细胞凋亡在维持组织细胞增殖平衡及器官功能方面具有重要的作用，许多疾病与细胞凋亡调节失常有关^[1]。肝脏是重要的代谢器官，细胞凋亡在诸多肝脏疾病及肝细胞损伤过程中发挥重要作用。磁共振成像技术已经广泛的应用于临床^[2]，活体氢质子磁共振波谱（in vivo proton magnetic resonance spectroscopy，in vivo ¹H-MRS）可以无创性地对生物体内代谢物进行定性及直接定量测定，目前已经用于检测某些弥漫性肝病的代谢物变化^{[3, 4]}，但使用¹H-MRS研究急性肝损伤及其细胞凋亡的研究并不多见。本研究在前期离体高场研究的基础上^[5]，通过药物诱导方法建立家兔急性肝损伤模型，并以临床1.5 T磁共振扫描机进行活体¹H-MRS检查，与病理结果相对照，探索¹H-MRS检测活体肝脏损伤中肝细胞凋亡的可行性。

1　材料与方法

1.1　肝脏急性损伤细胞凋亡模型制备

       随机选择健康新西兰大白兔27只，体重2.0~2.5 kg，实验组（17只）经腹腔注射浓度为10µmol/kg的亚硒酸钠（Na2SeO3），注射剂量为1 ml/kg；对照组（10只）注射剂量为1 ml/kg的生理盐水。注射后48 h进行MRI扫描，扫描前禁食6~8 h，以减少胃肠蠕动。扫描结束立刻经耳缘静脉注射空气牺牲动物并取得肝脏标本。实验动物由汕头大学动物实验中心提供。

1.2　数据采集

       采用GE 1.5 T Signa MRI扫描机及头颈线圈。实验兔取俯卧位并将其固定于线圈中央，以减少运动幅度并增加信号强度。所有实验均用3％戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉，必要情况下扫描过程中添加少量戊巴比妥钠以维持兔深麻醉状态。

       常规MRI检查作快速恢复自旋回波脉冲序列（fast recovery fast spin echo，FRFSE）T2加权（T2-weighted imaging，T2WI）横断面扫描，扫描参数：TR/TE ：3200/84.3 ms，视野（FOV）：16 cm×16 cm，激励次数（NEX） ：4。

       ¹H-MRS采用¹H PROBE-SV PRESS 35TE序列，在T2WI横断位图像定位（图1A），选取一个波谱兴趣区（region of interest，ROI），大小设为15.0 mm×15.0 mm×15.0 mm，尽可能避开大血管、胆道系统、脂肪组织等。使用高度选择性的饱和脉冲VSS(very selective saturation pulses)，在兴趣区上下、左右、前后等6个方向上添加饱和带以消除ROI内肝脏周围脂肪、空气和骨骼的影响。采集MRS数据前常规进行自动预扫描，包括自动匀场和抑水，扫描参数为TR/TE=1500/35 ms，扫描总次数2，激励次数2，要求线宽<18，抑水>90%，方可进行MRS数据采集。由于没有合适且稳定的内标，我们将未抑制水的水峰下面积作为内标。MRS检查时间6 min 54 s。

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图1  1A：T2WI横断解剖定位图；1B：活体肝脏¹H-MRS未抑水的谱线与抑水的谱线；1C：对照组与实验组的磁共振谱线
Fig 1  1A: T2-weighted axial anatomical location map; 1B: in vivo unsuppressed water spectra suppressed water spectra taken from the liver; 1C: ¹H-MRS of the control and treated group.

1.3　病理组织学检查和流式细胞检测

       磁共振检查，空气栓塞牺牲实验动物，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，对照扫描图像取与MRS的ROI基本相同位置的肝脏组织块，浸泡在10％甲醛溶液中固定24 h以上，常规石蜡包埋，将石蜡组织块进行连续5 μm切片，进行常规HE染色。

       另一部分大小约2~3 cm³的组织块放入平皿中内洗去血液，加入少量PBS缓冲液，用解剖剪刀将组织剪至匀浆状（约30 min），加入适量PBS缓冲液，然后用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中，后以300目尼龙网滤去细胞团块；离心沉淀1500 r/min，4～5 min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速(1000 r/min)离心沉淀去除细胞碎片，细胞用固定液固定，加入50μl TUNEL(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling)检测液，37℃避光孵育60 min，PBS洗涤2次，用250~500μl PBS悬浮，然后通过流式细胞仪进行检测细胞凋亡。

1.4　数据处理

       所有¹H-MRS数据以SAGE 7.0(GE Medical Systems，USA)软件后处理^[6]，分别得到各代谢物抑水和未抑水谱线及其波峰下面积。对于腹部器官来说没有适合的物质作为标准内标，所以我们采用未抑制的水峰下面积作为内标（图1B）。各代谢物的相对含量计算采用公式：Icontent＝(Imet/Iwater)×100%；Icontent是代谢物的相对含量，Imet为相应代谢物的波峰下面积，Iwater为水的波峰下面积。计算实验组和对照组中的tCho(3.22 ppm)、Lip(1.33 ppm)相对浓度及Cho/Lip比值，结果用均数±s表示，用双侧独立t检验比较两组间差别，P<0.05时差异具有统计学意义。

2　结果

       造模过程中，实验组2只动物死亡，可能与动物个体耐药性差异有关，共25只动物完成全部实验检测：实验组15只、对照组10只。实验组动物注射亚硒酸钠（Na2SeO3）后，出现不同程度的动作行为改变、水和食物的摄取量减少等，MRI检查及离体肝脏均可观察到肝脏肿大，大体标本见肝脏表面白色斑点，肝脏边缘较多。

       HE染色光镜结果显示：对照组肝小叶结构完整，无肝细胞变性坏死现象（图2A），48 h实验组切片，肝组织结构尚存，肝细胞肿胀、空泡变性，部分灶状坏死，可见肝细胞退变（图2B）。实验组进行TUNEL荧光染色后，流式细胞检查结果显示存在细胞凋亡现象（图2C、图2D），其检测结果显示实验组凋亡细胞百分数为(9.2±3.1)%，对照组凋亡细胞占(0.27±0.07)%，两组间存在显著差异(P<0.001)。

       T2WI序列能够较好地显示病变细节，因此选择T2WI图像作为¹H-MRS定位参考图像（图1A）。MRS检查结果中，根据所得频谱的基线平稳水平和主要代谢物波峰位置是否正确等条件，确定可分析的频谱谱线，最终得到10个对照组谱线（10/10），12个实验组谱线（12/15）。谱线一般有5个波峰可以确定（图1B）：①甲基峰(-CH3：0.9 ppm)；②亚甲基峰(-CH2-：1.3 ppm)；③谷氨酰胺和谷氨酸复合物(glx：2.10~2.49 ppm)；④胆碱复合物（tCho：3.22 ppm） ；⑤糖原和葡萄糖复合物（glyu：3.35~3.90 ppm）；但是前两种脂质峰在大多数谱线中结合在一起，分析时通称为脂质（Lip）。实验组与对照组的谱线对比如图1C。

       以双侧独立t检验比较实验组与对照组的脂质/水（Lip/Water）和胆碱复合物／水(tCho/Water)峰下面积比：实验组脂质含量（Lip）高于对照组(0.029±0.024(n=12) vs 0.014±0.007 (n=10)，P=0.033)（图3A），胆碱(tCho)含量低于对照组（0.001±0.0005 (n=12) vs 0.0030±0.0003 (n=10)，P=0.014)（图3B），tCho/Lip比值亦低于对照组（0.093±0.007 (n=12) vs 0.210±0.061(n=10)，P=0.027)。

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图2  2A：正常肝脏病理（HE×200）：肝细胞胞浆内无明显空泡形成及细胞肿胀；2B：实验组病理切片（HE×200）：肝组织结构完整，细胞肿胀，脂滴空泡形成，细胞坏死；2C、2D：对照组和实验组TUNEL荧光染色后流式细胞凋亡检测结果
Fig 2  2A: The pathological result of normal liver (HE stain, ×200). No lipid droplet vacuole was found in these images. 2B: The pathological result of treated liver (HE stain, ×200). Moderate cellular swelling and fatty degeneration accompanied by necrosis in rabbit liver can be found on histology. 2C, 2D: TUNEL fluorescence-activated cell sorting histogram from the control and treated sample.

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图3  3A：脂质（甲基及亚甲基）变化，^*P<0.05；3B：胆碱复合物的改变，^*P<0.05
Fig 3  3A: Changes in lipid methylene hydrogens and lipid methyl hydrogens (Lip), ^*P<0.05. 3B: Changes in choline-containing metabolites (Cho), ^*P<0.05.

3　讨论

       硒是动物体内所必需的微量元素，存在于体内各种组织和体液中，微量的硒具有抗氧化功能，大量积聚则产生毒性作用^[7]，亚硒酸盐与还原型谷胱甘肽反应产生活性氧，随着硒浓度增高，反应更加剧烈，毒性也逐渐增强，使组织处于氧化应激状态；进一步研究证实，亚硒酸钠可通过氧化作用诱导离体及活体细胞凋亡^[8]，我们前期离体高场研究同样证实高剂量亚硒酸钠能够造成肝损害并诱导肝细胞凋亡^[5]。本研究采用1.5 T临床磁共振扫描仪对兔肝脏进行活体¹H-MRS检测，分析在高剂量亚硒酸钠诱导的肝损伤中Lip及tCho等代谢物的变化情况。在实验过程中，2只实验组动物非正常死亡，可能与实验初期对亚硒酸钠剂量以及模型动物的麻醉剂量经验不足有关。

       ¹H-MRS可用来检测活体肝内多种代谢物，各代谢物在肝脏中有各自的含量和意义，如：脂质(Lip)、胆碱（tCho）、谷氨酸（Glu）和谷胺酰胺（Gln） (Glx)、糖原及葡萄糖复合物（Glyu）等，根据这些代谢物含量的多少和化学位移情况，可分析肝脏的代谢改变。研究显示，采用PRESS 35序列检测肝组织中代谢物的含量，结果是位于2.10~2.49 ppm处的Glx含量最低。但是在发生病变的肝组织中，这种转化系统是被抑制的^[9]，在本实验结果中，Glx表现多重波峰、宽波，波峰值存在很大差异。此外，Glyu的出现率低，这和肝脏参与糖原的合成和分解有关，检查时饥饱状态不同导致肝脏中葡萄糖的含量不一，从而致使Glyu在¹H-MRS上表现为或有或无，或高或低，其在疾病发展中的重要作用有待于进一步研究^[10]。因此我们没有统计Glx和Glyu的含量。

       胆碱复合物为重要的细胞膜代谢产物，包含胆碱、磷脂酰胆碱、甘油三磷脂酰胆碱、牛磺酸等多种成分^[11]，在¹H-MRS中以tCho(3.22 ppm)峰值或曲线下面积反应其含量，1.5 T磁共振采集的¹H-MRS曲线中这些代谢物难以分辨。胆碱复合物峰下面面积的增大可能与细胞膜磷脂的生物合成增加有关^[12]，并且是细胞增殖指数的指标^[13]，而且亚硒酸钠不管在体内还是体外都被证实能抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡^[14]，实验所测的tCho降低可能是亚硒酸钠所诱导正常肝细胞凋亡和坏死和／或细胞增殖被抑制的结果。这与一些文献的研究结果是一致的^{[5, 15]}。

       许多离体和活体MRS研究证明^{[16, 17]}，凋亡的细胞中，最显著的变化是胞浆内出现了脂质小滴，这时以1.1~1.5 ppm处Lip中亚甲基(-CH2-)信号增高。据我们所了解，采用¹H-MRS技术研究急性肝损伤中脂质变化的文献很少，本实验观察到肝脏损伤中脂质信号明显增高，这一现象可能有几种解释：第一，肝细胞在凋亡过程中细胞内可检测到的脂质明显增加^[16]，通过流式细胞TUNEL荧光染色检测，实验组动物肝脏中有明显的凋亡存在；第二，肝脏毒性反应过程中的肝细胞坏死，导致磁共振可检测的脂质集聚，从而使脂质信号增高^[17]，本实验中组织学观察到少量的坏死细胞存在；第三，肝细胞的增殖抑制导致脂质升高，肝细胞是非常活跃的，而增生活跃的组织中由于中性脂质的集聚增加了脂质的活动性^{[18, 19]}，脂质的信号增高。同样，细胞在细胞周期的G2期所含脂质明显增高^[19]，而高剂量的亚硒酸钠可将肝细胞瘤HepG2细胞周围阻滞在G2/M期^[20]，组织学检查可见实验组动物肝细胞内有脂质集聚现象，这是由于细胞凋亡还是细胞增殖阻滞导致的，还需要进一步的检测来区分这两种代谢。

       Towner等^[21]发现在节球藻毒素（Nodularin）诱导大白鼠（Sprague-Dawley rats）急性肝中毒模型的7.0 T MRS(Varian INOVA UNITY)显示，Lip峰是降低的，这与本实验的研究结果有一定差别。对于这种现象的出现可能有几种解释，这两个实验中所使用的诱导肝细胞损伤的药物及其作用机制、时间不同，而其不同的毒性机制及时间导致肝细胞损伤方式及损坏程度不同。同时不同程度的自由铁离子释放改变弛豫时间^[22]，不同程度地影响信号强度。此外，不同的实验动物模型及不同场强的机器可能造成的检测结果差异。同时，本实验还发现实验组的tCho/Lip峰下面积比值较对照组明显降低，可以进一步证明高浓度亚硒酸盐对肝脏代谢产生明显影响^[23]。

       本研究中，实验动物的差异及呼吸等因素，可能导致肝脏中体素的放置方位及信号采集有一定的差异，由于该动物模型是弥漫性肝损伤，较小的体素放置差异是可接受的；另外，由于所选体素过小且场强较低等原因，肝脏内其他代谢产物（如谷氨酰胺类等）波峰相互之间重叠，难以区分，还有一些波峰难以确定，这是1.5 T磁共振机共有的缺陷。取肝脏组织做病理学检测时，动物肝脏位置可能发生变化，可能是所取组织与单体素放置区有一定差异，在肝实质弥漫性改变的情况下，这些差异应该是可以接受的。虽然急性肝损伤中凋亡是主要的细胞死亡形式^[24]，本实验组织学检查可见少量坏死细胞，目前磁共振频谱还不能进一步将细胞凋亡和坏死信号分开。

       临床1.5 T核磁共振机对急性肝损伤代谢物进行MRS检测是可行的，实验组和对照组活体肝脏磁共振频谱有差异，肝脏脂质（Lip）和胆碱复合物(tCho)具有一定特征性变化。我们对活体急性肝损伤动物模型的肝脏脂质（Lip）和胆碱复合物(tCho)初步研究分析可能有助于更好地理解高剂量亚硒酸盐亚硒酸盐诱导动物肝脏损伤及肝细胞凋亡的代谢活动。但是，其准确性和可重复性还需深入研究。