0 引言

       前列腺癌（prostate cancer, PCa）是男性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率在我国呈持续上升趋势^[1]。早期诊断对改善患者预后至关重要，血清前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen, PSA）筛查虽然应用广泛，但其特异性有限^{[2, 3]}。目前MRI已成为前列腺癌无创诊断的重要检查手段，但其对早期微小病灶的检出仍不理想。因此，制备高特异性的前列腺癌分子显影探针，是实现疾病早期精准诊断的迫切需求^{[4, 5]}。

       前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen, PSMA）在约90%的前列腺癌病例中表现出显著上调^[6]。这使PSMA成为前列腺癌分子影像和靶向诊疗的理想标志物^[7]。近年来，基于PSMA的分子探针在正电子发射断层扫描（positron emission computerized tomography, PET）领域取得了重要突破，⁶⁸Ga-PSMA PET/CT的敏感度约80%、特异度约90%^[8]。然而，PET/CT存在电离辐射、设备普及率有限等不足，且其空间分辨率仍难以满足对微小病灶的精细解剖定位需求^[9]。MRI具有无电离辐射、软组织分辨率高等优势，但常规MRI对比剂缺乏主动靶向能力，难以实现对PSMA阳性病灶的分子水平特异性识别^[10]。

       超顺磁性氧化铁纳米颗粒（superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPION）具有良好的T2弛豫效应，目前已成为MRI对比剂研究的热点^[11]。Fe3O4纳米颗粒经适当表面修饰后可作为MRI T2阴性对比剂，其良好的生物安全性^[12]。有研究表明，Fe3O4纳米探针可显著提升肿瘤与正常组织的成像对比度，为肿瘤早期诊断提供重要依据^[13]。近年来，PSMA靶向的铁氧化物纳米探针研究取得了重要进展^[14]。前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen, PSMA）在前列腺癌细胞表面高表达，且表达水平与肿瘤恶性程度正相关，已成为前列腺癌靶向成像的理想靶点^[15]。GHORBANI等^[16]利用PSMA-11多肽修饰铁氧化物纳米颗粒，实现了对PSMA阳性前列腺癌移植瘤的MRI特异性成像。SURASINGHE等^[17]构建了超小SPION与抗PSMA抗体5D3偶联的纳米诊疗剂，为前列腺癌的诊疗一体化提供了新思路。YAN等^[18]设计的新型Fe3O4磁性纳米探针，通过表面修饰PSMA靶向抗体片段，能够实现直径0.5 mm微小骨转移灶的检测。

       与已报道多肽修饰 PSMA靶向铁氧化物探针不同，本研究采用PSMA单克隆抗体进行偶联，相较多肽，抗体具备更高的靶点亲和性，构建 Fe3O4-PSMA磁共振分子成像探针，系统评价其理化性质、体外生物安全性、体内代谢动力学及靶向MRI效果，并在PSMA高表达与低表达前列腺癌荷瘤小鼠模型中验证其靶向特异性，为前列腺癌的MRI早期诊断提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

       RPMI-1640培养基（Gibco，美国）、胎牛血清（Gibco，美国）、胰蛋白（上海碧云天生物技术股份有限公司，中国）、青霉素-链霉素溶液（上海碧云天生物技术股份有限公司，中国）、膜联蛋白 V-PE/7-氨基放线菌素 D（Annexin V-PE/ 7-AAD）流式试剂盒（天津三箭生物技术股份有限公司，中国）、Anti-PSMA（Proteintech集团公司，美国）、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯（BMPS，中国）、内核Fe3O4外壳带氨基磁性纳米粒（阿拉丁试剂有限公司，上海）、普鲁士蓝染色试剂盒（G1424，索莱宝）、多聚甲醛（A500684-0500，上海生工）、苏木素伊红染色试剂盒（G1120索莱宝，中国）。

1.1.2 实验仪器

       双人双面垂直洁净工作台（SW-CJ-2F，上海博讯实业有限公司）、二氧化碳培养箱（MCO-15AC-SC，三洋sanyo，日本）、智能恒温水浴锅（HW-SY-P，北京东方精瑞科技发展有限公司）、倒置荧光显微镜（ECLIPSE Ti-s Nikon，日本）、透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）（Talos F200S，美国赛默飞世尔科技公司）、X 射线光电子能谱仪（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS）（Thermo ESCALAB 250Ⅺ，美国赛默飞世尔科技公司）、傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer, FT-IR）（Thermo Fisher Scientific Nicolet iS20，美国赛默飞世尔科技公司）、立压式蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-100A，上海博讯实业有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（GZX-9140MBE，上海博讯实业有限公司）光学显微镜DMC-5400（Leica，德国）、立压式蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-100A，上海博讯实业有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（GZX-9140MBE，上海博讯实业有限公司）、光学显微镜DMC-5400（Leica，德国）、全自动扫片机vs200（OLYMPUS，日本）、7 T动物MRI扫描仪（BioSpec70/20USR，德国）。

1.2 实验方法

1.2.1 Fe3O4-PSMA分子探针的构建及特征检测

       （1）Fe3O4-PSMA的制备：首先，将含有1 mg BMPS的PBS溶液加入Fe3O4溶液（5 mg/mL），室温下反应6 h。随后，将100 μL Anti-PSMA溶液（1 mg/mL）加入到前一步的反应液中，反应过夜。最后通过冷冻干燥的方式获得Fe3O4-PSMA。

       （2）Fe3O4-异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate, FITC）的制备：首先，称取1 mg FITC-NHS溶于PBS溶液中，随后加入Fe3O4溶液（5 mg/mL）。室温条件下反应12 h，在透析袋（8 kDa）中置于蒸馏水中透析过夜，最后冷冻干燥获得Fe3O4-FITC。

       （3）Fe3O4-PSMA-FITC的制备：BMPS是一种异双功能交联剂，含有NHS酯和马来酰亚胺基团。首先，将含有1 mg BMPS的PBS溶液加入Fe3O4-FITC溶液，室温下反应6 h。随后，将100 μLAnti-PSMA溶液（1 mg/mL）加入到前一步的反应液中，反应过夜。最后通过冷冻干燥的方式获得Fe3O4-PSMA-FITC。

       （4）特征官能团测定：在Thermo Fisher Scientific Nicolet iS20 FT-IR光谱仪上通过KBr压片法记录Fe3O4、Fe3O4-PSMA的FT-IR光谱。

       （5）TEM形貌观测：将振荡均匀的Fe3O4-PSMA液体，取5 μL滴加于碳膜支持铜网中，随后使用Talos F200S型透射电子显微镜观测Fe3O4-PSMA的形态、粒径分布及分散性。通过动态光散射（dynamic light scattering, DLS）检测Fe3O4-PSMA的水合粒径、Zeta电位。通过二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白定量试剂盒检测了Fe3O4-PSMA中PSMA抗体的偶联率。

       （6）X射线光电子能谱仪元素测定：分别取适量Fe3O4纳米颗粒冻干粉及Fe3O4-PSMA分子探针，经研磨、压片后置于X射线光电子能谱仪。通过测量光电子的结合能和强度，分析样品表面元素组成及化学状态。

       （7）测定探针的体外T2弛豫率：分别配制Fe浓度为0.010 5、0.021、0.043、0.086、0.172 mM的Fe3O4-PSMA纳米颗粒，置于1.5 mL离心管中涡旋处理3 min，随后使用场强为3.0 T的MRI仪对样品进行成像，成像参数设置如下：TR 1 100.0 ms，TE 28.7 ms，视野150 mm×250 mm，层厚2.5 mm。计算各浓度的弛豫速率R=1000/T，随后以浓度c为横坐标、R为纵坐标进行最小二乘线性拟合R=r×c+R0，斜率r即为弛豫率（mM^-1s^-1）。

1.2.2 Fe3O4-PSMA生物安全性检测

       用6孔板培养细胞，待细胞生长达到60%~70%，分组处理细胞：对照组C4-2细胞正常培养；实验组使用10 μg/mL Fe3O4-PSMA与C4-2细胞共培养24、48 h；并使用不同剂量（0~500 μg/mL）Fe3O4-PSMA与C4-2细胞共培养24 h。共培养结束后，收集细胞培养基上清和细胞沉淀，2000 rpm离心5 min；用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）洗涤细胞2次，2000 rpm离心5 min，收集1~5×10⁵个细胞；在50 μL的1×结合缓冲液（binding buffer）中加入5 μL 7-氨基放线菌素D（7-aminoactinomycin D, 7-AAD）染液，混匀；加入5 μL藻红蛋白标记的膜联蛋白V（phycoerythrin-conjugated annexin V, Annexin V-PE）混匀；室温、避光、反应5~15 min；收集细胞中加入上述7-AAD染液，混匀；室温、避光、反应5~15 min；反应后再加入450 μL的Binding Buffer混匀；1 h内进行荧光显微镜、流式细胞仪检测及细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8, CCK-8）检测。

1.2.3 前列腺癌荷瘤小鼠模型构建及MRI

       （1）本研究经过新疆医科大学实验动物伦理委员会及重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司实验动物伦理委员会批准（批准文号分别为：IACUC-JT-20260512-19、WST.No20250410B014123I[01]）。选用由新疆医科大学动物实验中心饲养的C57雄性小鼠清洁级30只（第一批，专用于MRI靶向成像实验），体质量18~20 g，鼠龄9~10周，构建高表达PSMA前列腺癌C4-2细胞荷瘤小鼠（实验组）和极低表达PSMA前列腺癌PC-3细胞荷瘤小鼠（对照组）模型：实验小鼠称重，麻醉满意后，将小鼠仰卧位固定于手术台上；碘伏消毒，75%酒精脱碘。于肝下缘5~10 mm，阴茎上缘5~8 mm，做10 mm切口，暴露膀胱、精囊腺和前列腺；轻轻按压切口两侧使膀胱轻轻突出，使用棉签轻压膀胱顶壁和腹壁，沿着前列腺包膜下缓慢注射细胞悬液浓度：5×10⁵，注射体积：50 μL/只，以包膜向上鼓起，脱离腺体表面为满意标准。注射完毕后停针2 s再缓慢退针，退针后用棉签轻轻按压针口防止细胞液漏出。轻轻复位膀胱，输精管等器官，逐层缝合腹壁肌肉和皮肤；碘伏消毒创口，将裸鼠放于电热毯保温，等待其苏醒后放回笼中正常饲养。建模4周后，每周进行触诊监测是否成瘤，9周时可以触摸到疑似肿瘤，12周时行MRI扫描确定是否成瘤，最终造模成功的小鼠有27只，实验动物成瘤率为90%，其中C4-2细胞荷瘤小鼠14只，PC-3细胞荷瘤小鼠13只，采用随机分组的方法每组抽取10只小鼠进行后续实验，剩余7只小鼠留作备用。

       （2）两组小鼠MRI检测：两组小鼠尾静脉注射Fe3O4-PSMA分子探针（200 μL/只）。采用7 T德国Bruker动物MRI扫描仪（型号：BioSpec70/20USR），于注射前、注射后2 h、6 h、24 h进行4次MRI扫描（注射前扫描轴位T1WI和T2WI序列，其余时间点仅扫描T2序列）。扫描前设置T1WI参数：TR 908 ms，TE 5.2 ms，层厚0.8 mm，视野35 mm×35 mm，层数20层。设置T2WI参数：TR 2225 ms，TE 35 ms，层厚0.8 mm，FOV 35 mm×35 mm，层数20层。扫描完成后，由两位具有10年工作经验的放射科主治医师，在对分组情况不知情的条件下，运用RadiAnt Viewer（Medixant, Poland）软件绘制感兴趣区（region of interest, ROI）并计算两组肿瘤-正常组织信号比（tumor-to-normal tissue signal ratio, TNR）值。为便于纵向比较探针注射后不同时间点的信号变化趋势，以注射前TNR值作为基线进行归一化处理，设定注射前TNR值为1，后续各时间点TNR值以相对于基线的比值表示。两位医师评估结果的一致性采用组内相关系数（intra-class correlation coefficient, ICC）进行检验，ICC值为0.92（95% CI：0.87~0.96），提示一致性良好。当评估结果出现不一致时，由一位具备10年工作经验的高级职称医师进行复核，进而达成诊断共识。

1.2.4 普鲁士蓝染色观察Fe3O4-PSMA探针在各组织器官的分布情况

       切片入佩尔斯普鲁士蓝染色工作液染色15~30 min；蒸馏水充分冲洗5~10 min，去除切片表面染液；切片入伊红染色液染背景15~30 s，自来水快速冲洗2~3 s；75%、85%、95%乙醇各3~5 s，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各1 min；透明剂透明3次，每次1~2 min。中性树胶封片。

1.2.5 苏木精-伊红染色检测各组小鼠肿瘤组织病理变化

       苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, HE）染色：苏木素染液染色30~60 s；自来水冲洗多余的染色液，约5 min；镜检，若苏木素着色过深可用1%盐酸酒精进行分脱色，脱去细胞质中多余的苏木素染色液；伊红染液染色20 s；自来水冲洗多余染液，约30 s；95%乙醇、无水乙醇快速脱水，约30；透明剂透明3次，每次1~2 min。中性树胶封片。

1.2.6 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记染色

       末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）染色：二甲苯浸泡2次，每次10 min；依次100%、95%、85%、75% 乙醇各5 min复水；蒸馏水漂洗3 min。滴加20 μg/mL蛋白酶K工作液，37 ℃孵育15 min；PBS洗涤3次，每次3 min。0.1% Triton X-100室温通透8 min，PBS漂洗去除通透液。吸干切片多余液体，滴加TUNEL反应混合液，避光37 ℃孵育60 min；PBS充分清洗。DAPI染液避光孵育5 min，标记细胞核；PBS冲洗多余染料。抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜拍照，Image J软件半定量统计荧光信号强度。

1.2.7 分子探针体内代谢动力学检测

       采用FITC荧光分别标记Fe3O4纳米颗粒与Fe3O4-PSMA探针，重新选取由新疆医科大学动物实验中心饲养的C57雄性小鼠清洁级48只（第二批，与MRI实验非同一批动物，专用于代谢动力学及7天安全性评价实验），将小鼠随机分为Fe3O4对照组与Fe3O4-PSMA实验组，每组24只，经尾静脉注射等量荧光标记探针。分别于给药后0.1、1、4、8、12、24、36、48 h经尾静脉采集外周血，避光保存。取等体积血液样本置于96孔板，通过小动物荧光成像系统采集荧光图像并定量荧光信号；以时间为横坐标、相对荧光强度为纵坐标绘制血液循环代谢曲线，对比两种纳米粒体内清除速率，评估Fe3O4-PSMA 探针体内代谢排泄特征。

1.3 统计学分析

       体外实验均进行三次独立的重复实验。动物分组遵循随机分配原则。采用SPSS 26.0（IBM Corp., Armonk, NY, USA）和GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）进行统计分析。计量资料以x¯±s表示，两组间比较使用独立样本t检验。通过GraphPad Prism 9.0采用重复测量方差分析（repeated measures analysis of variance, RM-ANOVA）分析TNR随时间的变化其组间差异。两位医师测量TNR值的一致性采用组内相关系数（intra-class correlation coefficient, ICC）评估。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Fe3O4-PSMA分子探针的构建及表征检测

2.1.1 Fe3O4-PSMA分子探针特征官能团检测

       通过FT-IR收集到的光谱图可见，在Fe3O4偶联PSMA抗体之后可见明显的隶属于伯酰胺的氨基骨架振动峰（NH2 st）以及氨基形变振动峰（NH2δ）。此外，还观察了羰基骨架振动峰（C=O st）以及碳氮骨架振动峰（C-N st）（图1）。证实了抗体PSMA与Fe3O4的成功偶联。

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图1  Fe3O4及Fe3O4-PSMA傅里叶红外光谱图。PSMA：前列腺特异性膜抗原；SPION：超顺磁性氧化铁纳米颗粒。
Fig. 1  Fourier transform infrared spectra of Fe3O4 and Fe3O4-PSMA. PSMA: prostate-specific membrane antigen; SPION: superparamagnetic iron oxide nanoparticles.

2.1.2 Fe3O4-PSMA分子探针电子投射显微镜检测

       电子透射显微镜可见：PSMA偶联的Fe3O4保持着颗粒状态，且颗粒的大小均一、整体分散性与结构稳定性良好（图2）。通过DLS检测Fe3O4-PSMA的水合粒径、Zeta电位，结果显示Fe3O4-PSMA在水中的（66.71±0.94）nm，Zeta电位为（-26.1±3.52）mV。通过BCA蛋白定量试剂盒检测Fe3O4-PSMA中PSMA抗体的偶联率，与理论值相比偶联效率为58%。

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图2  Fe3O4-PSMA分子探针的透射电子显微镜图像。PSMA：前列腺特异性膜抗原。
Fig. 2  Transmission electron microscopy image of Fe3O4-PSMA molecular probes. PSMA: prostate-specific membrane antigen.

2.1.3 Fe3O4-PSMA分子探针光子能谱图

       X射线光电子能谱图谱显示出在532.91和284.81 eV处有两个明显的特征峰，分别代表O1s、C1s。此外，在400.2和164.2 eV处发现属于PSMA的N1s、S2p特征峰。值得注意的是，来自Fe3O4的Fe3p出现在55.2 eV处。数据表明Fe3O4-PSMA主要含有C、O、N、S和Fe这五种元素（图3）。

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图3  X射线光电子能谱图谱。
Fig. 3  X-ray photoelectron spectroscopy spectrum.

2.1.4 Fe3O4-PSMA的T2弛豫性能

       实验结果显示，Fe3O4-PSMA纳米粒的T2弛豫时间倒数随铁浓度变化的线性关系均良好（图4、表1）。T2弛豫的倒数与铁的毫摩尔浓度的关系图表明，Fe3O4-PSMA的r2弛豫为15.224 mM^-1S^-1。该结果表明Fe3O4-PSMA纳米粒具有良好的T2 MRI能力。

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图4  基于铁浓度增加的Fe3O4-PSMA的T2弛豫性能拟合曲线图。PSMA：前列腺特异性膜抗原。
Fig. 4  Fitted plot of T2 relaxation performance based on Fe3O4-PSMA with increasing iron concentration. PSMA: prostate-specific membrane antigen.

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表1  不同Fe浓度的Fe3O4-PSMA纳米颗粒对应的弛豫时间及1000/T计算结果
Tab. 1  Relaxation times corresponding to Fe3O4-PSMA nanoparticles at different Fe concentrations, along with the calculated values of 1000/T

2.2 流式检测Fe3O4-PSMA对细胞凋亡的影响

       流式细胞术检测10 μg/mL的Fe3O4-PSMA探针分别作用C4-2细胞24 h、48 h，其对细胞凋亡的影响，结果显示：10 μg/mL的Fe3O4-PSMA作用细胞24 h、48 h均会增加细胞凋亡，其中24 h，其凋亡率仅8.101%±0.332%，而48 h凋亡率达到了29.321%±1.561%，考虑到生物安全性，24 h更合适（表2、图5）。

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图5  流式细胞术检测Fe3O4-PSMA探针作用C4-2细胞24 h及48 h后的细胞凋亡率。5A、5B分别为24 h对照组、实验组；5C、5D分别为48 h对照组、实验组。PSMA：前列腺特异性膜抗原。
Fig. 5  Apoptosis rates of C4-2 cells detected by flow cytometry after treatment with Fe3O4-PSMA probes for 24 h and 48 h. 5A and 5B: control and experimental groups at 24 h, respectively; 5C and 5D: control and experimental groups at 48 h, respectively. PSMA: prostate-specific membrane antigen.

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表2  流式检测空白对照组、10 μg/mL Fe3O4-PSMA组细胞凋亡
Tab. 2  Flow cytometry analysis of apoptosis in the blank control group and the 10μg/mL Fe3O4-PSMA group

2.3 CCK-8检测法验证Fe3O4-PSMA对细胞存活率的影响

       将细胞与不同剂量（0~500 μg/mL）的分子探针共培养24 h后，能够观察到细胞均处于较高的水平（约为100%）（图6）。即使随着浓度的提升，Fe3O4-PSMA也并未显示出明显的细胞毒性。这些数据说明制备的Fe3O4-PSMA纳米分子显影探针有良好的生物相容性。

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图6  不同浓度Fe3O4-PSMA探针作用C4-2细胞24 h后的细胞存活率（CCK-8法）。
Fig. 6  Cell viability of C4-2 cells after 24 h treatment with different concentrations of Fe3O4-PSMA probes (CCK-8 assay).

2.4 前列腺癌荷瘤小鼠模型MRI

       在尾静脉注射Fe3O4-PSMA探针之前，两组小鼠前列腺癌病灶在T2WI序列上均呈稍高信号，当小鼠尾静脉注射Fe3O4-PSMA分子探针6、24 h时，实验组肿瘤T2WI信号减低，并随着时间的延长，信号持续减低，与对照组存在差异。在成像的过程中，发现实验组并没有显示出整个肿瘤的信号降低，而是表现为斑片状T2WI低信号，这说明Fe3O4-PSMA能特异性与前列腺特异性膜抗原结合，实现特异性成像（图7）。为了进一步检测两组MRI信号的差异，对不同成像时间点肿瘤的TNR值进行了定量分析。实验组肿瘤的TNR值较对照组明显减低，并且差异具有统计学意义（表3）。

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图7  两组小鼠MRI 图像。7A~7D：对照组小鼠MRI 图像；7E~7H：实验组小鼠MRI 图像；7I：两组小鼠TNR值统计图。TNR：肿瘤-正常组织信号比。
Fig. 7  MRI images of the two mouse groups. 7A to 7D shows MRI images of the control group; 7E to 7H displays MRI images of the experimental group; 7I presents statistical analysis of TNR values for both groups. TNR: tumor-to-normal tissue signal ratio.

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表3  两组小鼠肿瘤组织TNR值比较
Tab. 3  Comparison of TNR values in tumor tissues between the two groups of mice

2.5 普鲁士蓝染色观察Fe3O4-PSMA探针在各组织器官的分布情况

       注射探针后24 h普鲁士蓝染色结果显示，对照组小鼠肝脏、脾脏均有大量Fe3O4-PSMA探针富集，而心脏、肾脏、肿瘤富集较少；实验组肾脏有较多Fe3O4-PSMA探针富集，而心脏、肝脏、脾脏富集较少，并且少于对照组。实验组仅有肿瘤组织Fe3O4-PSMA探针材料明显多于对照组，结果说明Fe3O4-PSMA探针具有靶向性（图8）。

       HE染色结果显示：Fe3O4-PSMA探针经注射后并未造成主要脏器出现明显的组织破损及炎症反应状态，具有良好的安全性（图9）。

       TUNEL的染色结果显示，与正常对照组相比，经过注射Fe3O4-PSMA探针的小鼠各主要脏器并未明显产生过多的坏死情况（图10A~10J）。从图像的Image J的半定量统计结果可以看出，Fe3O4-PSMA与正常组的主要脏器具有相类似的荧光强度，进一步说明了Fe3O4-PSMA的组织安全性（图10K）。

       普鲁士蓝染色实验结果显示，Fe3O4-PSMA并未过多地沉积于主要脏器当中，染色比例并未与正常组产生明显差异（图11A~11J）。通过Photoshop 2021软件对于铁沉积的比例进行统计发现，Fe3O4-PSMA并未产生过多的铁元素残留，脏器当中存在的铁沉积与其本身含有的微量元素铁有着一定的关联（图11K）。

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图8  两组小鼠普鲁士染色结果（拍照倍数：200×）。8A~8E：对照组心脏、肝脏、脾脏、肾脏及肿瘤组织探针富集；8F~8J：实验组心脏、肝脏、脾脏、肾脏及肿瘤组织探针富集。
Fig. 8  Prussian staining results in two mouse groups (magnification: 200 ×). 8A to 8E: Probe enrichment maps of heart, liver, spleen, kidney, and tumor tissues in the control group; 8F to 8J: Probes are enriched in the heart, liver, spleen, kidneys, and tumor tissues of the experimental group.

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图9  正常组及Fe3O4-PSMA探针注射组的各脏器组织HE染色（拍照倍数：100×）。PSMA：前列腺特异性膜抗原；HE：苏木精-伊红。
Fig. 9  HE staining of organs in normal group and Fe3O4-PSMA probe injection group (magnification: 100 ×). PSMA: prostate-specific membrane antigen; HE: hematoxylin and eosin.

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图10  正常组及Fe3O4-PSMA探针注射组的经注射后7 天各脏器组织（10A~10J）tunel 染色（绿色荧光）及（10K）荧光强度的半定量统计图（拍照倍数：100×）。PSMA：前列腺特异性膜抗原；TUNEL：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记。
Fig. 10  TUNEL staining (green fluorescence) of organ tissues from the control group and Fe3O4-PSMA probe-injected group at 7 days post-injection (10A to10J), and semi-quantitative analysis of fluorescent intensity (10K) (photograph magnification: 100 ×). PSMA: prostate-specific membrane antigen; TUNEL: terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling.

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图11  正常组及Fe3O4-PSMA探针注射组的经注射后7天各脏器组织（11A~11J）普鲁士蓝染色及（11K）荧光强度的半定量统计图（拍照倍数：100×）。
图12  Fe3O4 及Fe3O4-PSMA探针注射后不同时间点小鼠外周血中荧光成像图（12A）及相对荧光强度定量分析（12B）。PSMA：前列腺特异性膜抗原。
Fig. 11  Quantitative semi-quantitative statistical graphs of Prussian blue staining and fluorescence intensity of various organ tissues (11A to 11J) in the normal group and the Fe3O4-PSMA probe injection group 7 days after injection (photographed at magnification: 100 ×).
Fig. 12  Fluorescence images (12A) and quantitative analysis of relative fluorescence intensity (12B) in mouse peripheral blood at different time points after injection of Fe3O4 and Fe3O4-PSMA probes. PSMA: prostate-specific membrane antigen.

2.6 Fe3O4-PSMA体内代谢动力学

       血液循环测量显示：Fe3O4及Fe3O4-PSMA的血液循环时间大体相同。二者随着时间的推移均表现着逐渐递减的趋势，并且在体内48 h后几乎从体内代谢完成（图12A、图12B）。

2.7 HE染色检测两组肿瘤组织病理变化

       前列腺肿瘤组织HE染色结果显示：C4-2组肿瘤细胞占据绝大部分视野，间质水肿、纤维增生不显著（图13C、图13D）。PC-3组肿瘤细胞排列疏密不均，实质区域被间质、坏死灶分割，细胞群呈不规则巢状分布（图13A、图13B）。纤维结缔组织间质增生更明显，间质内伴随出血、炎性细胞浸润，间质反应强于C4-2组。

       注射探针48 h后C4-2组肿瘤组织仅见少量局灶点状出血，大片坏死/液化坏死少见；可见小片淡染疏松区，但坏死范围局限。炎细胞浸润程度轻，散在少量炎性细胞，无明显大片炎细胞聚集灶。而PC-3组细胞可见大片红染出血区域、淡染坏死溶解区；多见局灶性凝固/液化坏死，炎细胞浸润显著，可见大量淋巴细胞为主的炎性细胞形成局灶聚集灶，炎性浸润灶比C4-2组丰富。

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图13  两组前列腺癌荷瘤小鼠肿瘤组织HE染色比较。13A、13B：PC-3对照组（100×、200×）；13C、13D：C4-2实验组（100×、200×）。
Fig. 13  Comparison of HE staining of tumor tissues between the two groups of prostate cancer-bearing mice. 13A and 13B: PC-3 control group (100 ×, 200 ×); 13C and 13D: C4-2 experimental group (100 ×, 200 ×).

3 讨论

       本研究将PSMA单克隆抗体与Fe3O4纳米颗粒结合，成功构建了Fe3O4-PSMA MRI探针，并在高表达PSMA前列腺癌C4-2细胞荷瘤小鼠和极低表达PSMA前列腺癌PC-3细胞荷瘤小鼠模型进行了MRI检测。结果显示：该探针具有良好的物理化学性质，T2弛豫率（r2）达到15.224 mM^-1S^-1；具有优良的生物安全性，CCK-8检测表明在0~500 μg/mL浓度范围内细胞存活率均维持在接近100%的水平，7天体内安全性评价（HE、TUNEL、普鲁士蓝染色）未发现明显的组织损伤、细胞凋亡或铁沉积；能够特异性识别并结合PSMA高表达的前列腺癌组织，注射后6 h即出现T2WI信号减低，24 h TNR值降至0.684±0.038；普鲁士蓝染色证实探针在PSMA阳性肿瘤组织中高度富集，主要经肾脏排泄，48 h内基本从体内清除。本研究成功构建的Fe3O4-PSMA分子成像探针具有良好的生物安全性和靶向MRI效果，为前列腺癌早期诊断提供了实验依据。

3.1 前列腺癌早期诊断的临床需求与MRI分子探针的构建

       前列腺癌早期精准诊断是改善患者预后、降低病死率的关键^[19]。PSA筛查虽应用广泛，但在灰区（4~10 ng/mL）人群中活检阳性率仅约30%，特异性有限^[20]。MRI已成为前列腺癌无创诊断的重要检查手段，然而常规MRI对比剂缺乏主动靶向能力，对早期微小病灶和低级别肿瘤的检出敏感度仍不理想^[21]。近年来，基于前列腺PSMA的分子探针在PET-CT领域取得了重要突破，⁶⁸Ga-PSMA PET/CT的敏感度约80%、特异度约90%^[22]。然而，PET-CT存在电离辐射、设备普及有限，且其空间分辨率难以满足对微小病灶的精细解剖定位需求^[23]。因此，将MRI优异的软组织成像能力与PSMA的高特异性靶向识别能力相结合，构建PSMA靶向的MRI分子探针，有望为前列腺癌的早期精准诊断提供新的检查方法。PSMA在前列腺癌细胞表面高度过表达，且与肿瘤恶性程度正相关，是较理想的分子成像及诊疗靶点^[24]。因此以PSMA为靶点构建MRI分子探针，可将MRI高软组织分辨率与靶向特异性结合^[25]。另外SPION具备良好T2弛豫性能、生物相容性及可修饰性，是MRI对比剂的研究热点^[26]。本研究通过Fe3O4纳米颗粒偶联PSMA单克隆抗体，成功构建了Fe3O4-PSMA MRI探针。FT-IR分析显示，探针光谱中可见伯酰胺特征吸收峰，包括氨基骨架振动峰（NH2 st）、氨基形变振动峰（NH₂δ）、羰基骨架振动峰（C=O st）及碳氮骨架振动峰（C-N st），证实了抗体PSMA与Fe3O4的成功偶联。TEM观察显示，Fe3O4-PSMA分子纳米颗粒大小均匀、分散性良好，这一特性对于保证探针在体内的均一分布和可重复的成像效果至关重要。XPS元素测定显示，探针主要含有C、O、N、S和Fe五种元素，其中N、S元素来源于PSMA抗体蛋白，进一步验证了偶联的成功。上述表征结果与MARINI等^[27]和GHORBANI等^[16]报道的PSMA靶向氧化铁纳米颗粒的表征数据相一致，为其靶向PSMA的分子MRI应用提供了可靠的结构基础。

3.2 分子探针生物安全性评价

       本研究采用流式细胞术和CCK-8法全面评估了Fe3O4-PSMA分子探针对前列腺癌C4-2细胞的体外生物安全性。结果显示：10 μg/mL探针作用24 h后细胞凋亡率为8.101%±0.332%，虽高于对照组（3.961%±0.091%），但仍处于较低水平；而48 h后凋亡率显著升高至29.320%±1.557%，提示探针的生物安全性具有时间依赖性特征。基于24 h较低的凋亡率，我们认为该探针在短期暴露条件下具有良好的细胞水平生物安全性，这一结果与FEI等^[28]报道的FA@Fe3O4纳米颗粒的细胞毒性数据相符。CCK-8检测结果进一步证实，在0~500 μg/mL的较宽浓度范围内，Fe3O4-PSMA探针与C4-2细胞共培养24 h后，细胞存活率均维持在接近100%的水平，未观察到明显的剂量依赖性细胞毒性，表明该探针在体外具有良好的生物相容性。然而，48 h后凋亡率的显著升高也提示，在临床应用中需严格控制探针的体内滞留时间，避免长期蓄积导致的潜在细胞毒性。另外，SPION的生物安全性优势在于其可被单核吞噬细胞系统代谢，铁元素最终以血红蛋白形式储存或经正常的铁代谢途径排出体外^[29]。但SPION的相对较大粒径可能导致其被吞噬细胞快速清除，影响分子成像效果，因此优化探针的粒径分布和表面修饰仍是未来研究的重要方向^[30]。

       为进一步评估探针的长期体内安全性，本研究在注射Fe3O4-PSMA探针后第7天对小鼠主要脏器（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）进行了HE染色、TUNEL染色及普鲁士蓝染色。HE染色结果显示，与正常对照组相比，探针注射组各脏器组织结构完整，未见明显的组织破损、炎性细胞浸润或坏死灶，表明探针未引起急性或亚急性组织损伤。TUNEL染色结果进一步显示，探针注射组各脏器的绿色荧光（凋亡信号）强度与正常组相比无显著差异，半定量统计分析证实两组间荧光强度相近，说明探针注射后7天并未诱导主要脏器发生明显的细胞凋亡。普鲁士蓝染色结果显示，探针注射组各脏器的铁沉积比例与正常组相比无明显升高，表明Fe3O4-PSMA探针并未在主要脏器内大量蓄积或产生明显的铁残留。上述结果综合表明，Fe3O4-PSMA探针在注射后7天观察期内具有良好的组织安全性，未对主要脏器造成长期毒性或显著的铁负荷，为其潜在的临床转化提供了重要的安全性依据。

3.3 靶向MRI效果

       本研究构建了PSMA高表达（C4-2实验组）与低表达（PC-3对照组）前列腺癌荷瘤小鼠模型，通过尾静脉注射Fe3O4-PSMA探针后进行动态MRI检查。结果显示，注射探针6 h时，实验组肿瘤T2WI信号减低，且随时间延长呈进行性下降，TNR值由注射前的1.000降至24 h的0.684±0.038；而对照组肿瘤TNR值虽也有下降，但降幅明显小于实验组，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。这一结果表明，Fe3O4-PSMA探针能够特异性识别并结合PSMA高表达的前列腺癌组织，通过T2阴性对比增强效应显著降低病灶信号强度，实现靶向MRI。本研究中实验组肿瘤TNR值在6 h出现显著差异，与GHORBANI等^[16]报道的4~6 h结果相符，可能与PSMA单克隆抗体较PSMA-11多肽具有更高的亲和力和更长的血液循环时间有关。需要注意的是，实验组肿瘤并未表现为整体信号的均匀降低，而是呈现斑片状T2WI低信号，这一特征反映了探针与PSMA的特异性结合，由于肿瘤组织内PSMA表达存在异质性，探针在PSMA高表达区域选择性富集，并不是非特异性被动富集所致的弥漫性信号改变，进一步证实了探针的靶向性。这一发现与BAKHT等^[6]报道的PSMA在前列腺癌组织中呈异质性表达的特征一致。

3.4 分子探针体内分布特征

       普鲁士蓝染色结果从组织学水平验证了探针的体内分布特征。注射分子探针24 h后，实验组小鼠肿瘤组织及肾脏组织可见较多探针富集，其余组织脏器探针富集量极少；而对照组小鼠肝脏、脾脏则有大量探针富集，心脏、肾脏、肿瘤富集较少。这一分布差异具有重要临床意义，实验组肿瘤组织探针富集明显多于对照组，证实了Fe3O4-PSMA探针对PSMA阳性前列腺癌的主动靶向能力^[31]；而对照组探针主要被肝脏、脾脏等网状内皮系统摄取，符合SPION经单核吞噬细胞系统代谢的一般规律^[32]。肾脏作为探针排泄的主要途径，其富集现象提示探针经肾脏清除，这与相关磁性纳米探针在前列腺癌模型中的代谢途径一致^[33]。然而，肾脏探针富集也提示在临床转化中需关注肾功能不全患者的应用安全性。

       本研究进一步通过FITC荧光标记法监测了Fe3O4-PSMA探针的体内代谢动力学行为。结果显示，Fe3O4及Fe3O4-PSMA在血液循环中的荧光信号强度随时间推移均呈逐渐递减趋势，二者代谢曲线基本一致，且在注射后48 h时荧光信号已基本降至背景水平，表明探针在体内可被逐渐代谢清除。这一代谢特性有助于减少纳米颗粒在体内长期蓄积所带来的潜在毒性风险，进一步支持Fe3O4-PSMA探针的良好生物安全性。

3.5 本研究的局限性

       本研究仍存在一定局限性。首先，本实验未设置Fe3O4-IgG非特异性抗体对照探针，导致无法完全排除肿瘤EPR效应（enhanced permeability and retention effect）介导的被动蓄积对成像信号的影响，这是本研究在设计上的重要缺陷。需要说明的是，尽管缺失该对照，但实验组肿瘤并未表现为EPR效应常见的整体弥漫性信号均匀降低，而是呈现斑片状T2WI低信号，这一特征与PSMA在前列腺癌组织中异质性表达的分布特征高度一致，从侧面支持了探针富集主要源于PSMA介导的特异性主动结合。然而，该间接证据仍无法替代Fe3O4-IgG对照组所提供的直接验证数据，这是本研究最为突出的实验设计缺陷，后续研究将设置Fe3O4-IgG非特异性抗体探针对照组作为重点，以更严谨地验证靶向特异性。因此，在解释本研究结论时，需充分考虑到上述局限性，目前尚不能将T2信号的降低完全归因于主动靶向；其次，动物实验观察时间较短，未能评估探针的长期体内代谢动力学特征及慢性毒性；最后，未与临床常用的钆基对比剂进行成像效果比较，无法明确其相对优势，这也是我们后续研究的重要方向之一。

4 结论

       综上所述，本研究结果显示Fe3O4-PSMA磁共振分子成像探针具有以下优势：（1）具有良好的生物安全性，短期暴露条件下细胞毒性较低；（2）靶向特异性强，能够显著降低PSMA阳性前列腺癌病灶的T2信号强度，实现特异性成像^[34]；（3）体内分布合理，肿瘤组织富集明显，主要经肾脏排泄，而肝脏、脾脏富集相对较少。本研究为前列腺癌靶向分子成像的后续研究提供实验基础。