0 前言

       磁共振报告基因成像是应用磁共振检测（直接或间接）整合到感兴趣组织细胞内目的基因所表达的目的蛋白的过程，应用目的启动子启动易被检测的蛋白基因或与外源性底物反应后易被检测的蛋白基因表达，例如荧光蛋白基因或萤光素酶基因等。传统的报告基因蛋白检测方法包括体外组织免疫组化及活体光学检测等^{[1, 2]}，但是体外检测法不能进行纵向示踪而活体光学检测对深部组织检测受限。另外报告基因能够持续表达，避免了常规的探针法如氧化铁或超顺磁氧化铁离子信号强度随着细胞的增殖而降低及当细胞死亡后金属微粒会被巨噬细胞摄取造成假阳性等缺点。综上所述，磁共振报告基因成像不仅具备磁共振成像的高分辨率、无辐射等优点，还可以实现活体内纵向分子水平示踪且假阳性率低。据此，磁共振报告基因成像作为分子影像的重要分支，必将在活体疾病早期诊断、肿瘤基因分析及肿瘤治疗等领域发挥越来越重要的作用。

       磁共振报告基因高分辨率成像对活体深部组织的纵向示踪具有绝对优势，所以近来磁共振报告基因成像在基础生物医学中备受青睐。现已有较多研究^{[3, 4, 5, 6, 7, 8]}表明磁共振报告基因成像可应用在细胞示踪、心血管成像、组织微环境监测以及肿瘤治疗等多个领域。常用的磁共振报告基因包括基因酶如酪氨酸酶和b-乳糖酶、细胞膜表面多肽如泛素化跨膜受体、内源性报告基因如铁蛋白相关报告基因和化学交换饱和转移（chemical exchange saturation transfer, CEST）报告基因及赖氨酸富集蛋白（lysine rich protein, RLP）等。其中大部分报告基因通过内源性过表达目的蛋白并在离金属离子参与下改变邻近氢质子弛豫时间形成磁共振对比图像；而少部分报告基因依赖于体内目的质子的多少形成图像的对比。由此可见不同报告基因之间成像原理存在差异。根据成像原理不同，报告基因的应用领域也不尽相同且各具优缺点。而合理选择报告基因是保证分子成像效率及安全性的前提，所以在应用磁共振报告基因前熟知不同报告基因的成像原理及应用领域是有必要的。本文将根据成像是否有金属离子参与将磁共振报告基因分为金属依赖型和非金属依赖型两类，并从研究前沿及未来发展等维度对磁共振报告基因进行综述。

1 金属依赖型报告基因成像

       金属依赖型报告基因通过内源性过表达某种蛋白后直接或间接结合或分离金属离子从而加速邻近氢质子横向或纵向弛豫形成磁共振T1或T2对比图像，这一类报告基因主要包括铁蛋白相关报告基因、络氨酸酶、β－半乳糖苷酶报告基因等。

1.1 铁蛋白相关报告基因

       铁蛋白是人体常见的蛋白，主要分布在人体的肝脏、脾脏以及脑组织中，由重链及轻链两种亚单位组成^[9]。细胞内聚集的铁颗粒加速氢质子的自旋-自旋弛豫缩短T2弛豫时间导致T2信号减弱形成对比图像且T2信号与局部铁浓度呈负相关^{[10, 11]}。

       铁蛋白作为磁共振报告基因已经用于干细胞示踪检测移植后细胞存活、增殖、迁移的研究中，将过表达铁蛋白重链蛋白（ferritin heavy chain, FTH）的人间充质干细胞移植到小鼠体内并检测到明显的T2低信号表明铁蛋白可作为磁共振报告基因评估移植细胞的存活及增殖情况^{[12, 13]}。FTH作为磁共振报告基因，用于监测细胞的分化较监测细胞存活、增殖和迁移更加困难，有研究表明移植到心肌梗死区域的干细胞不仅通过旁分泌作用分泌生长因子修复受损心肌，还可以分化为心肌细胞和血管内皮细胞，但仅有少量干细胞发生分化^[14]。所以要求报告基因必须能够产生足够的对比度才能检测到细胞在低密度情况下的低水平分化。在COHEN等^[15]的研究中将FTH作为磁共振报告基因示踪血管内皮细胞的分化并监测胚胎小鼠血管的生长，结果表明可在低密度情况下检测到铁蛋白聚铁导致的对比信号。此外，铁蛋白相关报告基因磁共振成像还被应用于肿瘤诊断及靶向治疗、基因治疗效果评估和神经活动可视化等研究中^[16]，LIU等^[17]还将其应用于干细胞外泌体示踪的研究中。WU等^[18]将ferritin-mKate2融合蛋白作为报告基因转入神经元，发现当神经元活动时诱发电弧启动子启动ferritin-mKate2表达并形成T2加权低信号，实现神经元活动的监测。

       常见的铁蛋白报告基因以FTH为主，因其具有聚铁以及将Fe²⁺氧化成更稳定的无毒的Fe³⁺的作用。同时也有研究将FTH和FTL（铁蛋白轻链）两种亚基结合增加铁蛋白聚铁能力，形成更加明显的磁共振对比信号。

1.2 β-半乳糖苷酶

       β-半乳糖苷酶是由LacZ基因编码的能催化β-半乳糖苷衍生物生成普鲁士蓝样物质的位于质膜上的一种酶^[19]。β-半乳糖苷酶常与探针（如钆、锰等）联合应用显像，钆、锰是常用的T1阳性对比剂，因其不成对的电子对加速邻近氢质子的自旋-晶格弛豫使T1弛豫时间减短，在T1加权图像上形成相对高信号^[20]。

       EgadMe（Gd³⁺螯合物）是最常见的β-半乳糖苷酶探针，能与β-半乳糖苷酶反应释放Gd³⁺减短T1弛豫时间形成T1加权高信号，但在与β-半乳糖苷酶反应前Gd³⁺无法与水接触不影响T1信号。但EgadMe在体内通过肾脏快速排泄，成像的有效时间较短，所以捕捉信号难度较大。ARENA等^[21]设计出另一种β-半乳糖苷酶磁共振成像探针Gd-DOTAtyr-gal用于示踪表达β-半乳糖苷酶的黑色素瘤，克服了EgadMe在体内快速代谢与细胞增殖使探针浓度降低的缺点，实现了体内长时间且稳定的示踪。

1.3 络氨酸酶

       络氨酸酶是一种广泛存在于细胞内的儿茶酚胺酶，它能通过自身环化、氧化还原以及羟基化生成黑色素。黑色素具有很强的铁螯合能力，能与Fe3+、Mg2+、Ca2+等形成螯合物对T1弛豫时间产生影响，这使络氨酸酶变成磁共振报告基因变成可能。

       研究发现在络氨酸酶基因前加上四环素开关元件控制其表达，并在四环素的控制下过表达且与铁结合产生T1高信号，实现报告基因表达的开关功能，只需要在成像时表达报告基因，降低报告基因持续表达对细胞造成的副作用^[22]。

1.4 其他金属依赖型报告基因

       在早期的研究中金属依赖型报告基因还包括转铁蛋白受体（tfr）及趋磁细菌基因（magA）等。tfr是位于细胞表面能与转铁蛋白特异性结合并将铁离子转移到细胞内的蛋白。早期研究结果显示tfr通过增加铁离子在胞内聚集而改变信号^[23]，但是最近研究表明单独过表达tfr不能产生明显的信号对比^{[24, 25]}。magA是一种在趋磁细菌内形成磁小体的基因，磁小体能产生较强的T2及T2^*对比，magA是趋磁菌中形成磁小体的主要功能基因，因此被作为磁共振报告基因进行研究。但另有研究表明magA不能作为磁共振报告基因，因为magA来源于细菌，缺乏哺乳动物同源性导致表达magA的细胞受到机体免疫排斥反应而死亡^{[26, 27]}。目前对于二者是否能够成为磁共振报告基因仍存在争议，研究也较少。

       金属依赖型报告基因成像实现了体内细胞纵向示踪且信号强度相对稳定，克服了因细胞裂解出现的信号衰减问题。但其成像需要额外补充金属离子或金属探针，铁蛋白相关报告基因需要额外补充铁离子才能实现成像，这可能导致人体铁过载，而人体在铁过载状态下可导致铁中毒，出现器官功能障碍和损伤，且研究表明铁过载与多种疾病有关^{[28, 29, 30]}。所以即使铁蛋白相关报告基因在实验室研究已经相对成熟，但铁过载毒性很大程度限制了其临床应用。虽然目前没有研究表明其他含有金属离子的探针有细胞毒性，但过表达β-半乳糖苷酶及络氨酸报告基因是否导致人体功能紊乱没有相关研究证实，所以仍需要进一步研究确保其应用于人体的安全性。

2 非金属依赖型报告基因成像

       非金属依赖型报告基因与金属依赖型报告基因最大的区别在于其图像对比不依赖于金属探针或是金属离子的摄入和代谢，而是依赖于体内局部目的质子的多少形成图像的对比。其优点在于不需要外源性对比剂而是应用内源性对比剂。

2.1 CEST成像报告基因

       CEST成像技术通过饱和快速交换质子对的原理与周围形成对比，具有非侵入性、可选择性打开、不改变解剖结构等优点^{[31, 32]}。CEST成像最大的特点在于可以用不同频率使水质子与不同目的显像剂中的质子产生化学位移形成图像，但目前的研究中一个序列只能使一种物质显像^{[33, 34, 35]}。此外，CEST成像还具有高场优势，在高磁场下CEST成像可替代T1对比剂提高信噪比，而且CEST成像在高磁场能检测到低浓度显像剂信号^[36]。

       目前较常用的报告基因有RLP或人鱼精蛋白１^[37]。RLP含有200个赖氨酸分子，使用特定发射频率激励RLP的质子，被激励的RLP质子在3.76 ppm与水质子发生化学位移，对发生化学位移后的水质子成像得到与背景水不同的信号，这使得RLP作为磁共振报告基因成为可能^{[38, 39]}。BAR-SHIR等^[40]通过过表达内源性RLP报告基因作为CEST显像剂对移植到大鼠脑内的脑胶质瘤细胞（9L）进行示踪，结果检测到肿瘤呈现出与对照组对比明显的CEST信号。应用肿瘤特异性PEG-3启动子在9L细胞表达RLP能检测到明显的CEST对比信号^[36,41]。这都表明RLP可以作为磁共振报告基因用于CEST显像。但是高敏感度及磁场的不均匀性带来假阳性及图像信噪比低等原因阻碍了CEST报告基因的发展。目前在临床上正在通过稳定探头、硬件和成像方案（例如新序列的开发）等渠道来优化CEST成像^{[34, 42]}。

2.2 水通道蛋白成像

       水通道蛋白（Aquaporin1³⁺ AQP1）表达在所有细胞膜的脂质双分子层，选择性地输送细胞膜两边的水。AQP1被认为在脑脊液的产生^[43]和体内平衡及肿瘤的预后转归^[44]中起到重要作用。在MUKHERJEE等^[45]的研究中发现AQP1在几种哺乳动物细胞系中过表达，AQP1促进水进出细胞，从而增加有效扩散率，当表达量增加到200%时表观弥散系数显像呈颗粒状。目前还没有发现过表达AQP1对细胞活力和形态学有影响，但其成像依赖于组织内水质子的数量，对水含量较少的组织成像不敏感。

2.3 气体填充蛋白纳米结构

       气体填充蛋白纳米结构简称为气囊（gas vesicles, GVs），是某些浮游微生物为了在水中实现浮力表达的气体结合蛋白纳米结构，GVs内的空气可以产生邻近区域微磁场梯度^{[46, 47]}，高效相移氢质子形成T2加权易感图像，且成像结束后还能用达到一定阈值的超声破裂GVs使这种对比消失。低敏感度一直是磁共振成像的弱点，SHAPIRO等^[48]发现可用磁共振成像在皮摩尔水平检测到GVs的影像，这是目前运用磁共振成像检测到的前所未有的低浓度对比剂，很大程度上提高了磁共振成像的敏感度。目前对于GVs的研究还需进一步深入，如其生物结构组装过程以及其在异源细胞中的表达是否对细胞带来影响等都未得到确切的结论。

3 展望

       报告基因作为重要的磁共振成像工具，在实现活体纵向检测体内分子信息的同时还可以提高磁共振成像图像质量，具有不可替代的优势，将是磁共振成像未来发展的重要方向之一。

       在已知磁共振报告基因中，大部分都需要与外源性金属离子直接或间接反应后才能达到被检测的目的，但是外源金属离子摄入的安全性有待进一步验证；而不需要外来金属离子参与的报告基因，则主要以内源质子为成像基础，这就需要高敏感度探测器才能检测到差异成像。低敏感度一直是磁共振报告基因应用和发展的重大阻力，结合核素显像或光学显像的高敏感度和磁共振成像的高空间分辨率优势可得到更高信号强度且分辨率高的图像，光学成像和放射性核素成像的应用可以显著提高诊断效率并加快新疗法的发展，更有学者将两种或更多不同成像技术报告基因整合成一个融合报告基因来提高诊断效能^{[49, 50]}，所以融合基因多模态成像策略是未来报告基因成像的发展趋势。

       非金属依赖型报告基因成像应用内源性对比剂不需要额外的金属离子或探针，提高了其应用于人体的安全性，其信号强度依赖于内源性对比剂的浓度，例如CEST对于目标内源性对比剂浓度较低的组织成像困难，但是CEST目标对比剂不是唯一的，或可根据组织特点设计专用序列来提高图像质量，这将是其未来发展的重要方向。在应用于临床之前，尚需对其基因稳定表达及安全性进行深入证实，如报告基因成像需要依赖于报告基因表达的稳定性与背景组织对比度，基因沉默或是背景组织信号与报告基因信号无差异等都能导致无法应用报告基因成像；另外，外来基因过表达是否影响细胞在体内的活性及分化能力，是否导致宿主自身基因突变以及致瘤性等问题都有待进一步探索。