磁共振扩散加权成像(diffusion weighted imaging, DWI)与磁共振波谱、灌注成像是研究功能及微观影像学的重要工具之一。最初用于中枢神经系统疾病，特别是超急性期脑梗死、脑肿瘤及癫痫等疾病^[1]。由于呼吸及心脏搏动的影响，在肝脏的应用受到限制。最近，由于平面回波技术的应用，生理性运动伪影基本可以被冻结，DWI在肝脏的应用逐渐开展^[2]。肝硬化、肝炎、肝性脑病、肝脓肿及各种肝脏占位性病灶DWI研究及临床应用已获得了较大的进展^[3,4,5,6,7]。肝肿瘤治疗后发生坏死及残存肿瘤组织的DWI表现及表观弥散系数(apparent diffusion coefficient, ADC)值测量已有报道^[8,9]，但是前瞻性研究发生灶性凋亡的肝细胞DWI表现及ADC值测量尚未见报道。本文通过大鼠肝门静脉结扎的方法来促使肝细胞发生灶性凋亡，研究凋亡的DWI表现及ADC测量值定量研究。

1　材料与方法

1.1　动物手术及分组

       选取体重300 g左右的SD大鼠30只，雌雄各半，3%戊巴比妥(1 ml/kg)腹腔麻醉，中下腹部剪毛后，在严格无菌条件下打开腹腔，将胃及肠管慢慢提起至于切口外，用湿纱布覆盖，然后在显微镜下顺着肝胃韧带及肝十二指肠韧带找到门静脉右分支进行钝性分离，并用0号线两次结扎确保门静脉血供完全中断。然后将腹部脏器完全回位关腹。术后将30只大鼠随机分成5组，每组6只。

1.2　磁共振检查序列及参数

       实验大鼠MRI检查采用Marconi 1.5 T Edge Eclipse^TM MR成像仪，腕关节环形表面线圈(外直径为12 cm，内直径约为9 cm)为接收线圈。大鼠麻醉后右侧卧位，将肝脏部位置于线圈中央，并用胶布固定，然后调整垫子高度以保证大鼠上腹部位于磁场中心位置，定位片获得后，行常规冠状位FSE序列T2WI，TR/TE=4000/80 ms，层厚3.0 mm，FOV 13.0 cm，矩阵192×256，信号激励次数为2。然后行横断位T1WI、T2WI，TR/TE=450/12.0 ms及TR/TE=4000/80 ms，层厚2.0 mm，FOV 11.0 cm，矩阵192×256，信号激励次数为2；横断位DWI：TR/TE=∞/135.5 ms，b值设为100、300、500 s/mm²。

1.3　病理学及电镜检查

       MRI和DWI检查结束后，先取电镜标本，写明样本包埋要求，然后择期进行半薄定位、电镜观察及取片，将有明显细胞核固缩的观察野做好标记，进行电镜观察、分析。

       在电镜取材完成后，立即置于10%福尔马林溶液中固定24 h以上，取肝右叶与左叶组织分切后常规石蜡包埋。将石蜡组织块进行5 μm连续切片，随机抽取病理白切片分别做常规HE染色、末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡。TUNEL染色，采用德国DAKO公司生产的ApopTag S7100试剂盒，按照试剂盒附带的染色操作步骤进行，以细胞核呈深棕红色伴核皱缩的细胞为细胞凋亡阳性细胞，否则为阴性。

1.4　ADC值测量及统计学方法

       在T1WI肝左叶上编辑直径为3.0 mm的一个感兴趣区(ROI)，在同一层面上我们在T2WI肝右叶上编辑同样大小的一个ROI，然后采用同层复制的方法在不同b值的DWI图像上加以复制，分别测量病灶侧及对照侧T1WI、T2WI、DWI信号值，运用公式ADC=ln(S1/S2)/(b2-b1)算出ADC测量值，S1、S2是不同弥散敏感系数(b1、b2)条件下弥散加权图像的信号强度。同样的方法测量3次取其平均值作为ROI的ADC值。ROI应避开血管、腹壁脂肪组织和含气肺组织。统计学方法，采用配对t检验比较对照侧与病灶侧的差异，各组之间的差异采用两因素随机区组方差分析进行两两比较，统计水平为P=0.05，统计软件为SPSS 10.0。

2　结果

2.1　大鼠肝门静脉结扎的病理变化

       30只大鼠门静脉右分支结扎后，肝右叶颜色稍变暗(图1)，3天后肝右叶开始发生萎缩，以14天最为显著，而肝左叶发生代偿性肥大改变(图2)。HE染色可见术后3小时肝右叶肝细胞出现少量核固缩肝细胞，此后各时间组固缩肝细胞渐增多(图3)，3天后局部肝细胞发生颗粒变性及水样变性，7天后肝细胞发生弥漫性水样变性，胞浆内见较多水泡。14天后肝细胞水泡变性部分融合，肝细胞膜部分破裂。TUNEL染色术后3小时可见少量散在的染成棕黄色的凋亡细胞，此后各组阳性细胞渐增多，呈灶性分布(图4)。电镜检查发现术后3小时组开始出现凋亡细胞，此后各组凋亡细胞见增多，可见典型的核边集改变(图5)，细胞膜及质膜完好无损，线粒体变性，内质网肿胀，部分凋亡细胞周边可见凋亡小体(图6)。7天后各组肝小叶之间可见小叶间胆管及纤维组织增生改变。

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图1  右肝门静脉结扎术后肝右叶颜色稍变暗(箭头)；
图2  右肝门静脉结扎术后14天，肝右叶明显萎缩(箭头)；
图3  右肝门静脉结扎术后24 h HE染色(200倍)，可见固缩红染的凋亡细胞(箭头)；
图4  术后3天TUNEL染色光镜下(200倍)改变，可见被染成深棕红色的阳性的凋亡细胞，呈小团状分布(箭头)；
图5  术后24 h电镜检查，见典型的凋亡细胞，染色质呈边集改变(3500倍)(箭头)；
图6  电镜下观察可见凋亡小体形成(箭头)

2.2　肝细胞小灶性凋亡的T1WI、T2WI及DWI表现

       术后各组在T1WI肝右叶信号较左侧增高(图7)，3小时组T2WI呈片状低信号，此后各组呈片状高信号(图8)，3小时组DWI呈低信号，24小时后各组均呈片状高信号(图9)，ADC图表现正好同DWI表现相反(图10)。

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图7  术后3天磁共振T1WI，肝右叶呈高信号(箭头)；
图8  磁共振T2WI，呈片状高信号(箭头)；
图9  术后3天DWI，肝右叶呈小片状高信号(箭头)；
图10  图9相应的ADC图，肝右叶呈片状低信号(箭头)

2.3　病灶侧与对照侧T1WI、T2WI信号值及ADC测量值

       由表1可见，右肝门静脉结扎各组病灶侧与对照侧ADC值经配对t检验，P值均小于0.05，差别有统计学意义。各组rADC之间差别无统计学意义。

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表1  各组病灶侧与对照侧T1WI、T2WI信号值及ADC测量值、rADC值

3　讨论

3.1　磁共振扩散加权成像原理

       弥散是指分子的随机侧向运动，即布朗运动。DWI成像时在自旋回波(spin echo, SE)T2加权序列180°脉冲前后加上两个对称的弥散敏感梯度脉冲，对于静止(弥散低)的水分子，第一个梯度脉冲所致的质子因自旋去相位作用，会被对称的第二个梯度脉冲再聚焦，信号不降低；而对于运动(弥散强)的水分子，第一个梯度脉冲所致的质子自旋去相位发生后。很快离开了原来的位置，不能被第二个梯度脉冲再聚焦，导致信号降低。根据Fick定律，真正的弥散是由于浓度梯度导致的分子净运动，在磁共振成像中，浓度差异造成的分子运动和压力梯度、热效应以及离子的相互作用引起的分子运动无法区分，因而只用ADC来表示机体中所测到的弥散，实际上是指设备所能测量的较明显的弥散运动的综合体现。ADC值增大，代表水分子弥散增加，而弥散加权图像信号降低，反之亦然^[10]。

       b值及b值差的选择对于DWI及ADC值的测量非常重要，不同b值及b值差对ADC值能够产生影响^[10,11]。ADC值不仅受水分子弥散的影响，也受毛细血管网中血液的影响，当梯度因子b较小(<100)时，弥散效应对信号的衰减作用非常小，ADC值受灌注的影响很大；随着梯度因子b的增加(>500)，DWI上的图像对比度可更多地反映水分子弥散效应。但是b值太大，信噪比及图像质量均下降^[12]。

       本次实验中采用100、300、500三个b值，随着b值增加，由于微循环的影响减少致使ADC值渐降低，特异性增加，但敏感性及信噪比却下降。其中b值为300图像信噪比最高。

3.2　凋亡动物模型的建立及磁共振扩散加权成像表现

       凋亡是活体内单个或小团细胞死亡，可以是生理性的，也可以是病理性的。是细胞的程序性死亡，死亡细胞的质膜不破裂，不引发死亡细胞的自溶，也不引起急性炎症反应。缺血缺氧程度较轻时可加速细胞的凋亡过程发生，笔者在前期的大鼠动物实验研究中通过单纯门静脉结扎已成功建立了肝细胞凋亡动物模型^[13]。本次实验笔者研究右肝门静脉结扎后，肝右叶合并小团状凋亡的磁共振扩散加权成像表现。凋亡模型建立后各时间组T1WI呈高信号，3小时组T2WI呈低信号，24小时后各组呈高信号，DWI呈片状高信号。这些表现可能的机制是右肝门静脉结扎后，肝右叶血量相对结扎前减少了约75%，蛋白浓度相对增高，致使T1WI表现为片状高信号，与肝左叶分界清晰；由于肝右叶血量突然减少，含水量亦减少，因而3小时组T2WI为低信号，但24小时后由于肝动脉血流缓冲效应^[14]及肝细胞部分水样变性，其含水量又增加，因而此后各组T2WI表现为高信号。DWI各组均表现为片状高信号，可能原因有：①肝右叶门静脉分支结扎后，由于血量减少，肝细胞浓度相对增高，因而水分子弥散受限，DWI信号增加；②肝门静脉结扎后，肝血窦轻度淤血改变，也使水分子弥散受限；③3天后肝细胞开始发生水泡变性，肝细胞性水肿也是弥散受限原因之一；④由于门静脉结扎，微循环的影响减小，致使信号增加。结合笔者前期肝右叶门静脉及肝动脉全部阻断DWI变化，发现肝右叶门静脉单扎DWI信号介于正常肝右叶与全部阻断血供后肝右叶信号之间。

3.3　凋亡的ADC测量值、rADC值及其随b值的变化

       以往的文献^[15,16]认为发生凋亡时，其ADC值是增加的。笔者在肝肿瘤放疗后诱发凋亡实验中^[17]，肿瘤区域的ADC值也是增加的。但是本次实验中各组病灶侧ADC测量值均较对照侧减低，病理学HE染色、TUNEL染色及电镜均证实肝右叶门静脉结扎后确实发生灶性凋亡。分析原因，实验结果与文献并不矛盾，主要的原因是对照组的差别，只能选取自身对照，但是肝左叶同门静脉结扎后的肝右叶比较，由于肝右叶含血量减少及其细胞密度的相对增加，以及后期合并少量空泡变性及小片中央静脉旁坏死等，肝右叶ADC值要低于肝左叶的ADC值。肝右叶发生灶性凋亡后肝细胞间隙增大及细胞数量的减少所致的ADC值增加远远被前述肝右叶含血总量锐减所致的ADC值减低所遮盖。但是，笔者采用rADC值却能够反映出肝右叶门静脉结扎后随着时间的变化情况，同时rADC值还可以去除微循环及b值的影响。rADC值的变化趋势同各组TUNEL染色结果变化一致，表明rADC值可以活体反映本实验中肝右叶发生灶性凋亡的情况。