乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，具有多种不同的组织学亚型和临床结局。Ki-67在乳腺癌中表达阳性率约78%^[1]，其可在新辅助化疗前后预测患者预后^[2]，判断化疗疗效^[3]，且与患者的无病生存率相关^[4]。已有文献报道扩散加权成像（diffusion weighted imaging，DWI）可潜在预测乳腺癌的Ki-67增殖指数^[5]，但表观扩散系数（apparent diffusion coefficient，ADC）是基于单指数高斯模型拟合方式，同时包含组织内水分子扩散和微循环灌注效应，不能反映真实的水分子扩散情况^[6]。基于DWI，Le Bihan等^[6]在1986年首次提出体素内不相干运动扩散（intravoxel incoherent motion，IVIM）模型，该模型无需使用外源性对比剂，利用双指数拟合方式分别得到微循环灌注和组织扩散的定量参数，能够同时反映组织细胞扩散率和微毛细血管灌注情况。近年来，IVIM模型在乳腺疾病中的应用逐渐增多，虽有研究报道了IVIM定量参数与乳腺癌Ki-67增殖指数之间的相关性^[7,8]，但相关研究多是在病灶最大层面或肿瘤实性部分勾画感兴趣区（region of interest，ROI)，该方法己被指出存在一定局限性^[9]。另外，以往研究多只是关注定量参数的平均值，缺乏更多能够量化评估肿瘤异质性的指标。相比之下，全肿瘤直方图分析可提供超出平均值更多的量化指标，可定量反映肿瘤病理变化的异质性，且不需要额外的硬件和附加序列，可重复性和一致性较高^[10]。本研究旨在探讨传统DWI和IVIM直方图各量化参数与乳腺癌Ki-67增殖指数之间的关系，以期在活体评估乳腺癌预后，为临床选择合理的手术方式提供影像学依据。

1　材料与方法

1.1　一般资料

       收集2018年10月至2019年5月就诊于联勤保障部队第九四〇医院行术前乳腺MRI检查，并经穿刺活检或手术病理证实为乳腺癌的患者。所有患者均在检查前签署知情同意书。纳入标准：(1)术前乳腺MRI资料完整，包括T1WI、T2WI、IVIM、动态增强磁共振成像（dynamic contrast enhanced MRI，DCE-MRI）图像；(2）乳腺MRI检查前未行穿刺活检、放化疗及任何临床干预措施。排除标准：(1)图像质量不佳，影响诊断和数据测量；(2）免疫组化资料不完整。最终入组56例乳腺癌患者，共57个病灶，1例为单乳双灶。所有患者均为女性，年龄范围30~67岁，平均年龄（47.8± 9.2）岁。

1.2　仪器及检查方法

       采用GE MR 750 3.0 T超导磁共振扫描仪，8通道相控阵乳腺专用线圈。受检者取俯卧位，双侧乳腺自然悬垂于线圈内。扫描序列包括：(1)常规三平面定位及校正。(2）轴位T2WI-IDEAL扫描，TR 5284.0 ms，TE 85.0 ms，层厚4.0 mm，间隔1.0 mm，矩阵320×256 ，FOV 32 cm×32 cm，NEX 1。(3）轴位T1WI扫描，TR 420.0 ms，TE 6.4 ms，层厚4.0 mm，间隔1.0 mm，矩阵320×256，FOV 32 cm×32 cm，NEX 1。(4）双乳矢状位T2WI抑脂扫描，TR 3500.0 ms，TE 85.0 ms，层厚4.0 mm，间隔1.0 mm，矩阵288×224，FOV 20 cm×20 cm，NEX 2。(5）轴位IVIM扫描，TR 4000.0 ms ，TE 74.3 ms，层厚4.0 mm，间隔1.0 mm，矩阵128×128，FOV 32 cm×32 cm，b值为0、30、50、90、120、200、400、600、800、1000、1150、1500 s/mm²，激励次数为2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、2、4。(6）轴位动态增强扫描，采用3D-VIBRANT序列，TR 4.2 ms ，TE 2.1 ms，层厚1.6 mm，无间隔扫描，矩阵320×256，FOV 36 cm×36 cm，NEX 1。先行蒙片扫描，随后经肘静脉团注对比剂钆喷酸葡胺(Gd-DTPA) ，流速2.0 mL/s，剂量0.1 mmol/kg，之后注射25 mL生理盐水冲管，连续采集7个时相图像，单期扫描时间58~60 s。

1.3　图像分析及后处理

       所有IVIM原始图像以DICOM (Digital Imaging and Communication in Medicine）格式导入FireVoxel软件(CAI2R ，New York University ，NY ，USA)。DWI数据采用单指数模型拟合，b值选取0和1000 s/mm²，公式：Sb/S0=exp (-bADC)；IVIM数据采用双指数模型拟合，b值选取0、30、50、90、120、200、400、600、800、1000、1150和1500 s/mm²，公式：Sb/S0=(1-f) exp (-bD)+f exp (-b D^*)。其中Sb代表相应b值时体素内信号强度，S0为b=0 s/mm²时的信号强度。ADC值包含水分子扩散效应和微循环灌注效应，单位为mm²/s ；D值为真扩散系数，剔除了微循环灌注效应，反映单纯水分子扩散效应，单位为mm²/s ；D^*为假性扩散系数，反映体素内微循环灌注相关的扩散系数，主要受微循环血流速度的影响，单位为mm²/s ；f是灌注分数，反映体素内微循环灌注相关效应占总体扩散效应比例，单位是百分数（%)。

       肿瘤ROI的勾画由2名放射科医师（分别具有7年和3年乳腺MRI诊断经验）采用双盲法共同勾画完成。具体勾画步骤：参考轴位T2WI抑脂和DCE-MRI图像，在b值＝1000 s/mm²的IVIM图像上从上到下逐层勾画病灶边界，累积生成3D ROI（图1A~1C)。考虑到全肿瘤ROI分析对肿瘤异质性分析的重要性，勾画时应包含出血、坏死、囊变区，且ROI面积应略小于肿瘤实际病灶面积，以减少部分容积效应^[11]。使用单指数和双指数模型对ROI内的所有体素进行拟合，计算出ADC值、D值、D^*值和f值，并得到相应的ADC图、D图、D^*图和f图（图1E~1H)。采用SPSS 23.0进行直方图分析，计算IVIM各定量参数的最小值（minimum)、最大值（maximum)、平均值（mean)、第10百分位数（10^th)、第25百分位数（25^th)、第50百分位数／中位数（50^th)、第75百分位数（75^th)、第90百分位数（90^th)、偏度（skewness）及峰度（kurtosis)（图1I~1L)。

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图1  女，48岁，右乳浸润性癌，非特殊型。A：轴位T2WI图像示右侧乳腺弥漫性异常信号灶，边界不清，同侧乳头回缩，乳头周围皮肤局限性增厚；B：DCE-MRI示右侧乳腺病灶呈不规则肿块样明显强化，强化尚均匀；C：IVIM (b=1000 s/mm²）图像，参考轴位T2WI-fs和DCE-MRI图像，沿肿瘤边界勾画所有肿瘤范围；D：病理免疫组化染色，Ki-67指数约70%；E~H：ADC值、D值、D^*值、f值伪彩参数图；I~ L：肿瘤感兴趣区内的ADC值、D值、D^*值及f值的直方图
Fig. 1  Female, 48 years old, right breast invasive cancer, non-special type. A: T2WI image shows a slightly higher signal focus of right breast; B: DCE-MRI shows significant enhancement of the lesion in the right breast; C: IVIM (b=1000 s/mm²) images, refer to T2WI-fs and DCE-MRI images, all tumor ranges are delineated along the tumor boundary; D: Pathological immunohistochemical staining, Ki-67 index is about 70%; E-H: Pseudo color parameter map of ADC, D, D^* and f value; I-L: Histogram of ADC, D, D^* and f value in the tumor region of interest.

1.4　免疫组织化学染色结果判定

       Ki-67阳性染色定位于细胞核，呈棕黄色或黄褐色着色。目前Ki-67缺乏统一阳性界值，高表达的界值范围是3.5%～35%。参照2013年St．Gallen国际乳腺癌会议专家共识^[12]，本研究以20％作为临界值，<20％的肿瘤细胞核着色为Ki-67低表达，≥20％的肿瘤细胞核着色为高表达。

1.5　统计学分析

       采用SPSS 23.0软件对数据进行统计学分析。所有计量资料行正态分布检验(Shapiro-Wilk检验），符合正态分布的数据行独立样本t检验，非正态分布数据行Mann-Whitney U检验进行比较；采用Spearman秩相关分析评价IVIM各直方图定量参数与乳腺癌Ki-67增殖指数的相关性。所有统计结果以P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　患者特征和病理结果

       56例乳腺癌患者共57个病灶，1例为单乳两个病灶，左乳病灶27个，右乳病灶30个。病理类型以乳腺浸润性癌、非特殊类型（浸润性导管癌）为主(37个，65%)，浸润性导管癌合并导管内癌8个，导管内癌3个，浸润性小叶癌2个，混合型乳腺癌2个，浸润性小管癌合并导管内癌1个，小细胞神经内分泌癌1个，乳头及皮下组织Paget's病并表浅浸润性癌并导管内癌1个，乳腺筛状癌1个，导管内乳头状癌1个。免疫组织化学染色结果：Ki-67高表达40个病灶，低表达17个病灶（图1D)。

2.2　乳腺癌Ki-67增殖指数与IVIM定量参数直方图分析结果比较

       Ki-67高表达组ADC值（偏度和峰度）、D值（偏度和峰度）、D^*值（平均值、最大值、偏度和峰度）均高于Ki-67低表达组，而Ki-67高表达组D^*值的最小值低于Ki-67低表达组，差异均有统计学意义(P均<0.05)；f值的所有直方图参数差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

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表1  乳腺癌不同Ki-67增殖指数与IVIM直方图定量参数结果
Tab. 1  Results of different Ki-67 proliferation index and IVIM-DWI histogram quantitative parameters of breast cancer

2.3　IVIM定量参数直方图分析结果与乳腺癌Ki-67增殖指数的相关性

       ADC值（偏度和峰度）、D值（偏度和峰度）、D^*值（平均值、最大值、偏度和峰度）与Ki-67增殖指数均呈正相关(r=0.296~ 0.509，P均<0.05) ，D^*值（最小值）与Ki-67表达呈负相关(r=-0.262 ，P均<0.05)。见表2。

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表2  IVIM直方图定量参数与乳腺癌Ki-67增殖指数的相关性
Tab. 2  Correlation between quantitative parameters of IVIM-DWI histogram and proliferation index of breast cancer Ki-67

3　讨论

       Ki-67作为增殖细胞表达的核抗原，参与细胞有丝分裂，存在于除G0期外整个细胞周期，是G1、S、G2、M期的标记蛋白^[13]，可作为评估肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标之一。全肿瘤ROI直方图分析方法是一种数学方法，可通过定量指标无创地反映肿瘤ROI内所有体素的信号强度分布情况。与传统的单层面ROI勾画方法相比，其最大的优势在于测量结果不依赖于观察者，测量结果的一致性和可重复性好^[10]。本研究对整个肿瘤的ADC值、D值、D^*值及f值进行直方图分析，探讨各直方图量化参数与乳腺癌Ki-67增殖指数的相关性。

       研究结果表明，Ki-67高表达组ADC值和D值的偏度和峰度高于Ki-67低表达组，且均与Ki-67表达呈正相关(r=0.296~ 0.392，P均<0.05)。You等^[14]对145例HER-2阳性乳腺癌患者研究发现，ADC值的峰度与Ki-67表达呈正相关；刘鸿利等^[15]的研究结果也显示，Ki-67高表达组ADC值的偏度大于低表达组，差异有统计学意义(P=0.026)，以上结果与本研究结果相似。偏度和峰度均是描述直方图曲线分布的参数，是反映肿瘤异质性较好的指标^[9]。Ki-67高表达的肿瘤，细胞增殖旺盛，瘤内有丝分裂程度不一、合并囊变坏死等成分可能性大，瘤组织内结构复杂，异质性明显，因此瘤内各体素测量的参数值不均一程度较高，从而表现出较高的偏度和峰度。此外，You等^[14]和刘鸿利等^[15]的研究也显示ADC值的第10和第90百分位数、平均值、中位数、最大值在Ki-67高低表达组间差异具有统计学意义(P均<0.05)。Lee等^[16]也报道了ADC值和D值的第75和第90百分位数与Ki-67表达呈正相关(r=0.25~0.30，P<0.05)。文献指出，直方图ADC值或D值较低的百分位数（如10^th、25^th)可能会代表瘤体内细胞密度较高的区域^[9]；相比之下，较高的百分位数（如90^th、95^th)可能反映细胞密度较低的区域，水分子扩散受限程度较低，如坏死或囊性区域^[17]。然而，在本研究中，尚未发现上述指标在Ki-67高低表达组间的差异。分析原因可能与纳入乳腺癌组织学类型的异质性有关。You等^[14]和刘鸿利等^[15]的研究纳入的乳腺癌均是单一的病理类型，而本研究囊括的病理类型较混杂，不仅包含了乳腺癌常见的浸润性非特殊型癌，还纳入了小细胞神经内分泌癌、Paget's病等特殊类型癌；此外，ADC值的最小值和最大值处于直方图最边缘，较易受伪影、部分容积效应等的影响^[18]，以上因素均可能造成结果的差异性。

       有文献报道，Ki-67可诱导生成血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，促使肿瘤血管灌注增加^[19]。D^*值与毛细血管密度相关，f值在一定程度上与肿瘤血管生成速度有关^[20]，因此，D^*值和f值可以定量评估肿瘤血流灌注情况。You等^[14]报道，f值的第50和第95百分位数与Ki-67表达呈正相关。Lee等^[16]对72例浸润性导管癌的IVIM直方图定量参数指标和Ki-67的相关性研究发现，D^*值的第10百分位数在Ki-67高表达组小于低表达组，f值的偏度在Ki-67高表达组大于低表达组，差异有统计学意义(P=0.029、0.049)。本研究显示D^*值的平均值、最大值、峰度和偏度均与Ki-67表达呈正相关(r=0.310~0.509，P<0.05)，以D^*值的最大值相关性最强(r=0509，P<0.01)；而D^*值的最小值在Ki-67高表达组小于低表达组，与Ki-67表达呈弱负相关(r=-0.262，P<0.05)，与Lee等^[16]发现的Ki-67高表达组D^*值的第10百分位数较高这一结果一致。然而，本研究f值的所有直方图参数与Ki-67表达均未见明显相关性(P均>0.05)。分析原因可能与病例数量、病理类型的多样性、b值的设置、ROI勾画方法、Ki-67的阳性界值等因素有关，其中b值的设置可能是一个较重要的影响因素。IVIM模型中，灌注相关系数计算来自低b值，一般以200 s/mm²区分毛细血管微灌注和水分子的扩散效应，≤200 s/mm²时，DWI图像信号的衰减主要是微灌注引起，反之由水分子扩散受限引起^[6]。此外，Pang等^[21]研究发现，最高b值>750 s/mm²时，所得f值可能出现偏差。本研究中，≤200 s/mm²的b值有6个，>750 s/mm²的b值有4个，与You等^[14]和Lee等^[16]的设置不同，可能会造成结果出现偏差。另外，笔者考虑，Ki-67促肿瘤血管生成作用较弱、肿瘤细胞密度过高可能会压迫肿瘤血管致灌注减低，从而导致灌注相关参数不会明显增高。

       本研究存在一定局限性：(1)样本量相对较小，未来需要大样本多中心研究来证实IVIM的应用价值；(2)数据采集和分析缺乏标准化是IVIM应用受限的一个主要因素，不同研究采用的扫描方法、数据拟合方法、纳入的病例标准都可能影响结果；(3）本研究旨在分析乳腺癌整体病变的异质性，采用全肿瘤ROI勾画方法，不仅包含肿瘤实性区域的异质性，也包含肿瘤非实性区域的异质性（如囊变、坏死），因此本研究结果可能会和采用肿瘤局部ROI勾画方法的研究结果存在偏倚；(4）勾画肿瘤边界存在人工偏差，可能导致生成的直方图参数存在误差，自动分割算法的应用可能会避免该缺陷。

       综上所述，基于直方图分析方法的DWI单指数和IVIM双指数模型定量参数能够提供比均值更多的信息，对评估乳腺癌Ki-67增殖指数具有一定的价值。D^*值的最大值与乳腺癌Ki-67增殖指数的相关性较高，提示通过非侵入性的影像学检查方法预测乳腺癌Ki-67表达状态的潜在性，未来需要更大数量的样本研究来证实。