实体肿瘤的生长、侵袭及转移依靠肿瘤血管生成，抑制肿瘤血管生成已成为抗肿瘤治疗的新热点^[1]。抗血管生成治疗主要是通过抑制内皮细胞迁移、吸附、活化和增殖或直接针对肿瘤血管靶分子等机制，以达到抑制血管生成的目的^[2]。恩度(Endostatin)是国内首例重组人血管内皮抑制素，可以多靶点发挥抗血管生成作用^[3]。动脉自旋标记灌注成像是指采用内源性示踪剂，即动脉血中水分子的动脉自旋标记(arterial spin labeling，ASL)来研究组织的灌注水平的成像技术^[4]。由于其具有无创性，在评价脑血管病、脑肿瘤病变的诊断、治疗及预后等方面显示了其独特的优势，而在体部及骨肌系统疾病评估中的应用尚处于探索阶段^[5]。肖华锋等^[6]利用三维准连续动脉自旋标记灌注成像对WHO Ⅱ级胶质瘤的临床分型意义进行了初步研究，Cho等^[7]利用基于FAIR序列的2D ASL评价软组织肿瘤的血量灌注情况，证明ASL评价软组织肿瘤血流灌注是可行的。3D-PCASL是一种全新容积灌注成像技术，采用准连续性标记、Spiral K空间采集、FSE读取方式，同传统2D ASL相比，信噪比明显增加，应用自旋回波及梯度回波技术，有更高的读出带宽及背景抑制，对减少图像失真及减少磁敏感伪影有积极的意义^[8,9,10]。

       目前，尚未见3D-PCASL应用于软组织肿瘤抗血管生成治疗评价的相关报道，笔者采用3D-PCASL和病理对照研究评价恩度对软组织VX2肿瘤抗血管生成的疗效，旨在探讨3D-PCASL技术用于评价软组织肿瘤抗血管生成治疗的可行性。

1　材料与方法

1.1　材料

       兔软组织VX2肿瘤模型制作：纯种新西兰白兔24只，购于武汉大学动物房，月龄3~4个月，体重2.5~3.0 kg，雌雄不限。VX2瘤株购于华中科技大学附属协和医院。病理所需材料及仪器：石蜡、甲醛、二甲苯、无水乙醇、30% H2O2、羊血清、DAB浓缩型试剂盒、中性树脂、二抗及三抗、PBS溶液KH2PO4、柠檬酸C6H8O7•H2O、柠檬酸钠Na3C6H5O7•2H2O、正置显微镜、恒温烘箱、石蜡切片机、摊片机、移液器、水浴锅、IMS图像分析系统、数码相机等。本实验经伦理委员会审查通过。

1.2　方法

       将冻存的VX2肿瘤组织块在-20℃至-4℃条件下复苏，在无菌条件下将其剪成1 mm³的组织碎片，加入适量生理盐水配成肿瘤碎片悬浮液，注射于24只兔后肢肌肉内，2周后通过MRI平扫，在兔股骨上段周围软组织内可见直径10~30 mm大小的软组织肿块，即制成动物模型。

       影像检查设备及技术：采用美国GE750 3.0 T MR扫描仪，瘤兔静脉麻醉成功后俯卧位固定于特制的动物固定模具上，用标准膝关节线圈进行扫描。24只瘤兔随机分为两组：(1)对照组12只；(2)实验组12只；实验组用恩度：盐水比例为1.5 mg/8 ml溶液，连续对每只瘤兔每晚同一时间段进行瘤周肌注，为期两周。对照组用0.9%生理盐水8 ml替代恩度溶液，方法同实验组。瘤兔下肢分别在给药前及给药两周结束后行常规MRI检查，包括FSE-T2WI (TR 2500 ms，TE 38 ms/Ef)、FSE-T1WI序列(TR 400 ms，TE 19.4 ms/Ef)，层厚3 mm，层间距2 mm，矩阵512×512，EC1/1 31.2 kHZ，FOV 110 mm×110 mm。3D-PCASL采用背景抑制、伪连续性标记、螺旋K空间填充的FSE信号读取方式，标记延迟时间(PLD)1525 ms，反转角111°，激励3次，EC1/1 62.5 kHZ，层厚3 mm，层数32层，层间距0 mm，TR 4388.0 ms，TE 10.9 ms，FOV 110 mm×110 mm，矩阵512×8，扫描时间为4 min 15 s。扫描获得的兔软组织肿瘤横断位ASL原始图像用AW 4.6工作站(GE Healthcare) Functool软件进行后处理，生成灌注参数BF伪彩图。选取通过肿瘤长轴最大径的横断面，确定肿瘤中心点，建立二维坐标并作最小外切圆，量取X与Y轴上肿瘤边缘至中央径线的10%点，以此点与肿瘤中心点之间的距离为半径作同心圆，两圆之间的区域定义为肿瘤周边。如果肿瘤直径>5 cm，则选择肿瘤边缘内延5 mm的区域作为肿瘤边缘区域^[11]，其余区域均作为肿瘤中心。在肿瘤最大层面，分别在肿瘤边缘和肿瘤中心取三个感兴趣区(ROI)，直径约5 mm，避开肿瘤坏死、囊肿、正常血管等区域，分别测得肿瘤边缘及中心BFASL值，取平均值，20只瘤兔给药前后共得到80个BFASL平均值。

       病理学观察及定量分析：瘤兔行MRI扫描结束后，在武大第一临床学院无菌实验室用空气栓塞法将其处死，参照MRI感兴趣区对肿瘤组织的边缘及中心进行取材，剥离肿瘤的坏死区域，用4%的多聚甲醛固定，分别装入不同标记的瓶子中，用石蜡进行包埋、切片，行常规的HE染色、CD31及VEGF抗体标记血管内皮细胞。选择高倍镜视野(　×200)，按染色深浅分为4级：未见染色为0分(-)，染成浅黄即轻度染色为1分(+)，染成棕黄即中度染色为2分(++)，染成棕褐色即重度染色为3分(+++)；阳性细胞百分比：未见染色为0分(-)，染色细胞< 25%为1分(+)，染色细胞>25%且< 50%为2分(++)，染色细胞>50%为3分(+++)；两者积分0~2分判定为阴性，>2分为阳性^[12]。用低倍镜(　×40)选择微血管密集区，再在高倍镜下(　×200)选择5个视野计取微血管数目，取其平均值作为MVD值。微血管的计数标准：与其他微血管、瘤胞或结缔组织分开的单个棕黄色内皮细胞或内皮细胞团作为一根血管，血管肌层较厚的不计数，管腔大于8个红细胞直径的不计数，除外纤维化、出血及边缘反应区。血管内皮生长因子(VEGF)以肿瘤细胞的胞质内显示棕黄色颗粒作为阳性，1%~25%、≥25%~50%、≥50%~75%、≥75%阳性细胞表达率分别对应为弱阳性、阳性、较强阳性及强阳性^[1]。

1.3　统计学分析

       采用SPSS 17.0软件，定量资料以均数±标准差表示，软组织VX2肿瘤中心及边缘区域平均MVD值、BFASL值差异分别采用独立样本t检验，MVD值与BFASL参数的相关性采用Pearson相关分析，所有统计分析结果以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　实验动物情况

       324只新西兰兔肿瘤种植均成功，2只实验组瘤兔在行MRI扫描前，因麻醉意外死亡；2只对照组瘤兔在动物房饲养过程中意外死亡；最终实验组和对照组各10只动物完成MRI扫描。

2.2　渗透性参数与免疫组化定量分析对照

       实验组与对照组肿瘤中心与边缘MVD值、BFASL值差异均具有统计学意义(P<0.05)；对照组肿瘤中心及边缘MVD值、BFASL值治疗后较治疗前增大，其差异均具有统计学意义(P<0.05)。实验组治疗后肿瘤中心及边缘VEGF表达均较治疗前及对照组减低；20只瘤兔ASL显示中心区域局部不同程度血流灌注缺失，病理结果提示肿瘤中心区域局部组织坏死(表1；图1,图2,图3,图4,图5,图6,图7,图8)。

点击查看大图

图1~4  图1，2分别为兔软组织VX2肿瘤恩度治疗前轴位T2WI、BFASL值伪彩图，肿瘤边缘区域较中心区域灌注参数增高；图3，4分别为治疗后T2WI、BFASL值伪彩图，肿瘤体积持续增大，肿瘤边缘及中心区域灌注参数较治疗前均有明显减低，肿瘤中心可见坏死区
图5~8  图5，6分别为实验组肿瘤组织边缘治疗前后CD31染色后镜下照片(　×200)，血管被染成紫褐色(箭头)，MVD治疗后较治疗前明显减少；图7，8分别为治疗前后肿瘤组织边缘VEGF染色后组织的镜下照片(　×200)，肿瘤细胞胞质内出现棕褐色颗粒(箭头)，治疗后较治疗前表达减弱
Fig. 1—4  Fig.1, 2: The T2WI and BFASL pseudo-color images of tumor pretherapy, the perfusion para-meters of tumor margin were higher than tumor centers. Fig.3, 4: The T2WI and BFASL pseudo-color images of tumor after treatment. Tumor was biger and biger, the perfusion parameters of tumor margin and centers were lower than pretherapy, there was necrosis area in tumor centers.
Fig. 5—8  Fig.5, 6: The microphotograph (　×200) of the margin of the experimental group tumors before and after treatment, using CD31 staining. The blood vessels were stained purple brown (arrows), the MVD after treatment was obviously decreased than before treatment. Fig.7, 8: The microphotograph (　×200) of the margin of the experimental group tumors before and after treatment, using VEGF staining. There were brown granules in tumor cell (arrows), the VEGF expression after treatment was obviously weakened than before treatment.

点击查看表格

表1  实验组和对照组肿瘤边缘及中心BFASL与MVD值比较
Tab. 1  Comparison of the BFASL、MVD of tumor margin and center between the experimental group and the control group

2.3　实验组VX2肿瘤MVD值与BFASL灌注参数相关性分析

       实验组肿瘤边缘及中心区域MVD值与BFASL值具有良好的相关性(r=0.891、r=0.626；P值均<0.05) (图9，图10)。对照组肿瘤边缘及中心区域MVD值与BFASL值具有良好的相关性(r=0.960、r=0.917；P值均<0.05) (图11，图12)。

点击查看大图

图9  实验组肿瘤边缘MVD与BFASL相关性分析
图10  实验组肿瘤中心MVD与BFASL相关性分析
图11  对照组肿瘤边缘MVD与BFASL相关性分析
图12  对照组肿瘤中心MVD与BFASL相关性分析
Fig. 9  The correlation analysis between MVD and BFASL of tumor margin of experimental group.
Fig. 10  The correlation analysis between MVD and BFASL of tumor center of experimental group.
Fig.11  The correlation analysis between MVD and BFASL of tumor margin of control group.
Fig.12  The correlation analysis between MVD and BFASL of tumor center of control group.

3　讨论

       血管生成是肿瘤生长、侵袭及转移过程中最为重要的环节，抑制肿瘤血管生成已成为近年来抗肿瘤治疗热点，VEGF可以促进肿瘤血管生成，使肿瘤组织MVD增加^[13,14]。本实验通过3D-PCASL灌注成像及病理对照，对兔软组织VX2肿瘤恩度抗血管生成治疗进行评价，结果显示肿瘤边缘血供丰富，中央区域血供相对较少，证实软组织VX2肿瘤具有血供区域分布异质性特点。实验组肿瘤边缘及中心治疗后BFASL、MVD值及VEGF表达均较治疗前及对照组降低，证实恩度通过抑制血管内皮细胞迁移、减少肿瘤新生血管形成、改善血管异构以及降低血管通透性的机制发挥抗肿瘤血管生成的作用。

       本研究通过恩度对兔软组织VX2肿瘤进行抗血管生成干预，采用3D-PCASL来评价软组织VX2抗血管生成前后的血流灌注变化，并通过病理对照，来验证3D-PCASL评价软组织VX2血流灌注变化的可行性。3D-PCASL采用了更长净读取时间，通过自旋回波信号采集，进一步减少了信号回落和图像在高梯度回波区域失真，有助于获得高质量的图像；同时，全部三维影像在相同的流入时间获取，避免由于标记血到达成像区域的时间差异对图像造成影响，提高了信噪比，更好地保证参数的准确性。本研究结果显示恩度抗肿瘤血管生成后，肿瘤边缘及中心区域的BFASL值、MVD值具有良好的相关性。证实3D-PCASL用于评价软组织肿瘤抗血管生成治疗是可行的。

       本研究局限：(1) 3D-PCASL评价软组织灌注的最佳反转恢复时间TI值尚待进一步优化；(2)病理取材位置与ASL渗透性参数的ROI无法完全一一对应，MVD检测中每200倍视野微血管计数的人为主观偏差不容忽视；(3)本实验软组织VX2肿瘤生长较快，出现肿瘤中心区域坏死的比例较高，与临床软组织恶性肿瘤病例的病程不完全一致，评价恶性肿瘤血供的区域异质性尚待深入研究。

       总之，软组织肿瘤抗血管生成治疗前后，3D-PCASL的BFASL值与肿瘤的MVD值具有良好的相关性，用于评价软组织肿瘤抗血管生成治疗是可行的。