胰岛素抵抗是2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的重要发病机制^[1]，T2DM患者多饮多食的摄食行为与患者胰岛素抵抗互为因果^[2]。在大脑中摄食行为主要由摄食中枢调控并与中枢奖赏系统相关，如何改善T2DM患者异常的摄食调控行为成为近期的研究热点。既往多个研究证明亮氨酸可以通过作用于大脑引起摄食抑制，改善胰岛素敏感性^{[3,4,5,6,7,8,9]}，是目前所知唯一脑室内注射时能产生厌食反应的氨基酸^[3,8]，但其对摄食中枢的具体调控机制尚不明确。Laron^[10]认为异常的中枢胰岛素信号传导通路可导致食物摄取功能异常，Kulve等^[11]研究发现，功能磁共振可显示T2DM患者奖赏摄食相关脑区的过度激活。本研究利用静息态功能磁共振成像（resting-state functional MRI，rs-fMRI），研究摄食相关的脑区之间BOLD信号间相关性的特点以及T2DM患者给予亮氨酸刺激后摄食奖赏相关脑区的功能连接改变情况，以探索亮氨酸对健康志愿者（healthy control ，HC）以及2型糖尿病患者摄食奖赏中枢影响的机制。

1　材料与方法

1.1　研究对象

       本研究共招募受试者17名，T2DM组9例，HC组8名。匹配两组被试者年龄、性别和受教育程度。

       T2DM组纳入标准：(1)所有病例诊断均符合2010年美国T2DM协会诊断标准；(2)糖尿病病程中位数为6年，所有患者大于1年，小于10年；(3)服用药物类型相同，不需要使用胰岛素；(4)无严重并发症；(5)右利手。

       排除标准：(1)常规头部MR扫描存在脑内灰白质异常信号；(2)合并肿瘤、其他内分泌疾病、高血压或肝性脑病；(3)不能耐受磁共振者，(4)体内有金属植入无法取出者；(5)神经心理学测试交流困难；(6)听力障碍。

       一般临床资料包括：性别、年龄、受教育程度、体重指数（body mass index，BMI）、糖化血红蛋白水平（HbA1c）、空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）及餐后血糖（postprandial blood glucose，PBG）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein ，LDL）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、甘油三脂（triglyceride）、总胆固醇（total cholesterol)。利用胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment 2-IR，HOMA2-IR)计算胰岛素抵抗水平。HOMA2-IR Caculator由(https://www.rdm.ox.ac.uk/)提供。

       本研究已通过中南大学湘雅三医院医学伦理委员会批准，每名受试者均被告知所有研究内容并要求签署知情同意书。

1.2　MRI图像采集

       采用Philips 3.0 T磁共振扫描仪，8通道头部线圈。受试者嘱禁食12 h，提前3~4 d停药，实验前打好留置针以便多次采血。为了排除口服时肠蠕动及消化作用影响，每名受试者在不同日（间隔至少1周）用相同序列采集口服300 ml水后MR数据。为排除不同日扫描基础状态不同带来的影响，先空腹扫描常规T1WI、T2WI、FLAIR水抑制序列、DWI序列及BOLD序列获得基线值。口服亮氨酸后（食品级，上海sigma公司；亮氨酸用量：100 mg/(kg•d），配300ml纯净水溶液（约2％浓度，人均约6.6 g）)，根据亮氨酸代谢规律^[12]以及为了排除苦味影响，受试者静卧30 min之后开始扫描，连续动态扫描4个BOLD（每个BOLD序列约6 min 40 s），时长约30 min。

       本实验所有研究对象由同一名高年资技师完成扫描，扫描过程中嘱受试者放松、闭眼静卧并保持头部不动，保持清醒状态。

       扫描序列：(1)常规序列扫描T1WI、T2WI、FLAIR水抑制序列、DWI序列。(2) 3D T1结构像，参数：TR 2300 ms，TE 2.93 ms，TI 1100 ms，层厚1 mm，视野（FOV) 240 mm×240 mm，体素大小1 mm×1 mm×1 mm，反转角90° ，矩阵240×240，共计226层矢状面图像，扫描时间为376 s。(3)静息态脑功能成像扫描，采用回波平面成像（echo planar imaging sequence，EPI）序列，参数：TR 2000 ms，TE 30 ms，矩阵64×64，FOV 240 mm×240 mm，层厚4 mm，间隔0 mm，得到200个全脑EPI数据。

1.3　血生化指标检测

       扫描前空腹采血，口服亮氨酸后每隔1个BOLD序列的时间采集一次血样，扫描开始后，利用两个BOLD序列之间的间隔时间采集一次血样，每次采血3 ml，离心分离血清，离心参数2800转/min，22摄氏度，离心6 min，-20度冰冻，每周送检，血清送检血糖及血胰岛素，血浆送检亮氨酸。质谱法分析血浆亮氨酸浓度、己糖激酶反应法测量血糖、用化学发光酶免疫分析法测量血胰岛素。

1.4　统计分析

       采用SPSS 22.0软件统计17名受试者的各项临床指标，先进行两样本Levene方差检验，之后进行两独立样本t检验；性别进行χ²方检验，由于总样本量n<40，采用Fisher确切概率法检验。采用Pearson相关性分析法分析有意义脑区功能连接平均值与各临床指标之间的相关性。

1.5　MRI数据处理

       利用DPARSF (http://restfmri.net)软件对转换数据预处理：(1)为防止初始扫描受试者适应扫描过程会对结果造成影响，剔除前10个全脑EPI数据；然后对余下190个全脑EPI数据进行图像层、运动校正；(2)把数据利用仿射变换转换到标准MNI空间（montreal neurological institute，MNI），体素大小设定为3 mm×3 mm×3 mm、用数据滤波去除噪声干扰（范围设定在0.01~0.10 Hz） ；(4)基于Friston 24参数模型剔除头动的影响。

       选取大脑中摄食奖赏各相关脑区为种子点：根据初步分析本文选取双侧壳核和眶额皮层(orbitofrontal cortex，OFC)为种子点，分别计算它们与大脑其他体素间的功能连接，获得功能连接图像，采用Fisher转换把计算得到的功能连接值转换为z值。

       采用单向AVONA分析分别对两组被试者双侧壳核与全脑体素间功能连接进行组内比较，并采用AlphaSIM进行多重比较校正。显著性结果用xjview软件（http://www.alivelearn.net/xjview8/）呈现。提取正常被试组存在显著统计差异团块平均功能连接强度与相关临床指标(HOMA2-IR，糖化血红蛋白，空腹态血糖和血胰岛素，给药后第一个BOLD相应亮氨酸、血糖和血胰岛素水平)进行Pearson双因素相关性分析，同时提取T2DM相应团块功能连接强度平均值进行相同统计分析。

2　结果

2.1　一般临床资料

       两组受试者年龄、性别、受教育程度、BMI、CHOL、LDL均没有显著差异(P>0.05)。FBG、PGB、HbAlc、TG、HDL在统计学意义上有显著差异(P<0.05；表1)。

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表1  受试者基本信息和血生化指标
Tab. 1  Demographic information and blood biochemical indicators of two groups

2.2　血液生化指标

       口服亮氨酸后T2DM组与正常对照组血浆胰岛素与亮氨酸均明显增高(P<0.05)，血胰岛素约27 min达峰值水平，T2DM组血胰岛素基础值高于正常对照组，口服亮氨酸后0~35 min两组胰岛素升高幅度无明显差别，42 min两组血胰岛素量开始回落，正常对照组回落速度明显大于T2DM组(P<0.05)。血亮氨酸约35 min左右达峰值水平（图1），血糖水平未见显著改变(P >0.05)。

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图1  受试者口服亮氨酸后血浆亮氨酸、血胰岛素及血糖变化趋势图。口服亮氨酸后，血胰岛素（A）及血亮氨酸(B)显著增加(P<0.05)，血糖(C)未见显著改变(P>0.05)
Fig. 1  The value change tendency of plasma leucine, plasma insulin and plasma glucose in two groups after oral leucine test. After oral leucine, the plasma insulin (A) and plasma leucine (B) increased significantly (P<0.05), the plasma glucose (C) slightly lower than the baseline, but with no statistical significance (P>0.05).

2.3　以壳核和眶额叶皮层为种子点的功能连接分析结果

       根据初步分析本研究脑功能连接强度仅于正常组给药后的第1个BOLD序列有显著增加(P<0.05)，因此本研究选取给药后第1个BOLD序列功能连接值进行分析，此处对应着血亮氨酸峰值水平，结果显示：正常人口服亮氨酸后右侧小脑（小脑后叶、小脑扁桃体）与左侧眶额皮层功能连接强度增加(P<0.05)；双侧前额叶皮层（眶额皮层和前扣带回、部分边缘叶）与左侧壳核功能连接强度增加(P <0.05)，T2DM患者口服亮氨酸后上述脑区功能连接强度未见显著改变(P>0.05；图2，表2)。

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图2  正常人与T2DM患者具有显著差异的脑区分布图。Limbic lobe：边缘叶；Right Cerebellum：右侧小脑；Cerebellar Tonsil：小脑扁桃体；ACC：前扣带回；PFC：前额叶皮层；OFC：眶额皮层
Fig. 2  The distribution of brain regions with significant differences between HC and T2DM patients. Note: ACC: anterior cingulate cortex. PFC: prefrontal cortex. OFC: orbitofrontal cortex.

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表2  正常组以壳核、OFC为种子点时有显著功能连接改变脑区的MNI坐标
Tab. 2  The MNI coordinates of brain regions with significant altered functional connection when choose putamen and OFC as seeds in HC groups

2.4　大脑功能连接结果与相关临床指标之间的相关性分析

       结果显示正常组的左侧壳核和双侧前额叶(OFC、ACC)、边缘叶之间的连接强度与相应时段亮氨酸水平呈正相关(r=0.749 ，P=0.032)，左侧OFC和右侧小脑后叶之间的功能连接强度与相应时段血亮氨酸水平呈正相关性(r=0.716， P=0.046)。糖尿病组亮氨酸水平与各脑区之间没有相关性(P>0.05)，其左侧OFC与右侧小脑功能连接强度与空腹胰岛素水平呈负相关(r=-0.729， P=0.026)，但是与口服亮氨酸后胰岛素水平无显著相关性(P>0.05)；左侧OFC与右侧小脑功能连接强度与HOMA2-IR呈负相关(r=-0.680， P=0.044；图3)。

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图3  各项指标与部分有显著差异脑区相关性分析图。左侧OFC为种子点时功能连接增加的脑区与空腹状态胰岛素水平（A）和HOMA2-IR之间的相关性（B）；左侧OFC (C)及左侧壳核（D）为种子点时功能连接增加的脑区与血亮氨酸之间的相关性
Fig. 3  The graph of correlation analysis between various clinical indicators and some brain regions with significant differences. Correlation between functional connection increased brain regions with baseline HOMA2-IR (B) and insulin (A) when choose the OFC as seeds (A). Correlation between functional connection increased brain regions with plasma leucine when choose the left putamen (D) and the left OFC (C) as seeds (B).

3　讨论

3.1　关于大脑功能连接结果

       在大脑中，摄食行为主要与奖赏系统及摄食中枢相关，包括下丘脑、杏仁核、伏隔核、腹侧被盖区、纹状体、ACC、OFC、PFC、脑岛等^[13]。OFC是奖励信息的"交通枢纽"^[14,15,16]。壳核参与奖励信号和奖励预测^[17]。OFC和小脑扁桃体能感受特定营养素^[18]；PFC激活时会增加多巴胺神经元的激活，是奖赏摄食中枢重要核团^{[14,15,16,19]}。ACC参与监测奖励，与前额叶皮层和运动区域相互关联^[16]。边缘系统与过度食物奖励有关^{[14,15,16,19]}。

       本研究结果显示，口服亮氨酸后正常组右侧小脑后叶与左侧OFC间的功能连接强度增加；双侧前额叶皮层（ACC、OFC、部分边缘叶）与左侧壳核连接强度增加，并且与血亮氨酸呈正相关。但同等条件刺激下，T2DM患者上述脑区功能连接无显著增加，其功能连接平均值与血浆亮氨酸之间无显著相关性，其左侧OFC与右侧小脑后叶功能连接强度与HOMA-IR、空腹状态胰岛素水平呈负相关。结果表明，亮氨酸可以刺激奖赏摄食相关脑区功能连接增加，这与既往研究报道的亮氨酸可以调节摄食一致。然而T2DM患者相应脑区不响应血亮氨酸浓度增高，并且随着其胰岛素抵抗程度增高伴随这些脑区功能连接强度减弱，提示T2DM患者这部分脑区功能连接受损。

       本研究结果与既往陈娟等^[20]的OFC被证实在T2DM患者中与多个脑区连接存在异常的研究结果一致；Chris等^[21]的研究也表明T2DM的ACC、PFC、小脑、边缘皮质及壳核的灰质体积减少，Kulve等^[11]表明T2DM可引奖赏摄食异常兴奋，证实了T2DM这部分脑区相比正常人确实存在异常。另外，Öst等^[22]发现T2DM患者的中枢胰岛素信号通路中mTORC1的反馈调节作用受损，mTORC1的功能受损、活化异常，从而引起胰岛素抵抗，出现饱腹感下降致摄食成瘾^[22,23,24]。而亮氨酸又是mTOR的关键兴奋因子^[3,8]，大脑中亮氨酸主要是通过mTOR信号传导抑制食物摄入^[8,9,25,26]。T2DM患者亮氨酸感受器mTOR受损、胰岛素信号通路传导障碍以及大脑奖赏网络结构功能受损，这可能是T2DM患者亮氨酸刺激后磁共振功能连接强度减弱、亮氨酸传感无应答的机理。

3.2　关于血液生化指标结果

       本研究结果发现随着血亮氨酸浓度的升高，血胰岛素明显增高，血糖改变不显著，这与既往研究一致^[27]，但相关性结果表明脑功能连接强度与给药后胰岛素水平没有相关性，Heni等^[28]也表明胰岛素不会影响食物摄入及相关脑区，Steinert等^[29]表明口服给药时仅有高浓度的血亮氨酸可以引起摄食抑制，血亮氨酸浓度需达到一定"阈值"，本研究其他BOLD序列大脑没有响应或是与相应时段血亮氨酸浓度下降相关。因此，亮氨酸对奖赏摄食中枢的作用可能是独立于胰岛素以外的影响因素。

3.3　结论

       总之，本研究利用fMRI研究了正常人以及T2DM患者在给予亮氨酸刺激下奖赏摄食相关脑区间的功能连接改变情况，亮氨酸可使正常人部分奖赏摄食脑区间功能连接增加，而T2DM相关脑区间功能连接无显著增加，证明了T2DM患者左侧壳核及左侧OFC与多个脑区功能连接存在异常，其中以左侧OFC与右侧小脑后叶之间的连接强度与胰岛素抵抗程度相关。口服亮氨酸后的rs-fMRI可以反映奖赏摄食相关脑区的功能连接强度的情况，中枢胰岛素抵抗可能损伤大脑对亮氨酸的感知通路。

3.4　本研究的局限性

       因为研究的设计复杂，招募困难，样本含量较少，可能对本研究结果造成干扰；需要进一步排除治疗方案对本研究的影响。