磁共振波谱(¹H-MR spectroscopy，¹H-MRS)与双回波IP/OP(dual-echo in-phase and opposed-phase，IP/OP)磁共振成像是能无创、活体检测肝内脂肪含量的新诊断方式^[1,2,3,4]，前景广阔，但二者对脂肪肝的诊断价值还处于动物实验阶段^[5,6,7,8,9]。本研究模拟中国居民饮食建立大鼠酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)和非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)两种脂肪肝模型，用3.0T高场强磁共振仪进行IP/OP和¹H-MRS扫描，对照病理结果进行分析，以探讨两种检查方式在ALD和NAFLD半定量诊断中的价值。

1　材料和方法

1.1　脂肪肝大鼠模型的建立

       雄性清洁级Sprague-Dawle (S-D)大鼠120只，由四川大学华西动物实验中心提供，平均周龄5.5周，体重150~200 g，适应性饲养1周后随机分为4组：正常对照组(n对照=20)，给予正常饮食和自由进水；高脂组(n脂=30)，给予高脂饮食和自由进水；酒精组(n酒=30)，给予酒精灌胃和正常饮食；酒精+高脂组(n酒+脂=40)，给予高脂饮食和酒精灌胃。后三组为实验组，高脂组代表NAFLD模型，酒精组和酒精+高脂组代表ALD模型。高脂饮食配方：基础饲料87.9%+猪油11%+胆固醇1%+猪胆盐0.1%。基础全价颗粒饲料由华西动物实验中心提供，猪油为市售，胆固醇、猪胆盐及酒精均购自中国成都精博生物技术有限公司。酒精灌胃量：50%(v/v)乙醇，0.1 ml/(10g·d)灌胃，每天1次^[10,11,12]。喂养4~12周，分别建立NAFLD大鼠模型和ALD大鼠模型。

1.2　磁共振检查

1.2.1　扫描序列及参数：

       从第0、4、8、12周任意选取每组中的6只以上大鼠行MRI检查，采用腹腔内注射水合氯醛(3.3 ml/kg)对大鼠进行麻醉。将大鼠以俯卧位置于大鼠专用体线圈内(上海晨光医疗科技有限公司提供)，肝脏置于线圈中心位置。采用PHILIPS Achieva 3.0 T超导型MR成像仪，先行常规T1W、T2W平扫作为后续序列的定位。主要序列：①梯度回波双回波T1W IP/OP序列，扫描参数：TR 400 ms，TE 9.21 ms(IP)/14.96 ms(OP)，回波链长15，层厚2.5 mm，层间距1.0 mm，FOV 65 mm×52 mm×27 mm，矩阵92×80，体素0.6 mm×0.6 mm×0.6 mm。②¹H-MRS：体素选择尽量避开皮下脂肪、肝裂和较为粗大的血管及胆管，采集序列为单体素点分辨波谱法(single voxel point-resolved selective spectroscopy，PRESS)，放置饱和带，自动匀场。扫描参数：TR 2000 ms，TE 40 ms，FOV 65 mm×65 mm，体素10 mm×10 mm×10 mm，average: 4；NSA: 144，spectral width: 2000 Hz，data point: 1024，扫描时间4分52秒。

1.2.2　MR图像分析：

       采用PHILIPS自带后处理工作站和软件(spectroView)对原始数据进行后处理。同一动物一次扫描同时获得IP/OP对应图像和¹H-MRS图像，取与中心体素基本相同的位置为感兴趣容积(volume of interest，VOI)，分别测量VOI在IP上的信号强度(Iin)和OP上的信号强度(Iop)，通过二者的信号强度差值计算出肝脂变指数(fat index，FI)，计算公式：FI=(Iin-Iop)/Iin。¹H-MRS数据采集后，波谱测定X轴上位于1.3 ppm处甘油三酯代表峰亚甲基峰(CH2)的波峰下面积Slipid和水峰下面积Swater，计算肝细胞相对脂肪含量(relative lipid content，RLC)，计算公式：RLC= Slipid/(Swater+Slipid)。

1.3　病理学检查

       MR检查结束后即刻处死大鼠，取与MRI的VOI区域尽量一致的病理标本，在我院病理科制成冰冻切片，采用苏丹III和HE染色，观察时以苏丹III染色为主。由从事肝脏疾病研究的病理科医师切片阅读，用Image Pro-Plus 6.0软件进行脂滴计数和细胞计数，将二者进行比例计算获得脂肪细胞百分比数。分级标准按照2003年中华医学会肝脏病分会制订的脂肪肝分级标准：30%~50%的肝细胞脂肪变者为轻度脂肪肝，50%~75%的肝细胞脂肪变者为中度脂肪肝，75%的肝细胞脂肪变者为重度脂肪肝^[13,14]。

1.4　统计学分析

       采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较各组模型大鼠体重差别，以及FI与RLC指数对不同程度脂肪肝的诊断是否存在统计学差异；数值采用±s表示；不同模型组的FI与RLC指数与组织病理学结果相关性分析采用Spearman等级相关分析法，绘制散点图。统计软件为SPSS 13.0，P<0.05被视为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　大鼠模型一般情况

       实验组共养成轻度脂肪肝大鼠模型15只，中度19只，重度30只。NAFLD模型大鼠长势良好。ALD模型组大鼠喂养1周后即出现皮毛蓬乱、食欲下降等现象，以单纯酒精组精神萎靡和反应迟钝最为明显，体重增长缓慢，部分大鼠(12只)出现不同程度全身长疮及坏死。第8周高脂组与正常组体重差别有统计学意义(P<0.05)，第4周、12周各组体重无差别(P=0.342)(表1)。

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表1  各组大鼠体重比较(g)
Tab 1  Comparison of weight (g) in various groups

2.2　大鼠模型病理情况

       正常对照组大鼠肝脏色泽朱红，表面光滑，边缘锐利(图1A)，实验组大鼠肝脏体积增大，肝实质色泽依肝脂变程度不同而呈全肝淡黄色到明黄色，表面粗糙油腻，边缘变钝(图1B、图1C)。镜下见对照组肝小叶结构清晰，肝细胞胞浆内无明显脂滴或脂泡形成(图2)，酒精组第4周时肝细胞胞浆内无明显黄色脂滴出现，第8~12周可见多个猩红色小泡型脂滴沉积，高脂组和酒精加高脂组第4周时即细胞内大泡性脂滴空泡增多，散布在各个肝细胞胞浆内，部分融合或者混合改变(图3A)。HE染色为辅助诊断肝细胞浆的脂滴空泡出现率和计数，观察肝脂变结果与苏丹III染色一致(图3B)。

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图1  大鼠肝脏标本肉眼大体观察：(A)正常肝脏颜色朱红，包膜光滑，边缘锐利。(B)中度脂肪肝、(C)重度脂肪肝：颜色变黄，体积变大，包膜钝
Fig 1  The appearance of rat's fatty liver with macroscopic observation. (A) The normal liver showed red color, smooth surface and sharp margin. (B)Moderate fatty liver, (C)Severe fatty liver: Those showed gradual change as yellow color, big volume and blunting margin.

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图2  正常肝脏病理(苏丹III，×200)：肝细胞胞浆内无明显脂滴或脂泡形成
Fig 2  The pathological result of normal liver (Sudan III stain, ×200). No lipid droplet or fat vacuole was found in this picture.

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图3  重度脂肪肝病理。图3A(苏丹III，×200)：肝细胞胞浆内见多个猩红色脂滴形成(箭头)；图3B(HE染色×200)见大量脂滴空泡(箭头)
Fig 3  The pathological result of severe fatty liver. Figure 3A (Sudan III stain, ×200): Lots of scarlet lipid droplets were found in the picture (arrow). Figure 3B (HE stain, ×200): Many fat vacuoles were found in the picture (arrow).

2.3　磁共振检查情况

       排除检查途中死亡和图像质量不佳的大鼠，共73只大鼠的影像指标进入有效统计。参照上述病理学分级，将73只大鼠的MR检查结果分为正常、轻度、中度和重度脂肪肝4型。各脂肪肝大鼠模型的¹H-MRS的X轴上4.7 ppm处的水峰和1.3 ppm处的CH2脂峰谱线图像实测和理论谱线吻合，1.3 ppm处的CH2脂峰谱线下面积随肝内脂肪含量的增加而增加(图4、图5)。OP图像与IP图像对比，肝内信号据肝脂变程度不同而出现衰减差异(图6)。

       对照组中，FI和RLC与肝脂变程度均无统计学意义(PFI=0.273, PRLC=0.062)。ALD与NAFLD不同模型组的RLC、FI与肝脂变程度均呈正相关。NAFLD模型大鼠的RLC与肝病理结果相关系数为r脂=0.886，FI与肝病理结果相关系数为r脂=0.854。ALD模型大鼠的RLC与肝病理结果相关系数分别为r酒=0.946，r酒+脂=0.960，其FI与病理结果相关系数为r酒=0.652，r酒+脂=0.543。实验组三组合并后FI与肝脂变呈轻中度相关(r=0.576，P<0.01)，而RLC与肝脂变程度呈显著相关(r=0.923，P<0.01)。并据此计算出二者的一元线性回归方程：FI=0.380+0.356×FAT(P<0.05)，RLC=0.069+0.838×FAT(P<0.01)。

       经统计学分析，对照组与实验组¹H-MRS水峰峰下面积Swater无明显差异，而脂峰峰下面积Slipid有显著性差异(P<0.05)。RLC在轻、中、重组间均有统计学差异(F=65.072，P<0.01)，FI在重度组与其余三组之间均有统计学差异，中度与正常组之间有统计学差异(F=41.619，P<0.01)，但正常与轻度，轻度与中度间无统计学差异(P>0.05)(表2)。

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图4  正常肝脏¹H-MRS示VOI中心体素内甘油三酯(-CH2)化学位移位置见低平脂肪信号峰
图5  重度脂肪肝¹H-MRS示同一(-CH2)位置见高耸脂肪信号峰，脂峰下面积增加
Fig 4  The ¹H-MRS result of normal liver. The low peak demonstrated the chemical shift position of triglyceride (-CH2) of voxel in region of interest (VOI).
Fig 5  The ¹H-MRS result of severe fatty liver. The peak of triglyceride(-CH2) became higher. Meanwhile, the area under the peak wave increased accordingly.

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图6  重度脂肪肝dual-echo T1W：(左)In-phase图像：肝脏呈高信号显示；(右)Opposed-phase图像：肝内信号普遍衰减(箭头)
Fig 6  The dual-echo T1W results of severe fatty liver. (left) In-phase: the liver showed as high intensity. (right) Opposed-phase: the attenuation of the signal in liver.

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表2  轻、中、重度脂肪肝FI与RLC指标
Tab 2  the FI and RLC index in various grades of fatty liver groups

3　讨论

       NAFLD和ALD模型的建立方法较多，本研究对NAFLD模型采用最常用的高脂饮食营养法，并在配方上加以改进，即在食物中加入较多的猪油、胆固醇和胆盐。动物模型摄入的过多脂肪堆积在细胞内，而胆固醇和胆盐易导致细胞内发生过氧化反应，会加速NAFLD的形成^[15,16]。该方法模拟了中国居民饮食结构，高脂组模拟了肥胖性脂肪肝，造模所需时间长，病变轻，有渐进性发展过程，是国内外实验研究最常用的造模方法^[12]。ALD模型则模拟了饮酒人群所致的酒精性脂肪肝，时间短，病理改变重，脂肪聚集有区域偏重，多在肝静脉以及门静脉、肝小叶静脉区及其周围，短期内停止灌注酒精后可见脂滴消失，因此也证明急性酒精性脂肪肝短期内是可逆的，这种可逆性变化也易被¹H-MRS所检测到，所观察到的¹H-MRS脂峰谱线回落，峰下面积减少，表现与正常肝脏¹H-MRS表现相同。侧面证明了¹H-MRS的无创性、无射线损伤和活体内探测适用于脂肪肝的纵向随访。高脂组在第8周时体重与正常组的差异可能来自高脂饮食的累积效应，且高脂组未添加乙醇，较少出现乙醇、乙醛肝功能损伤所致长疮等现象，体质较其他两组强。

       正常人的肝内脂肪含磷脂、甘油三酯、脂酸、胆固醇及胆固醇脂，脂肪肝的病理变化主要以甘油三酯堆积为主^[1,2,3,4,17]，因此，本研究将最具代表性的甘油三酯亚甲基TG(-CH2)脂类作为测量目标，主要测量¹H-MRS的X轴上1.3 ppm处的TG(-CH2)峰下面积并与水峰下面积比较。MRS显示甘油三酯在1.25 ppm处波峰下面积随病变程度相应增加，证明脂肪肝发生的主要是TG(-CH2)脂类的积聚。另一方面，中后期脂肪肝动物模型随着脂肪肝程度加重，¹H-MRS的X轴上0.9×10^-6的甲基峰、2.0×10^-6的羧基和位于2.8×10^-6的烯属基团出现谱线上抬和峰下面积有所增加，但仍明显低于TG(-CH2)(图5)，说明脂肪肝中后期虽然是以亚甲基团为主的四种基团共同作用，但仍是以甘油三酯亚甲基团的积聚增加为主，因此测定该处脂肪峰面积可以反映脂肪变程度。

       脂肪肝根据是否有过量酒精摄入，可分为ALD和NAFLD^[18]。本研究发现，无论哪种类型的脂肪肝，其RLC与肝脂变程度呈显著相关(r=0.923, P<0.01)，因此¹H-MRS比IP/OP对脂肪肝的诊断更敏感客观，尤其对于正常和轻度脂肪肝的分辨更具优势，但仅凭¹H-MRS的谱线变化和IP/OP的信号衰减并不能分辨是何种原因所致脂肪肝。Machann^[19]等对90名健康人进行¹H-MRS成像，也发现MRS在少量脂肪时作用更为显著，与本研究结论类似，这可能与生化代谢有关。另有报道称MRS可定量诊断含量最低达0.5%的肝内脂肪^[20]，尚待考证。此外，本研究还根据FI、RLC与病理结果的相关性计算出一元线性回归方程，并据此推出分别用RLC和FI指数估计肝内脂肪含量(FAT)的推测公式：FAT=(RLC-0.069)/0.838，FAT=(FI-0.380)/0.356。将扫描图像计算所得RLC及FI值代入公式内即可推测肝脂肪含量。同时，通过直接计算MRS的RLC指数可在如下范围内大致推测肝脂变程度：轻度(0.065~0.685)，中度(0.363~0.843)，重度(0.860~1.020)。

       在分析IP/OP和¹H-MRS诊断不同类型的脂肪肝中，我们发现：NAFLD的大鼠模型，其RLC和FI与病理的关系为rRLC=0.886，rFI=0.854，因此¹H-MRS和IP/OP诊断价值相近，而对于ALD的大鼠模型的诊断，¹H-MRS明显优于IP/OP(rRLC=0.95~0.96，rFI=0.54~0.65)，我们认为原因在于NAFLD模型饮食结构单纯，形成脂肪肝时间长，步骤缓，肝脂变病理改变较为单一；而ALD模型伴有更多肝硬化、肝纤维化、细胞水肿等，影响IP/OP的解剖细节显示，从而影响其信号测量准确度。而¹H-MRS是在分子水平上检测活体内目标质子浓度，目标单一，较少受到其他因素影响，故可以在根本上减少误诊的可能^[2,5,21]。

       IP和OP图像通过对比二者信号强度衰减来诊断脂肪肝，肉眼观察要求信号差异必须达到一定程度^[6]，因此当各级脂肪肝之间及脂肪肝与正常肝脏之间信号强度差别不大时鉴别困难^[7,8]。本研究采用FI指数客观计算信号丢失量来判断脂肪含量的多少，较肉眼观察更客观，可用于中度和重度脂肪肝的诊断，但仍不能区分正常与轻度、轻度与中度肝脂变。本研究表明，FI与肝脂变病理结果仅呈轻中度程度相关(r=0.576)，与Qayyum等^[9]得出用去相位序列诊断脂肪肝时，其与病理结果呈中等相关(r=0.690)结果类似。尽管与病理分级结果相关程度不高，但IP/OP可以快速、直观地观察估测脂肪肝的有无，并能提供解剖信息，弥补¹H-MRS坐标图不能显示解剖结构的不足，二者可互为补充。

       此外，正常肝内含有不超过5%的脂肪，¹H-MRS在3.0 T高场强MR机器上甚至能发现第0~4周至8~12周大鼠正常肝内CH2的轻微上升变化(图4)。范明霞等^[22]的研究由于受到MR场强(1.5 T)的限制，在1.25 ppm附近位置基本上见不到(-CH2)波峰，可能是因为MRS技术要求良好的外加主磁场和磁场均匀度要高。由此可以看出，3.0 T高场强MR能较1.5 T MR获得甘油三酯内目标氢质子共振频率上的微小差别信息^[2,3,4]。

       总之，酒精和高脂是脂肪肝的重要致病因素。IP/OP MRI可以初步对脂肪肝作出定性和简单半定量诊断。¹H-MRS更能准确地定量诊断脂肪肝，其价值优于IP/OP MRI，尤其适用于正常肝脏和脂肪含量较少的脂肪肝诊断。同时¹H-MRS对ALD的大鼠模型的脂肪肝诊断也要优于IP/OP MRI；但二者对NAFLD大鼠模型的脂肪肝诊断价值接近。因此，联合运用IP/OP与¹H-MRS分析CH2的变化，可进一步了解脂肪肝的病理代谢变化，其优势将会在越来越多的研究中得到验证。