0 引言

       乳腺癌的发病率在过去20年呈显著增长的趋势^[1]，化疗是其最重要的治疗方式之一，但同时也会带来一系列的问题。化疗相关认知障碍（chemotherapy-related cognitive impairment, CRCI）通常被称为“化疗脑”，包括主观报告和客观测试化疗后的认知问题，是癌症患者化疗中常见的不良反应^{[2, 3, 4]}。CRCI是一种常见的并且经常被忽略的化疗副反应，常引起患者恐惧紧张，其影响甚至比肿瘤的复发和转移更严重^{[5, 6]}。因此，深入研究CRCI可能的神经机制非常必要。

       δ（Delta）-连环蛋白（catenin）作为p120ctn家族的一员，最早发现在中枢神经系统表达，主要表达于成熟神经元的树突，通过协调树突密度构成影响脑神经元活动^[7]。而最新研究表明δ-catenin高表达在很多肿瘤发展中扮演癌蛋白的作用，并可能作为恶性肿瘤潜在的生物学标记物^{[8, 9, 10]}。然而，乳腺癌作为女性发病率第一的恶性肿瘤^[11]，关于δ-catenin与乳腺癌之间的研究较少，仅有少量文献^{[12, 13, 14]}报道了δ-catenin在乳腺癌中表达增高，并与患者的不良预后相关。既然δ-catenin的表达水平与神经元的形态、功能以及多种肿瘤发展关系紧密，笔者推测乳腺癌患者的δ-catenin高表达会影响神经元存活，从而引起患者认知障碍的出现。静息态功能MRI（rest state-functional MRI, rs-fMRI）作为研究脑功能的先进技术，现已被广泛应用于许多脑疾病的临床研究^{[15, 16]}，但是，目前国内外尚缺乏不同δ-catenin蛋白表达对乳腺癌患者化疗后脑功能状态影响的研究。因此，本次研究拟采用rs-MRI技术对不同δ-catenin表达的乳腺癌患者化疗前后静息态脑功能进行短期纵向研究，为患者CRCI的早期评估提供神经影像学标志物，也为乳腺科医师根据患者δ-catenin表达状态选择预防及治疗CRCI提供神经影像学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

       本研究所有患者均来自赤峰学院附属医院，本研究遵守《赫尔辛基宣言》，经赤峰学院附属医院医学伦理委员会批准，批准文号：fsyy202136，全体受试者均签署了知情同意书。前瞻性收集2021年1月至2023年6月经病理证实为乳腺癌且进行首次标准化疗的患者。纳入标准：（1）经病理诊断的女性乳腺癌患者，且前期未进行任何治疗，且接受相同标准蒽环联合环磷酰胺（anthracyclines cyclophosphamide, AC）化疗方案患者；（2）入组前认知评分正常，且为右利手者；（3）无磁共振扫描禁忌证。排除标准：（1）出现恶病质、恶性贫血或脑转移；（2）术前接受过抗雌激素治疗或者放射治疗；（3）有药物或酒精依赖、严重的神经或精神疾病；（4）有脑外伤、脑梗死、脑肿瘤病史或脑部先天性畸形；（5）扫描过程中因头动位移大于3 mm或大于3°患者；（6）年龄>50岁以及有糖尿病、脑小血管病等影响脑认知等病史患者。按照血清δ-catenin表达水平对所有患者进一步分组，化疗前总患者数为104例，δ-catenin高表达患者51例，δ-catenin低表达患者53例，而经过标准化疗2个周期后，再次进行了神经心理学评分，且顺利进行了多模态MRI扫描的患者，共剩余66例，其中δ-catenin高表达组31例，δ-catenin低表达组35例。2次标准化疗后扫描数据定为T1（time 1），化疗前数据为基线组定为T0（time 0）。收集所有患者临床资料，包括年龄、受教育年限、雌激素、孕激素、病理分级及人表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor 2, HER-2）指标。同时，在当地招募了36名年龄、受教育年限均与患者相匹配的健康志愿者作为对照（healthy control, HC）组。纳入标准：（1）认知评分正常，且为右利手者；（2）年龄<50岁，且无糖尿病等影响大脑认知病史的女性志愿者。排除标准：（1）脑MRI检查有脑缺血灶、梗塞灶及其他可能影响认知水平病史的志愿者；（2）扫描过程头动位移大于3 mm或大于3°志愿者。

1.2 神经心理学评分及化疗方案

       由受过专门训练的1名工作16年的神经内科副主任医师在患者意识清醒、安静的环境下进行神经心理学测试。包括：（1）中文版《癌症治疗认知功能评估》（Functional Assessment of Cancer Therapy-Cognitive, FACT-Cog），以评估患者主观认知状况，包含四个分量表[感知认知障碍（Perceived Cognitive Impairment, PCI）；他人的评价（Comments From Others, OTH）；感知认知能力（Perceived Cognitive Abilities, PCA）；对生活质量的影响（Impairments On Quality Of Life, QOL）]。（2）简易智力状态检查量表（Mini Mental State Examination, MMSE），评估患者的客观认知功能。（3）蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment, MOCA），以评估患者的客观认知障碍功能。（4）中文听觉语言学习测验（Auditory Verbal Learning Test, AVLT），用于评估临床记忆力，包括短时记忆（AVLT-short）、长时记忆（AVLT-long）及延迟再认记忆（AVLT-delay）。（5）韦氏记忆量表检验临床记忆评价，包括数字符号转化测验（Digital Symbol Substitution Test, DSST）以及数字连线实验A-B（LineA-B），对处理速度进行测试。

       本研究所有乳腺癌患者的化疗过程为表柔比星+环磷酰胺（anthracyclines cyclophosphamide, AC）方案治疗4疗程，表柔比星剂量：90~100 mg/m²，用药时间：d1，周期1/21 d×4；环磷酰胺剂量：600 mg/m²，用药时间：d1。每个疗程为期21天，间隔21天，无其他治疗措施。本次短期纵向研究第二次化疗后数据即患者经过第一次21天化疗疗程，间隔休息21天后再次进行第二次21天疗程后行MRI检查及神经心理学评分。

1.3 MRI扫描

       所有受试者使用GE HDXT 3.0 T扫描仪进行颅脑MRI检查，包括rs-fMRI、3D-T1加权图像及常规磁共振图像，常规磁共振图像包括横断位T1WI、T2WI、扩散加权成像（diffusion weighted imaging, DWI）以及T2-液体衰减反转恢复（fluid attenuated inversion recovery, FLAIR）序列，用于排除患有其他中枢神经系统疾病。

       rs-fMRI数据采集轴位平面回波成像，参数如下：TR 3 000 ms，TE 40 ms，FOV 240 mm×240 mm，体素3.44 mm×3.44 mm×3.00 mm，扫描层数34层，层厚4 mm，层间距1 mm，34层轴位层面，共扫描200个时间点，扫描时间10 min。

       3D-T1加权图像采用矢状位容积扫描，序列参数为：TR 6.7 ms，TE 2.4 ms，FOV 350 mm×350 mm，体素1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm，扫描层数188层，扫描时间3 min。

1.4 数据处理

       rs-fMRI图像数据在软件MATLAB 2013b上使用GRETNA对数据进行预处理和功能指标分析，采用SPM 12工具包进行统计分析。图像预处理：（1）DICOM格式图像转换为NIFTI格式；（2）删除前10个时间点的数据；（3）时间校正；（4）头动校正；（5）回归去除有害协变量；（6）将图像进行空间标准化；（7）进行平滑，并计算所有受试者的脑功能指标，包括低频振幅（amplitude of low frequency fluctuation, ALFF）值、分数低频振幅（fractional amplitude of low frequency fluctuation, fALFF）值以及局部一致性（regional homogeneity, ReHo）值。

       ALFF和fALFF分析：利用快速傅里叶变换（fast fourier transform, FFT）将每个给定体素的时间过程分解到频域。ALFF值计算为在每个体素的0.01~0.08 Hz频率范围内应用FFT后功率谱的平均平方根。fALFF值计算为特定频段功率的比值（在0.01~0.08 Hz范围内进行带通滤波），为了消除个体之间全脑fALFF在整体水平上的差异，采用Fisher Z-scores变换将每个体素的fALFF值转换为Z值。

       ReHo分析：对归一化图像进行0.01~0.08 Hz的带通滤波。ReHo值通过计算给定体素与其相邻体素之间的Kendall和谐值系数来量化。将每个体素的ReHo值除以ReHo图的全脑平均值，以减少个体变异的影响。

1.5 免疫组化分析

       所有的免疫染色切片都经2位经验丰富病理医师（工作年限21年的主任医师和工作年限17年的副主任医师）采用盲法独立评分，当出现结果不一致时，由两位医师最终商议决定。首先在低倍镜下（×100）去辨认染色均匀的区域，然后计数肿瘤细胞，细胞质中出现棕色颗粒被认为是阳性信号。δ-catenin的评分标准：免疫组化染色强度分为4级：0，阴性；1，弱染色；2，中度染色；3，强染色。阳性细胞百分数分为5级：0%<0分≤1%；1%<1分≤25%；25%<2分≤50%；50%<3分≤75%；4分>75%。每个标本的总分数是由肿瘤细胞染色强度和肿瘤细胞阳性百分数两部分的乘积得出的，范围是0~12分，0<δ-catenin低表达组≤7，7<δ-catenin高表达组≤12。

1.6 统计学分析

       采用SPSS 26.0先对基线三组间临床资料进行统计分析，以频数表示计数资料，行χ²检验。以均数±标准差表示符合正态分布的计量资料，行独立样本t检验；以中位数（上下四分位数）表示不符合者，行Mann-Whitney U检验。使用SPM 12软件对功能指标进行统计分析，将年龄、受教育年限及正交化后HER-2指标作为协变量，进行单因素方差分析，以分析全脑水平上ALFF、fALFF、ReHo的组间差异。在团块水平上应用家族误差（family wise error, FWE）进行多重比较校正，之后进行事后比较，然后利用DPARSF软件提取各团块的平均值，结果以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料及神经心理学评分结果

       δ-catenin高表达、δ-catenin低表达及HC三组间在年龄及受教育年限方面差异无统计学意义，δ-catenin高表达组、δ-catenin低表达组的雌激素、孕激素差异亦无统计学意义，但HER-2差异有统计学意义（P=0.005），其中δ-catenin高表达组HER-2水平明显高于δ-catenin低表达组（表1）。神经心理学评分结果显示δ-catenin高表达组患者化疗后FACT-Cog-SUM（总分）、FACT-Cog-PCA、MMSE、MOCA、DSST、AVLT记忆评分以及Line-B较化疗前差异有统计学意义，而δ-catenin低表达组则只有AVLT-长时记忆评分差异有统计学意义（P<0.05），其余评分差异无统计学意义（表2, 3）。

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表1  乳腺癌δ-catenin高表达组、低表达组及HC组临床资料统计结果
Tab. 1  Statistical results of clini.cal data of breast cancer δ-catenin high expression group, low expression group and HC group

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表2  δ-catenin高表达组患者神经心理学评分化疗前后对比
Tab. 2  Comparison of neuropsychological score in δ-catenin high expression group before and after chemotherapy

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表3  δ-catenin低表达组患者神经心理学评分化疗前后对比
Tab. 3  Comparison of neuropsychological score in δ-catenin low expression group before and after chemotherapy

2.2 rs-fMRI分析

2.2.1 ALFF差异

       δ-catenin低表达和δ-catenin高表达两组间化疗前后纵向比较，脑功能指标fALFF值两次对比未通过校正；而部分脑区ALFF及ReHo值差异有统计学意义。其中ALFF值，δ-catenin低表达组患者化疗后右侧前扣带和旁扣带回ALFF值下降（图1A），而δ-catenin高表达组右侧小脑半球4-5区、双侧脑岛、左侧舌回化疗后ALFF值下降（图1B，P<0.05），表4。

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图1  乳腺癌患者化疗前后ALFF值差异脑区。1A显示DL组患者化疗后右侧前扣带和旁扣带脑回ALFF值较化疗前下降，T1<T0（P<0.05，FWE校正）。1B显示DH组患者化疗后右侧小脑半球4~5区、双侧脑岛、左侧舌回ALFF值较化疗前下降，T1<T0（P<0.05，FWE校正）。R：右侧；L：左侧；T0：化疗前数据；T1：第二次化疗后数据；DL：δ-catenin低表达；DH：δ-catenin高表达；ALFF：低频振幅。
Fig. 1  The difference of ALFF value in brain regions of breast cancer patients before and after chemotherapy. 1A shows that the ALFF values of right anterior cingulate and paracingulate gyrus in DL group after chemotherapy are lower than those before chemotherapy (P<0.05, FWE-corrected). 1B shows that the ALFF values of right cerebellar hemisphere area 4-5, bilateral insular and left lingual gyrus in DH group after chemotherapy are lower than those before chemotherapy (P<0.05, FWE-corrected). R: right side; L: left side; T0: before chemotherapy data; T1: data after the second chemotherapy; DL: delta-catenin low expression; DH: delta-catenin high expression; ALFF: amplitude of low frequency fluctuation.

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表4  δ-catenin低表达组、高表达组化疗前后ALFF值比较
Tab. 4  Comparison of ALFF between δ-catenin low expression and high expression groups before and after chemotherapy

2.2.2 ReHo差异

       ReHo指标中，δ-catenin低表达组患者化疗后左侧眶部额下回ReHo值下降（图2A）；而δ-catenin高表达组则左侧缘上回、左侧三角部额下回ReHo值下降（图2B，P<0.05），表5。

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图2  乳腺癌患者化疗前后ReHo值差异脑区。2A显示DL组患者化疗后左侧眶部额下回ReHo值较化疗前下降，T1<T0（P<0.05，FWE校正）。2B显示DH组患者化疗后左侧缘上回、左侧三角部额下回ReHo值较化疗前下降，T1<T0（P<0.05，FWE校正）。R：右侧；L：左侧；T0：化疗前数据；T1：第二次化疗后数据；DL：δ-catenin低表达；DH：δ-catenin高表达；ReHo：局部一致性。
Fig. 2  The difference of ReHo value in brain regions of breast cancer patients before and after chemotherapy. 2A shows that the ReHo values of left inferior orbital frontal gyrus in DL group after chemotherapy are lower than those before chemotherapy (P<0.05, FWE-corrected). 2B shows that the ReHo values of left superior marginal gyrus and left triangular inferior frontal gyrus in DH group after chemotherapy are lower than those before chemotherapy (P<0.05, FWE-corrected). R: right side; L: left side; T0: before chemotherapy data; T1: data after the second chemotherapy; DL: delta-catenin low expression; DH: delta-catenin high expression; ReHo: regional homogeneity.

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表5  δ-catenin低表达组、δ-catenin高表达组化疗前后ReHo值比较
Tab. 5  Comparison of ReHo between δ-catenin low expression and high expression groups before and after chemotherapy

3 讨论

       本研究首次采用rs-fMRI方法对δ-catenin不同表达状态乳腺癌患者在化疗前及第2个标准AC化疗后进行自身短期纵向对比研究。研究发现，δ-catenin高表达组患者脑功能下降的脑区明显多于δ-catenin低表达组，提示δ-catenin高表达组患者出现损伤脑区较δ-catenin低表达组严重，并且在ALFF指标中出现小脑脑区的改变。结果反映了δ-catenin可能具有一定促癌作用，这与很多既往研究^{[8, 9, 10]}结果相似，且δ-catenin高表达可能对小脑半球也存在一定特异性影响。两组患者化疗前后神经心理学评分结果亦表明，乳腺癌δ-catenin高表达患者较低表达组患者更早出现认知障碍。这些发现均提示δ-catenin蛋白引起早期脑损害可能涉及执行认知功能调控等相关脑区，这为患者CRCI早期评估及乳腺科医师治疗方案的制订提供神经影像学依据。

3.1 δ-catenin与HER-2交互作用以及正交化处理

       本研究基线数据中，只有HER-2指标在δ-catenin高表达与低表达组中存在差异，且δ-catenin高表达组显著高于低表达组。HER-2是国际公认的乳腺癌预后评估指标之一，且研究表明HER-2过表达与一个或多个认知功能区域相关，尤其在记忆方面^{[17, 18]}。正交化是一种统计学中的数据处理技术，主要用于消除多重共线性。δ-catenin蛋白与HER-2可能都会对患者认知产生影响，为了消除两者共同对患者认知的交互影响，需要对HER-2进行正交化处理，再把正交后的HER-2作为协变量进行统计分析，以提高结果可信度。本次短期纵向结果显示脑功能ALFF及ReHo指标中，δ-catenin高表达组患者中出现损伤的脑区明显比低表达组多，表明了δ-catenin高表达患者在乳腺癌过程中出现脑损伤明显多于蛋白低表达者。亦有研究与本结果相似，认为δ-catenin与HER-2之间存在互相协同作用，可能在肿瘤浸润进展过程中起重要作用^{[19, 20]}。由于δ-catenin含有多个结构域，作用于广泛的蛋白质间相互作用，且δ-catenin在分子水平上处于信号通路的关键点，多方面参与多种疾病的发生发展，这也由此推测δ-catenin在肿瘤中的表达增高可能与多种机制^{[8, 9, 10, 12, 13, 14, 21]}有关。

3.2 δ-catenin与小脑网络关系

       以往的解剖和功能神经影像学研究表明，小脑除了参与精细的运动和肌肉紧张协调外，还与前额叶皮质、边缘系统及通过小脑-丘脑-皮层回路存在密切的纤维连接，并形成多个闭环神经回路，在认知（即注意、言语学习、记忆和认知规划）和情感过程中发挥作用^{[22, 23, 24]}。较多文献研究表明，乳腺癌患者化疗后，小脑半球部分脑区功能指标下降，且伴有认知的改变，主要体现在记忆测试和认知自我评价方面^{[25, 26]}，文献指出小脑皮层的功能连接变化可能是认知障碍的一个病理生理基础。本研究在严格限制其他影响因素前提下，发现δ-catenin高表达组出现右侧小脑半球4~5区ALFF值下降，说明高表达δ-catenin对于小脑半球该部分脑区具有独特的影响。且本研究中两组神经心理学评分结果显示，δ-catenin高表达组患者化疗后FACT-Cog-SUM、PCA、MMSE、MOCA、DSST以及AVLT记忆评分化疗前差异均有统计学意义，而δ-catenin低表达组则只有AVLT-长时记忆评分差异有统计学意义，说明δ-catenin高表达组患者出现认知障碍时间较低表达组早。亦有文献^{[27, 28]}证实δ-catenin与小脑半球存在密切联系，这可能为乳腺癌患者出现认知功能障碍发病机制提供一种新的参考。

3.3 δ-catenin与认知相关性

       本研究结果显示，δ-catenin高表达及低表达组患者损伤脑区大部分集中在与听觉、语言、高水平的认知功能相关的脑区。脑岛叶作为边缘系统的一部分，更多地涉及较高级的认知和执行力活动^{[29, 30]}。舌回位于枕叶，与边缘系统直接相连，是参与视觉识别的重要脑区，舌回这一区域的损害尤其涉及视觉记忆功能障碍^{[31, 32]}。缘上回位于顶叶联合区，主要汇集了顶、颞和枕叶的神经束，参与多种认知功能，包括言语重复、听觉短期记忆和音素片段排序^{[33, 34]}。额下回三角为前额叶组成脑区，是默认网络的重要组成部分，并与多种脑功能有关，包括记忆相关的情绪、自我意识、认知调节、记忆和奖励^{[35, 36]}。在严格限制其他影响因素下，δ-catenin高表达及低表达组化疗前后神经心理学评估存在明显不同的结果，δ-catenin高表达组患者出现认知障碍时间较δ-catenin低表达组早，说明δ-catenin高表达对于乳腺癌具有促进进展作用，这也与既往研究^{[12, 13, 14]}的结果一致，提示δ-catenin蛋白高表达可能是导致乳腺癌患者记忆下降的临床症状原因之一。

3.4 本研究局限性

       本研究尚存在一些局限性。首先，本研究未能考虑患者的病程，而病程可能在一定程度上影响认知及脑网络改变等。其次，本研究没有对患者进行情绪状态进行评估，δ-catenin与患者情绪相关性有待进一步研究。第三，患者只进行了组织学Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ病理分级，没有采用标准TNM分期，在自身纵向统计中没有将化疗这个加权因素作为协变量，并且由于肿瘤本身存在异质性而可能存在其他影响认知的因素，以后将更加完善患者资料，并考虑多种因素作为协变量进行统计分析，使得结果更加客观。第四，目前对比指标仅是第二次化疗后与基线组数据短期对比，后续还需要继续补充第三次、第四次化疗后数据与基线的自身纵向研究，以进一步探究δ-catenin蛋白对乳腺癌患者的长期影响。

4 结论

       综上所述，本研究中多项结果均说明δ-catenin蛋白不同状态对患者脑功能指标的改变明显不相同，提示δ-catenin的高表达对乳腺癌患者执行认知功能调控相关的脑区有一定程度影响，为预防乳腺癌患者化疗后认知障碍提供了影像依据。