直肠癌的发生、发展与肠上皮细胞的凋亡、增殖速度密切相关，多种基因、信号蛋白P53等参与了这个过程^{[1, 2]}。直肠癌肿瘤新生血管的血管壁成熟性差、动静脉血管间相交通、基底膜完整且血管通透性高等特点，可造成直肠癌微循环不均衡现象的出现，而动态对比增强磁共振成像(dynamic contrast-enhanced MRI，DCE-MRI)评价直肠癌微循环的病理基础与此存在关联，间接反映组织生物学行为^{[3, 4]}。P53是一种极其重要的抑制肿瘤的基因，其主要有两种不同的亚型，即突变型和野生型，这种基因能够影响细胞增生的过程^[5]。研究表明，肿瘤生长中癌细胞大量增殖，导致高表达的P53蛋白和细胞周期蛋白结合之间的结合丧失，进而引起与直肠癌增殖、侵袭和转移过程有着密切的分子生物学联系^{[6, 7]}。目前P53与直肠癌组织的相关研究结果并不明确，还需要更多更大规模的前瞻性研究。本研究通过应用从DCE-MRI纹理分析方法得出的DCE-MRI纹理特征值与直肠癌中P53生物标志物的可能关联，在术前预测直肠癌P53的表达状态，从而为直肠癌的治疗以及术后评估等提供更多的参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       回顾性分析2015年9月至2020年3月于大连医科大学附属第一医院行盆腔DCE-MRI扫描的原发性直肠腺癌患者91例。其中，P53高表达组50例[男37例，女13例，年龄(66.32±8.98)岁]，低表达组41例[男30例，女11例，年龄(64.02±11.14)岁]。本研究经过大连医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准(批准文号：PJ-KS-KY-2019-49)，免除受试者知情同意。纳入标准：①经手术病理证实为直肠腺癌，并且同时做了免疫组化检测、有分子生物学标志物 P53的表达情况；②MR检查后一个月内进行手术治疗，术前未经任何免疫治疗及新辅助放化疗。排除标准：①MR检查前已经行抗癌治疗或手术治疗；②临床或病理资料不完整，包含腺鳞癌、鳞状细胞癌、印戒细胞癌等病理其他类型；③图像质量不佳或病灶显示不佳，不利于感兴趣区的勾画。

1.2 扫描方法及参数

       评估患者无MR检查禁忌及相关病史后，嘱咐患者于检查前3 d低脂、少渣饮食，检查前6 h禁食水，并告知患者及家属相关注意事项，取得其知情同意。选用3.0 T MR (Signa HDxt，GE MedicalSystems，USA)扫描仪，指导患者采取仰卧位，于检查前适量饮水，以保持膀胱达到一定程度的充盈。自两侧骶髂关节连线水平至耻骨联合下缘水平范围内，对患者行盆腔扫描，扫描序列为常规扩散加权成像(diffusion-weighted imaging，DWI)、T2WI、DCE-MRI。扫描参数(表1)，扫描启动时间是一期之后，灌注期相39，本研究选用的对比剂为GE药业生产的钆双胺注射液(Gd-DTPA-BMA，欧乃影)，经肘静脉注射，注射剂量0.1 mmol/kg，速率为2.5 mL/s，注射后用20 mL生理盐水冲管。

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表1  3.0 T MRI 扫描序列及参数
Tab. 1  3.0 T MRI scan sequence and parameters

1.3 图像分析与测量

       由GE Functool 4.6工作站导入DCE-MRI图像后，通过GenIQ软件进一步完成DCE-MRI的后处理，以DICOM格式导出K^trans、Kep、Ve图像，并导入ITK-SNAP 3.6软件(https：//www.softpedia.com/get/Science-CAD/itk-Snap.shtml)，由两名影像诊断医师(年资分别为8年和5年)勾画病灶，纹理分析过程中采用双盲法在每例患者的DCE-MRI后处理K^trans、Kep、Ve图像中选取包括病灶的最大层面及病灶最佳、最大层面及相邻上下两个层面增厚的肠壁的边缘，并将3个层面ROI融合成1个容积感兴趣区(volume of interest，VOI)，包含肿瘤坏死、出血及钙化区域，并尽量避开周围脂肪及内容物，分别测量并记录P53高低表达组基于K^trans、Kep、Ve后处理图像的纹理分析特征参数：包括最大强度值(max intensity)、中等强度(median intensity)、均值(mean value)、最小强度值(min intensity)、偏度(skewness)、峰度(kurtosis)、熵(entropy)、能量(energy)、群集显著性(cluster prominence)、集群阴影(cluster shade)、相关性(correlation)、惯性矩(inertia)，见图1。

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图1  患者男，71岁，P53高表达，病理结果显示：直肠中低分化管状腺癌，侵及肌层，见神经侵犯，无相关淋巴结转移情况出现。影像表现为：直肠左侧壁局部增厚，浆膜面稍毛糙。A为T2WI图像，病灶呈等信号； B为DWI图像，病灶呈明显高信号； C为DCE-MR原始图像，增强可见病灶明显强化； D为K^trans重建图：K^trans值=0.25/min； E为Ve重建图：Ve值=0.171； F为Kep重建图：Kep值=1.544/min。G～I分别为K^trans、Ve、Kep纹理分析ROI勾画图； J～L分别为K^trans、Ve、Kep纹理分析提取的特征直方图
  nerve invasion, and no related lymph node metastasis. The image showed that the left wall of the rectum was locally thickened, and the serosal surface was slightly rough. A is a T2WI image, the lesion is iso-signal; B is a DWI image, and the lesion is obviously high-intensity; C is the original DCE-MR image, and the visible lesion is obviously enhanced; D is the K^trans reconstruction image: K^trans value=0.25/min; E is Ve reconstruction map: Ve value=0.171; F is Kep reconstruction map: Kep value=1.544/min. G—I are the K^trans , Ve, Kep texture analysis ROI sketch map; J—L are the K^trans, Ve, Kep texture analysis extracted feature histogram.

1.4 P53免疫组化蛋白检测

       本研究中所有直肠癌患者的手术病理标本均由本院病理科医生统一检测完成。P53阳性表达定位于细胞核，于100倍光镜下任选5个视野进行观察，同时分别计数5个视野中100个细胞的阳性细胞数，阳性细胞数的判定标准如下：小于5%为(-)，5%～25%为(+)，26%～49%为(++)，50%～75%为(+++)，大于75%为(++++)，当P53的阳性细胞数小于50%时，属于低表达组，反之为高表达组^{[8, 9]}。

1.5 统计学分析

       运用SPSS 23.0统计学软件进行相关数据分析。采用组内相关系数(intraclass correlation coefficients，ICC)对两位观察者所测数据的一致性进行检测，当ICC值＞0.75，即一致性良好时，采用高年资医师测量数据进行后续比较。比较两位观察者所测数据的正态性，采用Shapiro-Wilk正态性检验。数据满足正态性时，采用独立样本t检验，统计描述为均值±标准差，统计量为t值；反之，采用Mann-Whitney U检验，统计描述为中位数(25%，75%)，统计量为Z值。应用ROC曲线分析DCE-MRI的有统计学差异的纹理特征参数的鉴别效能、敏感度、特异度及95%置信区间(confidence interval，CI)；应用二元Logistics回归分析联合DCE-MRI纹理特征参数进行效能分析，用Delong检验对各单一参数模型的AUC进行比较，对联合模型AUC与各单一参数模型的AUC进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料比较

       直肠癌患者P53低表达组和高表达组的临床一般资料及比较结果见表2。结果表明P53两组间高表达组发生浸润深度[36 (72.00%)]大于低表达组[21 (51.22%)] (P=0.025)。

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表2  P53低表达组和高表达组患者的一般临床资料
Tab. 2  General clinical data of patients in P53 low expression group and high expression group

2.2 两名观察者测量数据的一致性检验

       观察者一和观察者二所测量的DCE-MRI纹理参数最大强度值、中等强度、均值、最小强度值、偏度、峰度、熵、能量、群集显著性、集群阴影、相关性、惯性矩的ICC值分别为0.997、0.964、0.948、0.874、0.992、0.893、0.996、0.903、0.995、0.994、0.993、0.986，一致性良好，ICC值均＞0.75。

2.3 P53两组间的纹理参数测量结果

       P53高表达组纹理参数Cluster ProminenceKtrans(23.00±50.84)×10⁶、CorrelationKtrans (1.49±1.42)×10^-2、InertiaKep (13.52±22.31)×10⁴值均大于低表达组Cluster ProminenceKtrans (4.89±5.92)×10⁶、CorrelationKtrans (0.16±0.17)×10^-2、InertiaKep(50.52±61.27)×10³，差异有统计学意义(P＜0.05) (表3)。

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表3  P53低表达组和高表达组的纹理分析特征参数测量结果
Tab. 3  Texture analysis feature parameter measurement results of P53 low expression group and high expression group

2.4 P53高低表达组DCE-MRI纹理参数的效能分析

       P53分析K^trans、Ve、Kep 3个后处理图像的纹理分析，得到以下有统计学意义纹理参数AUC值分别为0.712 (Cluster ProminenceKtrans)、0.838 (CorrelationKtrans)、0.638 (InertiaKep)，其中单个参数诊断效能最高的是CorrelationKtrans，AUC为0.838。联合3个有统计学意义的参数Cluster ProminenceKtrans、CorrelationKtrans、InertiaKep得到联合诊断效能，AUC为0.914，敏感度为80%，特异度为95% (见表4、图2)。经Delong检验，P53两组间有组间差异纹理参数联合模型AUC大于单一Cluster ProminenceKtrans、CorrelationKtrans、InertiaKep参数模型，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表5。

       采用Logistic回归，将P53两组间差异有统计学意义的纹理参数依据加权系数进行联合，纹理参数联合回归模型：-2.703+7.648×ClusterProminenceKtrans+3.819×CorrelationKtrans+0.462×InertiaKep。

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图2  P53低表达组和高表达组DCE-MRI纹理参数及其联合分析的ROC曲线
Fig. 2  The ROC curve of DCE-MRI texture parameters and joint analysis of P53 low expression group and high expression group.

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表4  P53低表达组和高表达组的定量参数、纹理参数的效能分析
Tab. 4  Effectiveness analysis of quantitative parameters and texture parameters of P53 low expression group and high expression group

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表5  P53两组间联合参数和单一参数经Delong试验比较结果
Tab. 5  Delong test results of combined parameters and single parameters of P53 between the two groups

3 讨论

       直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，由于早期症状不够显著，因而不易诊断，发现时常有远处转移，失去最佳治疗时机。因此，术前早期、准确的诊断成为直肠癌精准诊治亟待解决的临床问题。近年来，人工智能影像检查分析手段备受关注，但目前尚无纹理分析用于直肠癌P53表达状态的研究。

       纹理分析通过图像像素的分布、像素之间的关系进行量化来反映直肠癌肿瘤的异质性，能够评价整个肿瘤的内部组织特点，包括坏死区、水肿区和肿瘤活性区等分布情况，从而反映出肿瘤的生物学特性及其发生发展变化^{[10, 11, 12, 13, 14]}。在恶性肿瘤患者中，有50%的患者存在P53抑癌基因突变的现象，P53的表达情况一定程度上引起组织生物学特性的变化，反映组织生物学行为，主要是肿瘤病理形态以及血流动力学方面的改变，间接指代影像成像所获得的反映肿瘤血管灌注渗透的参数，已经被广泛应用于与直肠恶性肿瘤相关的研究中^{[5, 6, 7]}。

       本研究中纹理特征Cluster Prominence在P53高表达组高于低表达组，Cluster Prominence作为衡量一种分布不对称型的表达形式，其大小与图像的对称性呈负相关，假如影像结果显示，Cluster Prominence存在低值，表明灰度级上图像值具有的峰值相对较小，同时在不同组织之间灰度也并不具有较大的差异。因此分析本研究结果，可能因为P53在肿瘤细胞中高表达，肿瘤细胞的增殖状态增强，肿瘤的新生血管丰富，肿瘤细胞增长活跃，灰度差异性大。Cluster Prominence同时应用于脑肿瘤研究中，研究表明纹理参数Cluster Prominence值可预测高危非典型脑肿瘤的复发，肿瘤复发时，Cluster Prominence值增加^{[15, 16, 17]}。

       本研究表明P53高表达组K^trans图像的Correlation值更高，Correlation用来测量相邻像素的灰度级的相似性和线性相关性，表示像素在整个图像上与其相邻像素的相关性。本研究结果表示P53高表达组病灶像素在整个K^trans图上与其相邻像素的相关性更高。有研究显示在基于3.0 T DCE-MRI的K^trans图像的纹理分析预测局部进展期直肠癌患者术前新辅助化疗病理反应的研究结果表明，病理上完全反应组的Mean Intensity、Entropy和Correlation值减低，并且认为Correlation是鉴别进展期直肠癌患者是否获得病理完全缓解的最有价值参数^{[18, 19]}。

       而纹理特征参数Inertia是度量矩阵值的分布情况，反映图像的清晰度和纹理的沟纹深浅。本研究表明P53高表达组Kep图像Inertia值比低表达组高，表示P53高表达Kep图像更清晰、纹理的沟纹更深，信号强度变化更高。分析原因是肿瘤微环境的不同，导致了发生P53高表达组的肿瘤组织异质性较高，表现为肿瘤新生血管的密度较大、细胞密度较为致密、排列顺序较为混杂、血管基膜的完整性不佳等，而应考虑为一种恶性程度较高的表现。有研究表明ADC图的纹理特征Inertia是直肠癌治疗反应的预后因素^{[20, 21]}。

       本研究的主要不足有以下两点：一是使用的样本量相对较小，选择的研究方式为回顾性研究，因此最终获得的研究成果可能存在一定的偏差，今后研究中应增大样本量，保证研究的科学性、可靠性，同时开展前瞻性研究，结果更有说服力；二是结合肿瘤的相邻两层面以及最大层面情况可以看出，通过人工的方式对ROI进行勾画，可能存在主观性判断的问题，难免丢失部分病灶信息，没有对病灶进行全面的评估。

       目前尚无学者应用DCE-MRI纹理分析方法在直肠癌中预测P53表达状态的研究，本结果显示，当仅考虑直肠癌组织的DCE-MRI某个纹理参数，多数情况下其评估价值有限，有统计学差异的纹理特征参数AUC值分别为0.712、0.838、0.638。本研究将P53高低表达组有统计学差异的纹理特征值进行联合分析，其诊断效能提高到0.914，此时判断P53表达的特异度高达95%，因此DCE-MR后处理图像纹理特征的联合分析对预测直肠癌P53表达状态的价值更高。