神经干细胞移植治疗缺血后脑梗死已经获得一定的疗效^[1]，但因神经干细胞来源有限而受到限制。研究发现，脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)在一定条件下可定向诱导分化为神经细胞^[2,3]，因而有可能成为一种新的成体多能干细胞来源，用于治疗中枢神经系统疾病。本实验利用超顺磁氧化铁纳米微粒(superparamagnetic iron oxide, SPIO)标记ADSCs，探讨活体下利用MRI动态监测标记ADSCs移植后的存活、迁移及分化情况。

1　材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1　实验动物及分组：

       清洁级Sprague Dawley雄性大鼠(中南大学实验动物中心提供)40只。模型制作过程中死亡4只，36只脑缺血模型大鼠随机分为空白对照组(12只)、磁性标记ADSCs移植组(12只)和未磁性标记ADSCs移植组(12只)。

1.1.2　主要试剂：

       胎牛血清(四季青公司)，低糖改良Eagle培养基(low glucose Dulbecco' modified Eagle's medium)(美国GIBCO/BRL公司)，胶原酶Ⅰ(北京鼎国)，胰蛋白酶(Sigma)，Typan blue(Sigma)，兔抗大鼠CD31、神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体、羊抗兔生物素免疫球蛋白和DAB显色试剂盒(博士德公司)，多聚左旋赖氨酸(poly-l-lysine, PLL)(Sigma),菲立磁(Feridex)(美国先进磁力公司)。

1.1.3　主要设备：

       FORMA3111 CO2培养箱(美国)，SW-CJ-2FD超净工作台(苏净集团安泰公司)，倒置相差显微镜(Nikon，日本)，1.5 T磁共振成像系统(Sonata，SIEMENS公司)，立体定向仪(美国)，微量注射器(Hamilton)。

1.2　实验方法

1.2.1　ADSCs的分离、培养：

       Sprague Dawley大鼠脂肪干细胞的分离培养方法参见文献^[4]。

1.2.2　ADSCs标记：

       将Feridex用含15%胎牛血清的L-DMEM培养液释稀成25 mg FE/L，加入PLL(最终浓度为0.75 mg/L)37℃孵育1小时。提取第三代增殖较活跃的ADSCs，用上述培养基吹散悬浮，细胞密度为2×10⁶/ml,移入细胞培养瓶培养12小时后提取细胞离心，细胞沉淀用PBS洗涤3次，更换无铁的培养基继续培养2天，然后提取细胞备用。

1.2.3　大鼠脑缺血模型的制作：

       选取健康成年雄性SD大鼠，体重220~250 g，术前禁食，自由饮水。麻醉用10%水合氯醛腹腔注射(4~6 ml/kg)，术中用10%水合氯醛(0.3 ml/h)腹腔维持麻醉状态。麻醉后大鼠右侧卧位，于左侧耳眦连线前1/3处备皮，并垂直该连线作一约1.5 cm的皮肤切口，钝性分离颞肌直至暴露颅骨，在颞骨鳞部与颧弓交界处前方1 mm，用低速牙科钻开一2 mm×2 mm大小的骨孔，轻轻撕去薄层内板，暴露硬膜，用显微镊轻轻撕去硬膜，显露大脑中动脉，用10号丝线结扎，同时暂时堵断双侧颈总动脉1小时后，明胶海绵覆盖皮质表面及骨孔，将颞肌复位，缝合皮肤，用络合碘消毒。

1.2.4　标记ADSCs活体移植：

       模型制作后1天再次麻醉动物，俯卧固定于立体定向仪上。消毒损伤对侧头顶皮肤，切开皮肤暴露矢状缝、冠状缝和前囟，前囟后3 mm、中线旁3 mm钻直径1 mm的孔。以颅骨外板为基线，微量注射器刺入深度4 mm固定，5 min内缓慢注射含1×10⁶个磁性标记ADSCs或1×10⁶个未磁性标记ADSCs的悬液10 μL。留针10min后缓慢拔出，骨蜡封孔，术区消毒缝皮。腹腔注射庆大霉素2000 U抗菌治疗，回笼饲养。对照组大鼠按同样方法仅注射10 μL不含ADSCs的磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照。

1.2.5　磁共振成像和免疫组化：

       各组大鼠在移植后1天、1周和3周进行磁共振动态观察。使用德国SIEMENS Sonata 1.5 T超导磁共振成像系统进行2D多层成像。成像条件：采用3英寸的鸟笼线圈，FOV 9 cm×9 cm，层厚2 mm，层间距0。分别进行T1自旋回波(SE，TR/RE=450/10 ms)，T2快速自旋回波(FSE，TR/RE=4200/93 ms)。各组大鼠移植后21天处死，取下大脑组织切片行移植区普鲁士蓝染色。

1.2.6　神经损害严重程度评分(NSS)：

       参照Chen^[5]等的方法，分别于移植后1天、7天、14天、21天对ADSCs移植组及缺血对照组大鼠进行NSS评分，主要观察其运动、感觉功能、平衡能力及生理反射。总分为18分，正常为0分，分值越高其神经损害越严重。

1.3　统计学处理

       评分数据采用均数±标准差表示，使用SPSS 11.0统计软件，组间两两比较采用t检验。

2　结果

2.1　SPIO标记的ADSCs普鲁士蓝染色和体外MRI成像

       SPIO标记的ADSCs普鲁士蓝染色显示细胞内蓝染的铁颗粒(图1)，标记率接近100%，表明通过多聚左旋赖氨酸(PLL)转染法能够将SPIO颗粒有效地转移到脂肪干细胞中。MR T2WI序列显示标记细胞信号明显降低，未标记细胞、相应的无铁培养基和蒸馏水呈显著高信号(图2)。

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图1  菲立磁标记的ADSCs(箭头)普鲁士蓝染色阳性(200×)

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图2  T2WI示图中右下角小圆形为磁性标记ADSCs(箭头)，信号明显降低。左下角和正上方小圆形分别为未标记ADSCs和相应的无铁培养基，中间大圆形为蒸馏水

2.2　脑缺血模型制作

       模型制作后3天T2WI见梗死组织呈高信号，局限在皮质，边界清晰，梗死体积大小较稳定(图3)。术后大鼠清醒后回笼饲养，大鼠状态良好，可以进行正常饮水和进食，大鼠术后死亡率低，存活率90%，40只大鼠在模型制作过程中仅死亡4只。

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图3  大鼠MCAO模型制作后第三天成像，梗死灶界限清楚(箭头)

2.3　SPIO标记的ADSCs脑内移植后的MRI示踪

       SPIO标记的ADSCs脑内移植后3周MR扫描显示T1、T2、T2^*GRE扫描在移植区可见低信号区，且可见标记ADSCs移植后通过胼胝体向损伤灶迁移(图4)。

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图4  T2WI序列上显示磁性标记ADSCs从移植点(白色细箭头)呈低信号沿胼胝体向病灶(白色粗箭头)迁移，并迁移至损伤灶周围，与图3普鲁士蓝染色区相对应

2.4　SPIO标记的ADSCs移植后病理组织普鲁士蓝染色观察

       在ADSCs移植后约3周，取移植鼠脑组织行普鲁士蓝染色检查。结果显示与MRI低信号相对应的区域可见到普鲁士蓝染色阳性细胞存在(图5、图6)。

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图5  普鲁士蓝染色显示标记ADSCs(箭头)移植后自移植点通过胼胝体向对侧损伤灶迁移(200×)

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图6  移植区附近可见到普鲁士蓝染色阳性细胞存在(箭头，200×)

2.5　ADSCs移植治疗缺血性脑损伤大鼠后神经行为功能评估

       移植后3周ADSCs移植组的NSS评分较缺血对照组有明显恢复(表1)。

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表1  磁标记ADSCs移植组与对照组移植后不同时间NSS的比较

3　讨论

       采用无创伤性影像技术在体识别、跟踪移植后干细胞的存活状态及与宿主组织整合情况，是近几年国内外学者关注的问题。分子影像学的发展为活体实时监测干细胞在宿主体内的分布、迁移和生长代谢提供了可能。在多种分子影像学方法中，MRI由于其成像时间窗长，可观察细胞的动态迁移过程，且具有时间、空间分辨率高，对比度好，最有希望成为活体细胞移植后示踪的重要分子成像技术^[6]。

3.1　脂肪干细胞标记

       在应用MRI进行干细胞活体成像前，需要将MR对比剂体外引入干细胞后再移植。目前标记干细胞的MR对比剂主要分为两大类：一类是Gd³⁺对比剂，即顺磁性对比剂，主要产生T1正性对比效应。目前有关的应用报道不多，主要是因为在目前MR场强下，Gd³⁺的量需要达到相当程度，这在技术上尚有难度。另一类是以单/多晶体氧化铁为基础的对比剂，主要产生较强的T2负性对比效应。其特点是粒径小，穿透力强，且弛豫率约为同样条件下Gd³⁺的7~10倍，在很低浓度(nmol级)即可在MR上形成对比，且具有生物可降解性^[7]。以上特点使氧化铁类对比剂更受关注，是目前较理想的磁共振示踪剂。

       在体外，由于细胞膜、氧化铁颗粒都带负电荷，影响了细胞对这些颗粒的摄取，所以不经修饰的氧化铁难以有效标记干细胞。研究报道，采用带正电荷的多聚左旋赖氨酸(PLL)包裹SPIO形成复合物SPIO-PLL更易进入细胞内，从而提高了干细胞的磁标记率，且对细胞生物学特性的影响小^[8]。本实验发现，应用较少量的PLL与SPIO形成复合物，可大大提高ADSCs对氧化铁微粒的吞噬率，Prussian blue染色显示大量的蓝染铁颗粒位于细胞质内，而仅用菲立磁标记，ADSCs胞质内仅见极少量的散在分布的蓝染铁颗粒。同时，Typan blue拒染试验显示3周内ADSCs的生长、增殖和活力无明显改变，说明此方法标记ADSCs是安全有效的。

3.2　缺血脑损伤模型的选择

       目前，造成局灶性脑梗死模型的方法有开颅法、血栓栓塞法、线栓法和光化学法。为了观察干细胞移植后在脑内的迁移过程，建立的脑梗死动物模型必须模型稳定、梗死体积相对恒定、梗死体积小，避免干细胞迁移过于分散，梗死局部并发出血机会小(避免含铁血黄素在梗死灶局部沉积影响对干细胞的观察)，同时动物模型存活率高。针对这个目的，本课题组参照Chen^[9]等的方法，通过开颅法直接结扎大脑中动脉同时暂时堵断双侧颈总动脉，建立的动物模型梗死体积相对稳定，长期存活率高。

3.3　磁性标记脂肪干细胞移植治疗缺血性脑损伤的MRI示踪成像

       已有研究证明，移植入脑内的干细受到病变部位各种细胞信号的影响，可定向地向脑损伤部位迁移，并可改善脑损伤动物的功能^[10,11,12]。本研究显示，在缺血性脑损伤后移植磁性标记ADSCs组中，大鼠脑FSE T2WI示踪观察到磁性标记ADSCs从移植部位通过胼胝体定向向对侧缺血性脑损伤部位迁移至损伤组织边缘，而且大鼠脑梗死模型ADSCs移植组的NSS评分较对照组和PBS组都有明显恢复，说明移植ADSCs可以有效地促进缺血性大鼠神经行为功能的恢复。脑切片普鲁士蓝染色观察到的磁化标记ADSCs的位置，与FSE T2WI示踪观察的磁性标记ADSCs从移植部位通过胼胝体定向向对侧缺血性脑损伤部位迁移至损伤组织边缘的低信号带一致。这表明移植细胞能在宿主脑内存活，并定向向脑损伤部位移动，修复损伤的脑组织。因此，本研究证明用MRI活体示踪移植磁化标记ADSCs在缺血性脑损伤模型大鼠脑内迁移和分布是可行、有效的。

       综上所述，ADSCs来源丰富，获取方便，体外扩增快和具有神经分化潜能，特别是可自体移植，避免了免疫排斥反应，因此更有利于神经移植研究。MRI通过SPIO和PLL复合物标记ADSCs方法，能够活体评价ADSCs移植后的细胞迁移。

       尽管ADSCs移植可确实改善脑组织损伤后的功能，但确切的作用机制仍有待于进一步研究。