0 前言

       弥漫性脑胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，具有高发病率和死亡率的特点^[1]。随着基因组学研究的深入，发现胶质瘤内部存在许多与肿瘤异质性、临床生物学行为和预后密切相关的分子分型^[2]。2016年世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类（the WHO Classification of Tumors of the Central Nervous System, WHO CNS）首次将分子分型纳入到胶质瘤的分类和分型指南，随着2021年 WHO CNS的更新，分子分型为胶质瘤精准诊断提供了更多有价值的线索，强调了结合分子分型与组织学分级的综合诊断和分层报告的重要性，对指导胶质瘤的治疗及评估预后具有重要意义^{[3, 4]}。其中O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（O⁶-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT）是编码修复DNA的蛋白质的关键分子分型^[5]。文献报道，MGMT启动子甲基化状态与胶质瘤患者的生存期以及标准化疗药物替莫唑胺（temozolomide, TMZ）反应密切相关，MGMT启动子甲基化的患者更能从TMZ的治疗中获益^{[6, 7]}。目前，获得胶质瘤分子分型主要采用侵入性、有创的手术或病理活检的方法，获取有效的组织标本进行相关基因检测，费用昂贵、周期长且技术门槛高^[8]。随着医学图像处理方法和人工智能的研究与进步，深度学习方法在疾病的检测、鉴别等方面的研究也在不断深入，广泛应用于肿瘤的诊断与预后评估中^{[9, 10, 11, 12]}。同时也为术前预测胶质瘤的分级和分子分型提供新思路^[13]。其中卷积神经网络是典型的深度学习人工神经网络，可以直接从MRI图像中捕获和挖掘人眼观察不到的特征，自动筛选出反映肿瘤异质性的特征，完成对图像的分类及预测任务^{[14, 15]}。基于常规MRI的深度学习方法可以无创、及时并有效地预测MGMT启动子甲基化状态^[16]。本研究探讨基于多序列MRI的卷积神经网络在预测胶质瘤MGMT甲基化状态方面的价值，旨在为胶质瘤的精准诊断和化疗决策提供重要的辅助价值，帮助实现胶质瘤的个体化精准治疗。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       回顾性分析研究宁夏医科大学总医院自2015年11月至2022年6月经病理证实的胶质瘤患者的临床及MRI影像资料。纳入标准：（1）符合2021新版WHO中枢神经系统肿瘤分级为2～4级的胶质瘤患者；（2）完整的MGMT分子信息及临床信息；（3）年龄≥18岁；（4）术前均行头颅MRI平扫及增强检查，图像序列完整。排除标准：（1）MRI图像质量不佳；（2）MRI检查前行其他治疗干预（放疗、化疗等）；（3）脑外伤史。本研究遵守《赫尔辛基宣言》，经宁夏医科大学总医院伦理委员会批准，免除受试者知情同意，批准文号：KYLL-2022-0591。

1.2 仪器与方法

       头颅MRI平扫及增强扫描均采用美国GE公司Signa Excite 3.0 T MRI扫描仪，患者仰卧位，使用头部8通道相控阵列线圈，纳入序列均为轴位序列。T2WI序列扫描参数：TR 4600 ms，TE 106 ms，矩阵352×352；T2液体衰减反转恢复（T2 fluid attenuated inversion recovery, T2-FLAIR）扫描参数：TR 8500 ms，TE 92.4 ms，矩阵260×260；对比增强T1WI（contrast enhanced T1WI, CE-T1WI）序列扫描参数：TR 2250 ms，TE 106 ms，矩阵352×352；所有序列层厚6.0 mm，层间距1.0 mm，FOV 240 mm×240 mm。增强检查使用Gd-DTPA（Bayer Schering Pharma AG，Germany），经肘静脉团注（0.1 mmol/kg），流速为3.0 mL/s。

1.3 图像预处理和感兴趣区勾画

       纳入病例MRI图像以DICOM格式从PACS系统导出，使用3D-Slicer（https://www.slicer.org,version 5.0.3）对T2WI、T2-FLAIR及CE-T1WI进行图像配准，N4用于偏置场校正来消除由于磁场不均匀引起的低频信号^[17]。使用Python软件（https://www.python.org，version 3.6.8）的“pydicom”工具包，将图像从DICOM格式转换为jpg格式。由一名具有5年以上工作经验的神经系统MRI诊断医师，采用Labelme 4.5.6软件在T2-FLAIR图像上逐层勾画感兴趣区（region of interest, ROI）（包含肿瘤实质及周围水肿区），同时对图像根据甲基化状态进行标注，甲基化状态标签设为1，未甲基化状态标签设为0，ROI及标签以“json”格式保存，由另外一名10年以上工作经验的神经影像诊断医师对ROI进行校验审核。再使用“opencv”将T2-FLAIR的ROI轮廓复制到T2WI和CE-T1WI图像产生CE-T1WI和T2WI图像的ROI，并由以上两名医师对这两个序列ROI进行核对校验，对有异议的ROI重新分割及标注最后达成一致。采用“opencv”的“resize”函数将图像调整为以ROI为中心的224×224矩形矩阵。

1.4 模型的介绍和训练

       本研究选用广泛应用于医学图像分类的34层残差网络（34-layer-residual convolutional neural network, ResNet34）作为特征提取和分类的网络^[18]。本研究首先通过ImageNet公开数据集对ResNet34卷积神经网络进行预训练，将训练好的权重参数重新加载，迁移学习至本研究的卷积神经网络。

1.5 模型的训练和验证

       将原始数据集按照7∶3完全随机分为训练集和验证集，分别建立基于T2WI、T2-FLAIR、CE-T1WI单一序列模型以及三个序列融合的模型（T2-net、T2f-net、TC-net、TS-net）预测胶质瘤MGMT启动子甲基化状态。试验设计流程见图1。模型训练过程中，动态执行包括图像旋转±10°，亮度±25%和上下、左右翻转的数据增强方法，减弱因为数据集相对较小而引起的模型过拟合的影响。

       使用Python软件在Ubuntu 20.04.5 LTS进行卷积神经网络的训练和验证，使用GPU 3090加速器，优化器选择SGD。每次卷积之后和激活前使用批量归一化（Batch Normalization, BN）来加快运行速度，并在完全连接层添加了10%的丢失（dropout），以减少过度拟合^[19]。对网络进行了100个周围的训练，初始动量0.937并自适应调整，小批量为32，学习率初始值为0.01，当学习速率稳定超过10个周期时，学习速率下降10倍，随着训练周期的增加减小到0.001，当准确度稳定10个周期，停止训练。训练及验证步骤如下：（1）输入图像大小为224×224；（2）T2-net、T2f-net、TC-net先通过7×7的卷积层后经过四个不同大小的构建层进行特征的学习和筛选，最后将输出特征向量到全连接层，经过softmax函数获得最后分类预测概率；（3）TS-net使用ResNet34并行三路网络，将三个序列的图像数据分别输入ResNet34，经过预处理层后的三个构建层后对输出的特征进行拼接融合后输入到网络的第四层，并将第四层的堆叠块数量调整为7，最后经过全连接层和Softmax分类（图1）。

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图1  胶质瘤O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶启动子甲基化状态预测模型的流程图。ROI：感兴趣区；T2-FLAIR：T2液体衰减反转恢复；CE-T1WI：对比增强T1WI；MP layer：多层感知器；ResNet34: 34层残差神经网络；Layer：构建层；X：数据输入；relu：激活函数。
Fig. 1  The flow chart of models for predicting the promoter methylation status of O⁶-methylguanine-DNA methyltransferase in glioma. ROI: region of interest; T2-FLAIR: T2 fluid attenuated inversion recovery; CE-T1WI: contrast enhanced T1WI; MP layer: multilayer perceptron; ResNet34: 34-layer-residual convolutional neural network; Layer: building layer; X: data input; relu: activation functions.

1.6 统计学分析

       使用SPSS 26.0对纳入病例的临床资料进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料用比例和百分比表示，组间比较采用χ²检验。

       深度学习模型的统计学分析在Python 3.7.7平台使用“Scikit-learn”软件包绘制采用受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线和精确度-召回率曲线（precision-recall curve, PRC），以ROC曲线下面积（area under the receiver operating characteristic, AUROC）、PRC曲线下面积（area under the precision-recall curve, AUPRC）、准确度、特异度和敏感度评估模型效能。AUROC和AUPRC的95%置信区间根据模型2000次自举迭代和模型的预测概率计算。在R 4.0.3上使用DeLong检验评价不同模型AUROC的差异。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

       最终收集161例符合纳入和排除标准的胶质瘤患者病例（表1），其中MGMT启动子甲基化80例，年龄（49.430±13.627）岁，未甲基化81例，年龄（48.720±1.578）岁。两组患者年龄、肿瘤方位、肿瘤的发病部位以及病理分级差异均无统计学意义。

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表1  161例胶质瘤患者临床资料比较
Tab. 1  Comparison of clinical data of 161 gliomas patients

2.2 卷积神经网络模型

       161例胶质瘤患者，四个模型（T2-net、T2f-net、TC-net、TS-net）训练集图像共1050幅，其中验证集450幅。图2显示了T2-net、T2f-net和TC-net的梯度加权类激活映射图（gradient-weighted class activation mapping, Grad-CAM）示例。这些热力图说明网络学习最关注和集中在肿瘤和肿瘤周围的区域，忽略ROI以外的区域。图3为T2-net、T2f-net、TC-net和TS-net的特征图可视化的示例图，说明与融合后的特征图相比较单序列包含更丰富的语义信息。

       训练集T2-net、T2f-net、TC-net、TS-net的AUROC分别为0.859、0.877、0.920、0.930，AUPRC分别为0.860、0.864、0.908、0.912，验证集T2-net、T2f-net、TC-net、TS-net的AUROC分别为0.812、0.840、0.854、0.910，AUPRC分别为0.796、0.826、0.839、0.896（图4，表2）。DeLong检验显示，在训练集中TS-net的AUROC高于T2-net、T2f-net、TC-net，其中与T2-net和T2f-net相比差异有统计学意义（P＜0.05），与TC-net相比差异无统计学意义（P＞0.05）。验证集中TS-net的AUROC值均高于T2-net、T2f-net、TC-net，差异均有统计学意义（P＜0.05）。TC-net的AUROC值在训练集和验证集中均高于T2-net、T2f-net，在训练集中差异有统计学意义（P＜0.05），在验证集中差异无统计学意义（表3）。

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图2  T2-net、T2f-net 和TC-net 的梯度加权类激活映射图（Grad-CAM）示例图。2A、2B、2C 分别为T2WI、T2 液体衰减反转恢复、对比增强T1WI 序列的感兴趣区，2D、2E、2F 分别为对应的Grad-CAM。
Fig. 2  The example of gradient-weighted class activation mapping (Grad-CAM) of T2-net、T2f-net and TC-net. 2A, 2B, 2C: ROI segmented from T2WI, T2 fluid attenuated inversion recovery (T2-FLAIR), contrast enhanced T1WI (CE-T1WI), 2D, 2E, 2F: Grad-CAM based on T2WI, T2-FLAIR, CE-T 1WI, respectively.

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图3  四个模型的特征图示例图。3A、3B、3C、3D分别为T2-net、T2f-net、TC-net和TS-net中15个通道的特征图。
Fig. 3  Feature maps of these four models. 3A, 3B, 3C, 3D: the feature maps of T2-net, T2f-net, TC-net and TS-net from 15 channels.

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图4  训练集和验证集的受试者工作特征（ROC）曲线和精确度-召回率（PRC）曲线。4A、4B：训练集和验证集ROC曲线；4C、4D：训练集和验证集PRC曲线。TPR：真阳性率；FPR：假阳性率；Recall：召回率；Precision：精确度。
Fig. 4  The receiver operating characteristic (ROC) and precision-recall (PRC) curve of the training set and the validation set. 4A, 4B: The ROC of training set and validation set; 4C, 4D: The PRC of training set and validation set. TPR: true positive rate; FPR: false positive rate.

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表2  4个模型的预测效能比较
Tab. 2  Comparison of the prediction of four models

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表3  TS-net与其他3种模型的AUROC值比较
Tab. 3  Comparison of AUROC values between the TS-net and other three models

3 讨论

       本研究初步探讨了基于常规多序列MRI的ResNet34预测胶质瘤MGMT启动子甲基化状态的价值，结果显示基于单一序列的模型（T2-net、T2f-net、TC-net）和多序列融合模型（TS-net）均具有很好的预测效能，并且多序列融合模型（TS-net）的效能优于单序列模型。基于常规序列的卷积神经网络模型能够准确、无创地预测胶质瘤MGMT启动子甲基化状态。

3.1 术前预测胶质瘤MGMT启动子甲基化状态的重要性

       手术安全切除辅助以同步放化疗为胶质瘤标准治疗方案，可延长患者的总生存期和无进展生存期。MGMT是一种特殊的不可逆的DNA修复酶，可逆转并修复由化疗药物TMZ引起的DNA鸟嘌呤O⁶烷基化损伤，使胶质瘤对TMZ产生耐药性。而MGMT启动子甲基化会引起MGMT的转录沉默，限制MGMT的表达，来提高对化疗药物的敏感性^[20]。而且MGMT表达与脑室旁胶质瘤的复发、高级别胶质瘤的生长速率密切相关^{[21, 22]}。手术活检及病理是确定胶质瘤分子分型的“金标准”，但是手术活检操作有创，而且重复性差，技术门槛高，同时由于胶质瘤的高度异质性和操作者的主观差异，使得获得样本可能无法反映肿瘤整体情况^[23]。所以研究无创术前预测MGMT启动子状态的方法具有重要意义。袁鹏翾等^[24]通过动态对比增强MRI（dynamic contrast enhanced MRI, DCE-MRI）预测高级别胶质瘤MGMT启动子甲基化状态，表明容积转运常数与胶质瘤MGMT启动子甲基化状态具有相关性（AUC为0.75），与AHN等^[25]的研究结论一致，同时AHN等研究发现基于表观扩散系数和各向异性分数与MGMT启动子甲基化状态没有相关性，与MOON等^[26]研究的结果不一致，这可能与样本量不足以及勾画ROI的主观差异有关。由于胶质瘤高度的异质性、观察者的主观差异以及MR功能成像的时间和难度，使得MRI定量和定性特征预测胶质瘤分子分型成为一项具有挑战性的任务。本研究是基于常规序列的研究，图像更易获得，扫描时间短，图像质量佳，构建的深度学习模型不仅具有良好的预测能力，同时也增加了向临床实际应用转化的潜力。

3.2 ResNet预测模型在胶质瘤MRI中的应用价值研究

       卷积神经网络通过输入和输出层之间的多个神经层提取影像图像中的特征，并自动对特征进行筛选和降维，完成分类和预测任务，模型的结果更稳定、准确，具有可复现性^[27]。目前，卷积神经网络已广泛应用于胶质瘤的诊断和预后评估^[28]。ResNet因为其特别的残差结构，使网络对于消失梯度问题具有鲁棒性，并且网络收敛更快。快捷连接可以使低层和高层特征进行充分融合，确保每个后续层能够学习到所需要的特征信息^[18]。本研究综合考虑到算法的复杂程度、运算成本和分类的准确度，选用ResNet34作为研究网络，在四个预测模型中AUROC均在0.850以上，取得了良好的预测效能。LI等^[29]使用ResNet18对胶质瘤进行术前分级和预测胶质瘤的分子分型，其中区分高、低级别胶质瘤的模型在验证集的AUC为0.89，准确度为83%，预测低级别胶质瘤分子分型的两个深度学习模型的验证集AUC均在0.85以上。有研究是基于T2WI的3D-ResNet101来预测胶质瘤的术前分级的多中心研究，独立测试集的AUC为0.89^[30]。充分表明ResNet在胶质瘤MRI中的广泛应用和良好的效能。多项研究构建基于ResNet34的模型预测胶质瘤异柠檬酸脱氢酶突变状态，取得了良好的预测效能^{[31, 32]}，但是并没有对MRI各序列的图像的预测能力进行对比和融合，本研究在对常规序列建立模型的同时对多序列进行融合建立模型。从模型的特征图可以看出融合后的模型的特征图包含更多、更丰富的语义特征，更直观地反映肿瘤的异质性信息，从而提高模型的准确率和预测能力。为了更直观地进行CNNs的视觉解释，本研究执行了Grad-CAM，反映网络将注意力主要集中在肿瘤及肿瘤周围的水肿区域，这也与之前研究的可视化结果的解释一致^[29]。

3.3 卷积神经网络预测胶质瘤MGMT启动子甲基化状态

       KORFIATIS等^[33]分别建立ResNet18、ResNet34和ResNet50模型预测胶质瘤MGMT启动子甲基化状态，三个架构的残差网络均有良好的预测效能，精确度均在80.0%以上，说明ResNet可以提供较高的分类置信度。但是该研究在图像输入预测模型前没有对肿瘤进行勾画或者分割，使得部分肿瘤边缘没有足够的信号强度，未能得到准确的分类预测，从而影响模型的预测准确度。本研究对肿瘤区域进行了有效的分割，有助于特征的提取，提高了模型的准确性。有研究应用EfficientNet-B3卷积神经网络构建模型预测WHO 2、3级胶质瘤MGMT启动子甲基化状态（T2WI联合T1WI增强的预测模型AUC为0.78）^[34]。本研究与上述研究相比，包含了WHO 2～4三个级别的胶质瘤，适用范围更广。YOGANANDA等^[35]建立了基于T2WI的卷积神经网络模型预测MGMT状态，开发了从分割到预测的自动模型，但是仅依据T2WI不能全面地反映肿瘤的异质性。本研究建立了基于T2WI、T2-FLAIR、CE-T1WI三个单序列和三个序列融合的ResNet34模型，选择T2WI和T2-FLAIR图像在于临床更易收集，并且出现伪影概率更低^[34]。CE-T1WI图像通过注入对比剂可以更好地反映肿瘤的异质性^[36]。

3.4 本研究的局限性

       本研究存在一定的局限性：（1）本研究为回顾性的单中心研究，难免会有选择偏倚；（2）深度学习的研究需要较多数据才能获得良好稳定的性能，本模型虽然取得了良好的性能，但是数据量相对较少；（3）本研究未纳入患者的年龄性别、肿瘤发生部位等临床因素。下一步需要与其他研究中心合作，在多中心和前瞻性环境中对模型进行验证，增加病例数及纳入病例的临床因素，进一步增加模型的可靠性。

4 结论

       综上所述，本研究建立了基于多序列MRI的ResNet模型，预测胶质瘤MGMT启动子甲基化状态。结果表明模型具有良好预测性能，并减少了人工干预步骤，从而为胶质瘤患者的分子分型的术前精准诊断、化疗药物TMZ使用的决策提供重要的临床辅助价值，为实现胶质瘤精准的个体化治疗提供依据。