0 引言

       阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是最常见的神经退行性疾病，以进行性认知功能衰退、突触丢失、神经元死亡和脑结构萎缩为核心病理特征^{[1, 2, 3, 4, 5]}。随着全球人口老龄化进程加速，AD的患病率持续攀升，已成为严重威胁老年人健康和生活质量的重大公共卫生问题^{[6, 7, 8]}。然而，AD的发病机制尚未完全阐明，现有诊疗手段仍难以实现早期精准诊断和有效干预。因此，深入解析AD的神经病理改变及其分子调控机制，对于发现疾病本质、寻找潜在的早期生物标志物及候选靶点具有重要意义。

       结构MRI可无创、活体地量化脑灰质体积（gray matter volume, GMV），是目前反映AD相关神经元丢失与脑结构退行性改变最稳定的影像学标记之一^{[9, 10, 11]}。基于体素的形态学测量（voxel-based morphometry, VBM）方法能够对全脑灰质进行体素水平的定量分析，客观评估局部GMV的组间差异^{[12, 13, 14, 15]}。大量VBM研究已证实，AD患者表现为以海马、颞叶、顶叶、后扣带回等区域为主的进行性脑灰质萎缩，且萎缩程度与认知损害程度及疾病进展密切相关^{[16, 17, 18]}。然而，传统VBM研究多局限于影像表型的描述性分析，难以解释这些结构改变的分子生物学基础。

       近年来，影像转录组学的兴起为破解“脑影像表型–基因表达”关联提供了新的研究范式^{[19, 20, 21]}。Allen人脑基因图谱（Allen Human Brain Atlas）提供了全脑范围的基因表达谱数据，使得将脑区特异性基因表达信息与影像学改变进行跨模态整合成为可能^{[22, 23]}。偏最小二乘（partial least squares, PLS）回归作为一种高维多变量统计方法，能够有效挖掘影像数据与全基因组表达数据之间的潜在协变模式，在神经精神疾病多组学研究中展现出独特优势^{[24, 25]}。目前，已有研究尝试将该方法应用于AD、精神分裂症、抑郁症等疾病，成功识别出与脑结构改变显著相关的基因表达特征及生物学通路^{[26, 27]}。

       近年来已有多项影像转录组研究基于Allen人脑基因图谱解析AD脑结构退变的分子机制^{[19, 22]}，但此类研究多采用Pearson相关、单变量空间相关等方法，仅能分析单个基因与脑影像指标的独立关联，难以系统挖掘全基因组多基因协同调控脑萎缩的成套表达特征，易受基因多重共线性、脑区空间自相关干扰，难以完整阐释不同脑区萎缩异质性对应的分子通路网络，研究视角存在明显局限。

       本研究以AD患者和健康对照（healthy control, HC）为研究对象，采用VBM方法系统评估两组间的全脑GMV差异，应用CAT12工具箱提取各脑区GMV，并通过独立样本t检验获取组间差异统计量t值。将GMV差异t值与Allen人脑基因图谱进行PLS关联分析，根据基因权重对全基因组进行排序，筛选权重排名前500的正权重基因与负权重基因并完成功能富集解析。本研究旨在明确AD特征性灰质萎缩受累脑区，在全基因组范围内筛选与脑萎缩模式关联的关键基因，挖掘介导AD脑结构损伤的核心生物学通路，为阐释AD脑结构退变的分子机制提供影像转录组学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       本研究数据来源于国际阿尔茨海默病神经影像学倡议（Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative, ADNI）公共开放数据库（https://adni.loni.usc.edu/）。本研究基于ADNI公开数据库进行二次分析，原始数据采集经各参与中心伦理委员会批准，遵循《赫尔辛基宣言》，所有受试者均签署知情同意书。从ADNI数据库中分别按以下标准连续筛选受试者。AD组纳入标准：符合1984版美国国立神经疾病与沟通障碍和卒中研究所及阿尔茨海默病及相关疾病协会联合发布的很可能阿尔茨海默病临床诊断规范，年龄60~75岁，该年龄区间针对晚发型AD设置，规避60岁以下早发型AD遗传异质性，同时减少75岁以上高龄人群共病、生理性脑老化带来的混杂干扰，匹配ADNI数据库样本年龄分布特征。HC组纳入标准：年龄、性别与AD组进行严格匹配，不存在认知功能损伤，且无各类神经系统器质性病变。两组受试者统一执行相同排除条件：头颅磁共振图像存在明显伪影；既往有颅脑外伤病史；经汉密尔顿抑郁量表、汉密尔顿焦虑量表、简明精神病评定量表评估，确诊合并中重度抑郁、广泛性焦虑、精神分裂症等独立精神疾病者予以排除；仅由AD继发轻度情绪低落、量表未达到精神疾病诊断阈值的受试者不做剔除；影像后处理完成后，图像CAT12内置综合质控评分<80分（该评分包含图像均匀度、脑组织分割完整性、颅骨剥离精度、图像噪声4个评价维度，总分0~100分）。受试者分组完全依据ADNI数据库原始临床评估结果划分，采用连续筛选方式入组。ADNI数据库同步收录Aβ、tau相关病理生物标志物检测结果，但本研究仅利用结构MRI GMV数据开展分析，未将Aβ、tau生物标志物纳入分组及后续统计分析。从ADNI数据库连续调取192例年龄60~75岁、同时具备完整T1结构MRI与全套临床量表数据的候选受试者，由陕西中医药大学附属医院影像科两名从业5年以上、具备丰富神经影像诊断经验的主治医师双盲独立开展，第一阶段剔除存在颅脑外伤、确诊精神疾病者76例，第二阶段剔除MRI图像伪影明显、图像质控评分未达标的受试者53例，针对评估结果存在分歧的影像图像，由两名医师共同复核讨论，最终形成统一判定结论。

1.2 临床数据采集

       本研究对所有受试者的临床相关数据进行系统收集，包括人口统计学资料（年龄、性别及受教育年限），同时采用简易精神状态检查量表（Mini-Mental State Examination, MMSE）对受试者的整体认知功能进行量化评定，通过临床痴呆评定量表（Clinical Dementia Rating, CDR）对痴呆严重程度进行量化评估。

1.3 影像数据获取

       本研究采用配备Tim技术头部线圈的1.5 T Avanto磁共振扫描仪（Siemens Healthineers, Germany），对受试者全脑结构信息进行采集，获取基于磁化准备快速梯度回波（magnetization-prepared rapid gradient-echo, MPRAGE）脉冲序列的T1加权成像数据。具体扫描参数设置如下：TR 2400 ms，TE 3.5 ms，矩阵256×256，翻转角度8°，体素大小1 mm×1 mm×1 mm，扫描层数共192层，层厚1 mm。

1.4 数据处理及统计学分析

1.4.1 MRI数据预处理及VBM分析

       本研究获取的3D高分辨率T1结构磁共振图像，借助MATLAB R2022b运行平台，结合统计参数图软件工具包SPM12（https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm12/）与基于体素的形态测量工具箱CAT12（http://www.neuro.unijena.de/cat）完成数据处理。预处理流程首先通过CAT12工具箱对数据进行空间标准化，将所有受试者的脑结构图像配准至蒙特利尔神经学研究所（Montreal Institute of Neurology, MNI）标准坐标系，以此消除个体间大脑形态及空间位置差异引发的系统偏差。后续进行组织分割处理，分离出灰质、白质与脑脊液三种脑内组织成分，分割完成后依托CAT12自带图像质量评分（image quality rating, IQR）异常值评分开展脑组织分割质量核查；图像质控由2名从事神经影像诊断5年以上主治医师采用双盲法独立阅片，采用Kappa检验评价两人判读一致性，Kappa>0.85为一致性良好。IQR数值异常、分割轮廓明显偏离正常脑解剖结构的图像予以剔除，两人评估分歧图像共同复核达成统一结论，仅保留分割合格样本进入后续平滑与统计分析；对标准化后的灰质图像进行体积调制，消除空间配准拉伸/压缩带来的体积偏差，保留脑组织原始体积定量信息；随后对分割后的灰质图像进行空间平滑处理，采用8 mm半高全宽（full width at half maximum, FWHM）高斯核开展空间平滑，进而提升图像信噪比、降低残留的个体解剖结构差异，同时满足高斯随机场理论的统计前提要求。

       图像预处理完成后进行统计分析，利用SPM12工具包构建一般线性模型，采用两样本t检验对比HC组与AD组之间的GMV组间差异。将年龄、性别、受教育年限及颅内总体积（total intracranial volume, TIV）纳入协变量，以控制其对统计结果的干扰。为减少预处理过程中可能产生的边缘伪影及极低概率体素对分析结果的影响，设置体素灰度绝对阈值为0.2进行掩膜处理。本阶段分析的目的是检测AD患者GMV的异常变化，首先在体素水平采用家族错误率（family wise error, FWE）校正方法对全脑体素进行多重比较校正，以FWE校正后P<0.05作为初步显著性判定标准，筛选出潜在的显著差异体素；多重比较校正环节启用非平稳团块校正，以消除不同脑区解剖异质性带来的统计不均衡；再设定最小团块阈值k>100个体素，基于该阈值开展团块水平经错误发现率（false discovery rate, FDR）校正进行二次筛选；最终，仅保留同时通过体素水平与团块水平校正的连续体素显著簇，将其定义为差异具有统计学意义的灰质差异脑区。在每个显著簇中，通常可识别出一个统计值最高的峰值点，将该峰值点坐标映射至MNI标准脑空间，即可定位并确定GMV改变的核心脑区。所有统计结果的展示与后续分析均采用xjview软件完成（http://www.alivelearn.net/xjview/），脑区解剖定位同样由上述2名医师采用双盲法独立判读，Kappa>0.85为一致性良好，双人判读不一致的团块坐标经共同核对MNI标准模板统一校正，其中体积数据以体素数表示，统计量t值用于反映组间差异的强度。

1.4.2 Allen人脑基因表达与GMV改变的相关性分析

       基于1.4.1经CAT12预处理、基于AAL3图谱分割提取得到的170个脑区GMV数据，使用SPSS 26.0软件对两组间GMV进行独立样本t检验，得到170个脑区GMV差异有统计学意义的t值。t值方向定义：t值为正值提示该脑区AD组GMV低于HC组，t值越大代表该脑区灰质萎缩程度越严重。基因表达原始数据来源于Allen人脑基因图谱（Allen Human Brain Atlas, http://human.brain-map.org/），该数据库包含6例健康成人死后脑组织全基因组芯片表达数据，借助Python工具包 abagen（https://abagen.readthedocs.io/en/stable/）完成标准化预处理与多图谱空间匹配。预处理流程包含4个步骤：（1）探针筛选，保留单基因下表达信号最强的探针作为该基因代表；（2）对6名供体的表达数据开展跨个体归一化处理；（3）识别并剔除表达量异常的离群样本；（4）将脑组织原位采样点插值映射至Brainnetome脑网络组图谱，计算每个脑区内所有采样点平均表达值，生成脑区-基因初始表达矩阵。本研究以MNI152标准空间为统一基准实现影像与转录组图谱匹配：先基于AAL3解剖图谱分割全脑并提取各脑区GMV；再依托abagen工具将Allen人脑全域基因表达谱投射至Brainnetome脑网络组图谱；以MNI152标准空间为统一基准，采用最大空间重叠法完成AAL3解剖图谱与Brainnetome转录组图谱脑区匹配，计算单个AAL3脑区与全部Brainnetome脑区空间重叠体积，取重叠面积占比最高的分区作为一一对应匹配单元。匹配后共剔除7个无匹配基因表达信息的AAL3脑区，分别为：双侧嗅球、双侧延髓、第四脑室、中脑导水管、下丘脑腹侧微小核团；剔除原因为上述脑区解剖范围狭小、多位于脑室/脑干边缘，Allen人脑基因图谱原位采样点分布空白，无有效基因表达均值。最终得到维度为163个脑区×15 633个基因的标准化影像-基因配对矩阵用于后续PLS分析。采用PLS回归构建AD组与HC组脑区GMV差异t值与全脑基因表达谱的空间关联模型，模型共提取前10个PLS主成分；采用留一法交叉验证评估各成分拟合稳定性，仅第一主成分PLS1经Spin置换检验校正后差异具备统计学意义，PLS2~PLS10均未通过显著性检验，因此仅针对PLS1开展后续基因权重排序与富集分析。为消除脑区间解剖位置带来的空间自相关干扰，所有模型显著性检验均采用Spin空间置换校正，置换参数设置为5000次三维球面随机旋转，随机旋转轴覆盖全脑MNI三维坐标轴；文中PLS1得分与GMV差异t值相关性P=0.03为Spin置换校正后校正P值。然后进行置换检验（置换次数n=5000）：随机打乱脑区t值与基因表达矩阵的配对关系，重复构建PLS模型，统计每次置换后PLS成分可解释基因表达变异比例，对比真实模型解释度获取P值，判定PLS成分整体关联差异是否具有统计学意义；随后，通过自举分析（Bootstrap，重采样次数n=5000）对163个脑区进行有放回重复抽样，每次抽样重新拟合PLS并输出各基因权重；以原始权重除以5000次自举权重标准差得到标准化Z值，依据标准化Z值对全部15 633个基因权重由高至低排序。PLS1权重解读规则：正权重基因代表基因在某脑区表达水平越高，该脑区GMV组间差异t值越大，对应AD灰质萎缩越显著；负权重基因代表基因局部表达越高，该脑区灰质萎缩程度相对较轻。选取排名前500正权重、前500负权重基因开展富集分析；筛选阈值依据预试验结果确定，TOP 500 基因可累积解释PLS1超90%权重变异，在保证富集信号稳定的同时避免纳入大量低权重噪声基因。将筛选得到的基因集导入Metascape平台（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）进行功能富集分析，同步调用GO、KEGG、Reactome三大数据库；富集分析背景基因集设定为本研究纳入的全部15 633个检测基因，以FDR校正P<0.05作为显著富集条目筛选标准，提取富集显著性TOP 20通路用于可视化展示与机制解读。

1.4.3 样本量估算及其他数据的统计学分析方法

       本研究样本量估算采用公式：n=2×（Zα/2+Zβ）²/（δ/σ）²，Zα/2对应检验水准α=0.05时的1.96，Zβ对应检验功效1-β=0.8时的0.84，σ为总体标准差的估计值（合并标准差），δ代表期望检测的均值差，为事后辅助验证样本统计效力，参照本研究实测MMSE评分数据代入完成计算。对于符合正态分布且方差齐性的计量资料，采用均数±标准差进行描述，组间比较采用独立样本t检验；对于符合正态分布但方差不齐的计量资料，同样以均数±标准差表示，组间比较则采用校正t检验（即t'检验）。对于不符合正态分布的计量资料，以中位数（四分位间距）描述，组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用卡方检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床数据分析

       为辅助佐证本研究样本整体统计效力，基于本研究MMSE评分数据，AD组与HC组的均值差δ=4.06，合并标准差σ=2.54，代入公式计算出检测此类大效应量（d=1.6）所需每组样本量约为7例。为评估实际统计效力，基于研究最终纳入样本量（共计纳入63名研究对象，AD组32例，HC组31例）及上述效应量（d=1.6），采用G*Power 3.1软件（https://www.gpower.hhu.de/）进行事后功效分析（α=0.05，双侧），计算得实际统计功效>0.99，侧面印证本研究样本量可支撑VBM及影像-基因关联的核心分析。AD组与HC组受试者在年龄、受教育年限及性别上差异均无统计学意义（P>0.05）；与HC组相比，AD组的MMSE评分降低（P<0.001），CDR评分升高（P<0.001）（表1）。

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表1  AD组与HC组临床数据
Tab. 1  Clinical data between AD group and HC group

2.2 两组全脑结构比较

       与HC组相比，AD组的脑灰质总体积明显减小，差异具有统计学意义（P<0.05）；而两组在脑白质总体积、脑脊液总体积及TIV方面的差异均无统计学意义（P>0.05）（表2）。

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表2  两组受试者脑灰质、脑白质、脑脊液体积及TIV比较
Tab. 2  Comparison of gray matter, white matter, cerebrospinal fluid volume, and TIV between the two groups

2.3 两组VBM分析结果比较

       经体素水平FWE初筛、团块水平FDR二次校正后，与HC组相比，AD组存在4个GMV缩小的脑区，其中peak点所在的核心脑区分别位于双侧海马、右侧颞中回、右侧颞下回（图1、表3）。

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图1  阿尔茨海默病患者脑灰质体积减小的脑区。彩色区域代表在体素水平FWE初筛和团块水平FDR二次校正后灰质体积减小的脑区。
Fig. 1  Brain regions with reduced gray matter volume in Alzheimer disease patients. The colored areas represent the brain regions where the gray matter volume has decreased after the initial screening at the voxel level FWE and the secondary correction at the cluster level FDR.

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表3  AD组灰质体积减小的脑区
Tab. 3  Brain regions with reduced gray matter volume in the AD group

2.4 两组间各脑区GMV差异t值与基因表达的相关性

       本研究发现，基于两组间各脑区GMV差异t值与节点基因表达谱之间存在的空间关联（图2）。第一个PLS1解释了37%的影像-基因关联变异，且与两组间GMV差异t值呈正相关（r=0.61，P=0.03，经Spin检验校正），PLS2解释了12%的影像-基因关联变异（P>0.05），PLS3解释了8%的影像-基因关联变异（P>0.05），PLS4解释了6%的影像-基因关联变异（P>0.05），PLS5解释了5%的影像-基因关联变异（P>0.05），PLS6解释了4%的影像-基因关联变异（P>0.05），PLS7解释了3%的影像-基因关联变异（P>0.05），PLS8解释了2%的影像-基因关联变异（P>0.05），PLS9解释了1.5%的影像-基因关联变异（P>0.05），PLS10解释了1%的影像-基因关联变异（P>0.05），上述PLS2~PLS10经Spin置换校正后差异均无统计学意义，故仅针对PLS1开展后续基因权重与富集分析（图3, 图4）。本研究发现，PLS1正权重基因TOP 20基因富集于：突触信号传递[GO：0099536，-log10（PFDR）=12.39]，化学突触传递调控[GO：0050804，-log10（PFDR）=12.22]，神经系统发育[R-HSA-9675108，-log10（PFDR）=10.16]，脑发育[GO：0007420，-log10（PFDR）=6.22]，细胞连接组装[GO：0034330，-log10（PFDR）=6.05]，神经元投射发育[GO：0031175，-log10（PFDR）=4.32]，见图5；PLS1负权重基因TOP 20富集于：系统性红斑狼疮[hsa05322，-log10（PFDR）=5.28]，Rho GTPases信号通路[R-HSA-194315，-log10（PFDR）=2.92]，内吞作用[GO：0006897，-log10（PFDR）=2.76]，组织稳态[GO：0001894，-log10（PFDR）=2.49]，程序性细胞死亡正调控[GO：0043068，Count=25，-log10（PFDR）=2.40]，TP53调控细胞死亡基因转录[R-HSA-5633008，-log10（PFDR）=2.38]，Th1/Th2 细胞分化[hsa04658，-log10（PFDR）=1.61]，见图6。

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图2  各脑区节点的基因表达谱。每一行代表特定脑区节点中单个基因的表达水平。
Fig. 2  Gene expression profiles of each brain region node. Each line represents the expression level of a single gene in a specific brain region node.

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图3  PLS回归分析前10个PLS成分的解释度，每个PLS主成分代表所有基因表达量的加权线性组合。
Fig. 3  PLS regression was used to analyze the interpretability of the first 10 PLS components, with each PLS principal component representing a weighted linear combination of all gene expression levels.

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图4  PLS1得分与两组间灰质体积差异t值的相关性，每个点代表一个脑区节点。PLS：偏最小二乘。
Fig. 4  The correlation between the PLS1 score and the t-value difference in gray matter volume between the two groups, with each point representing a brain region node. PLS: partial least squares.

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图5  PLS1成分TOP 20正权重基因富集条形图、网络图、气泡图。5A：基因富集分析条形图，横坐标为-log10（P），代表富集显著性，纵坐标为基因富集数目；5B：基因富集网络图，不同颜色节点代表不同富集基因，连边代表基因间的关联，节点颜色与右侧气泡图的富集基因一一对应；5C：气泡图，横坐标-log10（PFDR）为校正后显著性，纵坐标为基因富集数目；不同颜色代表不同富集基因，气泡大小代表对应功能条目所包含的基因数量。PLS：偏最小二乘。
Fig. 5  Bar chart, network chart and bubble chart of the TOP 20 positive weight genes of PLS1 component enrichment. 5A: Gene enrichment analysis bar chart, with -log10(P) on the horizontal axis representing enrichment significance and the number of genes enriched on the vertical axis. 5B: Gene enrichment network diagram. Nodes of different colors represent different enriched genes, and edges represent the associations between genes. The colors of the nodes correspond one-to-one with the enriched genes in the bubble chart on the right. 5C: Bubble chart, with the horizontal axis -log10(PFDR) representing the corrected significance and the vertical axis representing the number of gene enrichment. Different colors represent different enriched genes, and the size of the bubbles indicates the number of genes contained in the corresponding functional items. PLS: partial least squares.

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图6  PLS1成分TOP 20负权重基因富集条形图、网络图、气泡图。6A：基因富集分析条形图，横坐标为-log10（P），代表富集显著性，纵坐标为基因富集数目；6B：基因富集网络图，不同颜色节点代表不同富集基因，连边代表基因间的关联，节点颜色与右侧气泡图的富集基因一一对应；6C：气泡图，横坐标-log10（PFDR）为校正后显著性，纵坐标为基因富集数目；不同颜色代表不同富集基因，气泡大小代表对应功能条目所包含的基因数量。PLS：偏最小二乘。
Fig. 6  PLS1 component TOP 20 negative weight gene enrichment bar chart, network chart, bubble chart. 6A: Gene enrichment analysis bar chart, with -log10(P) on the horizontal axis representing enrichment significance and the number of genes enriched on the vertical axis. 6B: Gene enrichment network diagram. Nodes of different colors represent different enriched genes, and edges represent the associations between genes. The colors of the nodes correspond one-to-one with the enriched genes in the bubble chart on the right. 6C: Bubble chart, with the horizontal axis -log10(PFDR) representing the corrected significance and the vertical axis representing the number of gene enrichment. Different colors represent different enriched genes, and the size of the bubbles indicates the number of genes contained in the corresponding functional items. PLS: partial least squares.

3 讨论

       本研究采用VBM方法系统评估了AD患者与HC之间的脑GMV差异，并通过PLS回归分析与Allen人脑基因图谱的关联，发现了AD相关脑萎缩的可能分子遗传学基础。本研究发现，AD患者双侧海马、右侧颞中回及右侧颞下回GMV减低，且这些结构改变与突触功能、神经发育、免疫炎症及细胞死亡等相关基因的表达谱存在空间关联。

3.1 AD患者GMV改变

       本研究VBM定量分析结果显示，纳入的63例受试者（AD组32例、HC组31例）基线年龄、性别、受教育年限组间均衡可比；相较HC组，AD组全脑灰质总体积下降，灰质萎缩特异性集中在双侧海马、右侧颞下回与右侧颞中回。海马是AD病理进程中最早受累的脑区之一，其体积萎缩被视为AD的影像学标志物^{[28, 29]}，本研究双侧海马均出现灰质丢失，与该病理规律完全吻合。既往研究^[30]发现AD患者与HC相比，海马、杏仁核及内侧颞叶（包括梭状回和海马旁回）的体积显著减小。另一项针对遗忘型轻度认知障碍向AD转化的研究发现，左侧海马及海马旁回的GMV缩减是预测遗忘型轻度认知障碍患者向AD转化的最一致的神经结构生物标志物^[31]，上述文献结论均与本研究核心发现保持一致。颞叶是AD病理进程中最早且最严重受累的脑区之一^{[32, 33]}。既往VBM研究显示，AD患者的灰质萎缩可广泛分布于海马、海马旁回、岛叶、颞上/中回、丘脑、扣带回及顶叶^[34]。但本研究萎缩范围仅局限在内侧颞叶，未观测到顶叶、后扣带回广泛萎缩，存在一定差异，该差异可从两方面解释：第一，入组受试者为60~75岁，AD组共32例，CDR评分分层分布：CDR=0.5分（可疑/极轻度痴呆）21例，CDR=1分（轻度痴呆）10例，CDR=2分（中度痴呆）1例，无CDR=3分重度患者，整体以早中期轻度AD人群为主，AD萎缩存在特征性时空进展规律，早期病变仅局限于海马、内嗅皮质，随病程延长才逐步累及颞叶外侧、顶叶、后扣带回，晚期扩散至额叶^[35]，该分层分布可解释本研究仅观测到内侧颞叶灰质丢失、未检出广泛皮层萎缩的结果；第二，本研究采用体素水平FWE初筛和团块水平FDR二次校正策略，虽可大幅降低假阳性，但会筛除顶叶、后扣带回等效应量微弱的边界差异脑区，造成此类区域萎缩信号未被检出。

3.2 PLS1成分的影像-基因关联解析

       本研究构建GMV组间差异t值与全脑基因表达谱的PLS回归模型，结果显示首个主成分PLS1可解释37%影像-基因协变变异，在Allen人脑基因图谱高维脑区×全基因矩阵的PLS分析体系中属于中等水平；同类采用相同图谱的AD影像转录研究PLS1解释度多分布 35%~45%区间，极少达到50%以上强解释水平，高维基因矩阵自带噪声、脑区空间异质性是解释度普遍偏低的核心原因，且PLS1得分与脑区GMV差异t值呈正相关（r=0.61，P=0.03，经Spin空间自相关校正），仅刚达到统计学临界阈值，统计效力有限；剩余PLS2~PLS10均无统计学意义，仅PLS1可稳定捕获脑萎缩对应的成套基因表达特征。本研究明确PLS1权重对应的生物学规律：若某脑区PLS1正权重基因表达水平越高，该脑区AD与HC组间GMV差值越大，灰质萎缩程度越显著，该空间关联规律直观揭示AD脑萎缩区域异质性的转录组基础。PLS属于适配多组学整合的多元统计模型，相较于传统单变量分析，可同步解析高维基因表达与脑影像指标的协同变化特征，适合挖掘全脑基因表达谱与脑结构表型的复杂空间关联^[36]，本研究的分析结果进一步印证了该方法在AD影像转录组研究中的应用价值。已有同类研究利用PLS模型证实，脑萎缩特征与AD多基因风险评分存在协同变化规律，模型在不同病程队列中具备稳定泛化性能^[37]，与本研究依靠PLS捕获影像-基因显著关联的结论相互印证。

3.3 正权重基因富集分析：突触可塑性与神经发育的分子基础

       本研究对PLS1排名前500的正权重基因开展富集分析，结果显示显著性TOP 20通路集中于突触信号传递、化学突触传递调控、神经系统发育、脑发育、细胞连接组装、神经元投射发育等条目，从空间转录组维度解释了AD内侧颞叶灰质萎缩的分子特征。突触功能受损是AD早期核心病理改变，该损伤发生时间早于神经元大量丢失^[38]，本组突触相关通路显著富集，直接从全基因组空间表达层面佐证突触紊乱是介导AD脑结构萎缩的关键分子事件。该结论与现有影像转录组研究结论吻合：联合功能MRI与基因表达的研究证实，Aβ、tau蛋白协同损伤神经元活动的过程，与突触调控、神经发育通路高度耦联^[39]；小胶质细胞相关机制研究进一步补充，AD内补体通路过度激活会介导突触异常清除，进而造成记忆功能衰退，是疾病进展的重要驱动环节^[40]，上述文献均为本研究突触通路富集结果提供病理机制支撑。同时，神经发育类通路显著富集提示AD脑萎缩伴随神经元可塑性异常，可能与机体发育相关调控程序异常再激活有关。海马齿状回终身维持神经发生能力，而AD患者该区域神经发生进程明显受损^[41]，本研究神经元投射发育、细胞连接组装相关基因富集，进一步说明神经可塑性缺陷参与AD特征性灰质丢失。针对不同认知分型AD的分层研究显示，尽管各亚型灰质萎缩模式存在差异，但突触功能相关基因均稳定富集^[42]，侧面证实突触通路异常是AD全病程普遍存在的核心分子特征，也解释了本研究海马、颞叶等易损脑区更易出现重度萎缩的分子基础。

3.4 负权重基因富集分析：神经炎症与细胞死亡的调控网络

       本研究对PLS1排名前500的负权重基因开展富集分析，TOP 20富集条目集中于免疫炎症、Rho GTPases信号、内吞、程序性细胞死亡及TP53介导细胞死亡相关通路，该富集特征可从转录组空间层面解释AD脑区退变异质性。神经炎症是AD的重要病理特征^[43]。本研究中免疫炎症通路的显著富集，从转录组层面验证了炎症反应在AD脑萎缩中的作用。这一发现与当前研究热点高度契合。近期研究明确指出，补体系统这一先天免疫的关键分支在AD发病机制中发挥核心作用，其异常补体活性促进Aβ沉积、突触丢失、神经炎症和血脑屏障破坏^[44]。本研究负权重基因富集于系统性红斑狼疮（hsa05322）通路，该富集结果虽看似偏离AD经典退行性通路，但二者存在高度重叠免疫调控网络：第一，补体系统为两类疾病共有核心致病模块，系统性红斑狼疮因C1q/C4补体基因缺陷引发凋亡细胞清除障碍、自身免疫复合物沉积；AD中补体过度激活介导小胶质细胞异常吞噬突触，二者共用同一套补体级联调控基因集，这是通路交叉富集的核心分子基础；第二，系统性红斑狼疮与AD均可产生靶向神经元的自身抗体（抗N-甲基-D-天冬氨酸受体、抗核抗体），直接诱发神经元兴奋性毒性与慢性神经炎症，共享自身抗体介导神经损伤通路。同时免疫相关基因在人类全基因组中表达广泛，参与多种炎症、退行性疾病，该条目存在一定非特异性富集特征，并非AD独有致病通路，但可佐证免疫紊乱是驱动脑萎缩的关键共性调控模块。Rho GTPases信号通路参与细胞骨架重塑、突触可塑性及炎症反应，其异常激活与AD的突触丢失和树突棘萎缩密切相关^[45]，与本研究负权重基因富集结果相互支撑。内吞作用通路是公认AD易感通路，多个AD风险基因（PICALM、BIN1、CD2AP）均参与内吞和胞吞过程^[46]，本研究依托脑区空间匹配策略，进一步从影像转录组维度证实内吞通路基因高表达区域与AD萎缩脑区高度重合。同时程序性细胞死亡、TP53介导凋亡通路显著富集，直接揭示神经元凋亡相关转录谱是介导脑灰质丢失的分子基础。既往活体研究证实，Aβ和tau蛋白的协同作用导致神经元活动异常，这一过程与神经炎症通路在全脑水平上存在空间重叠^[47]，与本研究结果一致。

       在免疫相关通路的具体富集条目上，本研究也与部分既往研究存在差异。与近年基于Allen人脑图谱开展的AD影像转录组研究相比，SHEN等^[19]采用单变量空间相关逐一分析单基因与脑代谢改变关联，LU等^[22]依托简单线性回归解析皮层厚度相关基因，两类方法均无法处理上万基因的多重共线性问题，仅能零散筛选少数差异基因，难以系统识别成套协同表达通路。而本研究采用PLS多变量降维建模，可一次性量化全基因组与灰质萎缩的全局协变，结合Spin校正消除脑区空间自相关干扰；同时区别于上述研究仅单向分析阳性关联基因，本研究区分正负权重基因集，分别解析神经保护、神经损伤两类对立分子模块，完整构建 “突触发育维持-免疫凋亡损伤” 双向调控框架，弥补现有单变量研究通路解析片面的局限。本研究未观测到线粒体相关显著富集，与ZAFAR等^[48]快速进展型AD队列结论存在差异，推测源于样本病程分层、基因筛选阈值不同，不构成核心方法学对比依据，故主要与同范式影像转录研究横向对标。

3.5 局限性

       本研究存在一定的局限性。首先，本研究的样本全部来源于ADNI数据库的白人队列，缺乏中国AD患者样本及跨种族验证；未来研究需纳入中国AD队列，并结合中国脑基因图谱进行跨种族队列验证。其次，Allen人脑基因图谱仅来源于6例健康成年个体的死后脑组织样本，缺乏AD患者脑组织转录数据，因此本研究仅能基于健康脑本底基因表达谱间接关联AD相关脑萎缩，无法直接反映AD病变后基因表达的原位改变，可能低估疾病特异性的分子信号。再次，VBM分析中严格的体素水平FWE初筛与团块水平FDR二次校正的策略虽降低了假阳性风险，但可能遗漏部分真实存在的组间差异。此外，本研究为横断面设计，难以推断基因表达与脑萎缩之间的因果关系。本研究将受试者年龄限定为60~75岁，剔除60岁以下早发型AD及75岁以上高龄受试者，早发型AD常存在致病基因突变，75岁以上老年人多合并脑小血管病、多种全身基础疾病，两类人群脑萎缩特征、脑区基因表达谱均与本研究队列存在差异，因此本研究结论外推范围有限，不适用于早发型AD及超高龄痴呆人群。本研究匹配AAL3、Brainnetome两套分区规则不同的脑图谱，依靠空间重叠完成映射，匹配流程会引入系统性空间误差，干扰脑区基因表达均值估算，存在图谱匹配不确定性。最后，PLS权重解读存在固有局限：正权重基因在健康脑本底高表达对应区域萎缩更显著，但现有数据无法区分该高表达属于维持神经正常生理的基础表达，或是使脑区更易遭受Aβ、tau损伤的病理易感分子特征，需体内外试验进一步佐证生物学内涵。未来研究应在更大样本、多种族队列及纵向随访设计中整合多模态数据，进一步验证并拓展本研究的发现。

4 结论

       综上所述，本研究通过VBM与Allen人脑基因图谱的PLS关联分析，提示了AD患者特征性灰质萎缩的可能分子遗传学基础。AD相关GMV改变与突触传递、神经发育、免疫炎症及细胞死亡等生物学通路的基因表达谱存在空间关联。其中，突触功能障碍与神经发育异常相关基因的高表达区对AD诱导的萎缩更为敏感，而免疫炎症与细胞死亡通路基因则可能参与萎缩的放大与维持。本研究为理解AD的影像-基因关联机制提供了新的证据，识别的核心基因和通路为AD的分子机制研究提供了候选依据。