下排为50 μm。11B：各组小鼠脑组织坏死细胞数目的定量分析。*表示P<0.050，***表示P<0.001。MCAO/R：左侧大脑中动脉闭塞/再灌注。
Fig. 11  H&E staining and quantitative analysis of necrotic cells. 11A: H&E staining of mouse brain tissue. The upper row shows low-magnification images of brain tissues to display the overall lesion area. The red boxes and dashed lines indicate the regions selected for high-magnification observation. The lower row shows corresponding high-magnification images of the lesion-side brain tissue for evaluating cellular morphological changes. Scale bars: upper row, 1 mm; lower row, 50 μm. 11B: Quantitative analysis of the number of necrotic cells. * indicates P < 0.050, *** indicates P < 0.001. MCAO/R: middle cerebral artery occlusion/reperfusion.

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图12  不同处理组小鼠脑组织炎症相关因子表达。12A: 小鼠脑组织Arg-1、TNF-α、IL-10及IL-6的免疫组化图。棕黄色信号表示相应蛋白阳性表达，比例尺：100 μm。12B：Arg-1、TNF-α、IL-10和IL-6相对表达量。**表示P<0.010，***表示P<0.001。MCAO/R：左侧大脑中动脉闭塞/再灌注。
Fig.12  Expression of inflammation-related factors in the brain tissue of mice from different treatment groups. 12A: Immunohistochemical images of Arg-1, TNF-α, IL-10, and IL-6 in brain tissues from mice. Brownish-yellow staining indicates positive expression of the corresponding protein. Scale bar: 100 μm. 12B: Relative expression levels of Arg-1, TNF-α, IL-10, and IL-6. ** indicates P < 0.010, *** indicates P < 0.001. MCAO/R: middle cerebral artery occlusion/reperfusion.

2.5.3 MA@Z-UMino改善MCAO/R小鼠神经功能

       通过进一步的行为学评价发现，MCAO/R组小鼠Bederson评分明显升高，提示出现显著神经功能缺损，经MA@Z-UMino治疗后，Bederson评分较MCAO/R组明显降低，且较Z-UMino组进一步下降，提示MA@Z-UMino可改善MCAO/R后神经功能损伤（图13A）。圆筒实验结果显示，MCAO/R组小鼠前肢使用不对称率明显升高，提示存在明显偏瘫样运动功能障碍，MA@Z-UMino处理后前肢使用不对称率显著降低（P<0.001），表明MA@Z-UMino能够改善MCAO/R小鼠的肢体运动协调功能（图13B）。此外，旷场实验显示，MA@Z-UMino组小鼠运动距离较MCAO/R组明显增加（27.07±2.96 vs. 7.71±2.33，P<0.001），提示神经功能得到改善（图14）。

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图13  不同处理组小鼠神经功能及前肢运动协调性评估。13A：不同处理组小鼠的Bederson评分。13B：不同处理组小鼠圆筒实验中前肢使用不对称率。*表示P<0.050，***表示P<0.001。MCAO/R：左侧大脑中动脉闭塞/再灌注。
Fig.13  Assessment of neurological function and forelimb motor coordination of mice from different treatment groups. 13A: Bederson scores of mice in different treatment groups. 13B: Forelimb use asymmetry in the cylinder test among mice from different treatment groups. * indicates P < 0.050, *** indicates P < 0.001. MCAO/R: middle cerebral artery occlusion/reperfusion.

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图14  行为学实验。14A：小鼠在旷场实验中的代表性运动轨迹图。14B：小鼠在旷场实验中的总运动距离。***表示P<0.001。MCAO/R：左侧大脑中动脉闭塞/再灌注。
Fig. 14  Behavioral experiments. 14A: Representative movement trajectories of mice in the open field test. 14B: Total distance of mice in the open field test. *** indicates P < 0.001. MCAO/R: middle cerebral artery occlusion/reperfusion.

3 讨论

       本研究采用基于巨噬细胞炎症趋化的MRI示踪与靶向治疗策略，将巨噬细胞和负载USPIO和米诺环素的ZIF-8纳米颗粒共孵育，构建了兼具炎症靶向、MRI示踪和神经保护功能的MRI诊疗探针MA@Z-UMino，并在小鼠大脑中动脉阻塞/再灌注模型中评价其体内炎症靶向、MRI示踪及神经保护效应。结果显示，MA@Z-UMino可在缺血再灌注后的炎症病灶区域选择性富集，实现对巨噬细胞的体内MRI示踪。同时，MA@Z-UMino可减少脑梗死面积、改善神经功能并调节炎症相关因子表达。本研究的主要创新在于通过负载Z-UMino对巨噬细胞进行功能化改造，将巨噬细胞的天然炎症趋化能力、USPIO的MRI示踪功能及米诺环素的抗炎治疗作用整合于同一活细胞诊疗载体，实现卒中后炎症的靶向可视化与同步干预，具有重要的临床转化价值。该策略为缺血性卒中神经炎症的早期识别、靶向治疗及疗效监测提供了新的实验依据和潜在转化路径。

3.1 选择巨噬细胞作为探针载体

       健康脑组织中几乎不存在外周巨噬细胞，卒中后炎症因子可招募巨噬细胞进入脑组织，因此巨噬细胞具备天然炎症趋向性和跨血脑屏障能力，可作为理想载体^[6]。这一过程与其表面黏附分子及趋化因子的表达密切相关^{[32, 33]}。本研究结果显示，MA@Z-UMino可在炎症区域富集，说明其成功利用了巨噬细胞的炎症靶向特性。

3.2 评价MA@Z-UMino作为炎症靶向探针和阴性对比剂

       MRI细胞跟踪已成为监测细胞在体内分布的重要方法^{[19, 20, 34]}。已有研究表明，SPIO具有良好的生物相容性，被广泛用于构建新型MRI探针^{[14, 35, 36]}。本研究中，USPIO被装载于ZIF-8进入细胞后发生胞内聚集，进一步增强了T2成像效应。MA@Z-UMino横向弛豫率达17.08 mM^-1s^-1。与被动富集的Z-UMino相比，MA@Z-UMino能有效响应炎症趋化信号并定向迁移至梗死区，在2 h表现出显著的MRI信号变化，NAN等^[29]制备的钆基探针在卒中后6 h仍能检测到MRI信号，这种差异可能与两者成像机制不同有关。钆基探针多依赖细胞内吞产生较长信号持续时间，本研究依赖巨噬细胞主动靶向实现病灶早期富集，且铁基探针的信号易受局部微环境变化影响。

       在本研究中，MA@Z-UMino给药后2 h可在病灶侧脑组织引起明显T2WI信号降低。脑缺血再灌注早期，病灶区域可迅速启动炎症级联反应，包括血脑屏障通透性增加、血管内皮细胞激活、局部血流动力学改变以及黏附分子上调。活化内皮细胞表达的细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）、P-选择素等黏附分子可促进巨噬细胞/单核细胞在炎症血管床中的滚动、黏附和滞留。与此同时，USPIO具有较强的T2磁敏感效应，少量局部富集即可引起明显的SNR下降^[37]。因此，2 h时观察到的最低SNR更可能反映炎症血管黏附、血管周围滞留以及部分进入病灶区域等多种过程的共同贡献，不完全代表外周巨噬细胞脑实质浸润已达到峰值。

3.3 炎症靶向MRI探针的临床价值

       本研究表明，动态追踪巨噬细胞并实现神经保护具有可行性，有助于神经炎症部位的可视化，并为急性卒中的早期预后评估提供客观影像学指标。卒中后24~72 h内的神经炎症影像特征与神经功能恢复、脑水肿进展及远期认知障碍风险密切相关^{[38, 39]}。同时，探针携带的米诺环素可使巨噬细胞变为修复表型，发挥抗炎和神经保护作用。这项研究实现了成像与治疗的一体化，为神经炎症疾病的精准诊治提供了新思路。

3.4 研究的局限性

       首先，本研究样本量有限，后续研究需扩大样本规模以增强结论的稳健性。其次，本研究尚未获得质量可靠的体内T2 mapping定量数据，后续研究将进一步优化小动物MRI扫描条件，包括采用更高场强小动物MRI系统以及优化的T2 mapping序列，以获得更可靠的定量影像学指标。此外，本研究仅观察了给药后2 h的早期体内分布，尚缺乏探针的长期代谢动力学数据，后续研究应延长观察时间窗以明确其清除规律。本研究的行为学观察时间亦较短，缺乏对远期神经功能恢复的评价，后续应延长观察时间并开展长期疗效研究。最后，探针的体内细胞命运和长期安全性尚需进一步研究，以支持后续临床转化。

4 结论

       综上所述，本研究在MCAO/R小鼠模型中成功构建了炎症靶向探针MA@Z-UMino，该探针具有良好的生物活性和T2成像性能。可在体动态追踪巨噬细胞，可视化巨噬细胞分布，有利于小鼠卒中后神经炎症的无创监测。此外，MA@Z-UMino可以发挥神经保护作用，为缺血性脑卒中炎症靶向成像与治疗提供了动物实验依据，具有一定的潜在临床转化价值。