尖晶石结构的γ-Fe2O3或反尖晶石结构的Fe3O4具有顺磁性，按晶粒粒径大小又细分为小粒子氧化铁纳米粒子(SPIO:水动力学粒径大致在40~180 nm)及超小粒子氧化铁纳米粒子（USPIO：水动力学粒径小于40nm）^[1,2,3]。USPIO在室温下可表现出超顺磁性，即在外磁场下受磁化而具有磁性，而当外磁场强度为零时其剩磁为零或极小。超顺磁性粒子极低的剩磁使其避免聚集，在溶剂里可以稳定分散。超顺磁性氧化铁纳米晶粒具有高的磁化率，容易被外磁场控制^[1,2,3]。

       氧化铁晶粒通过表面化学修饰成为具有良好生物相容性的粒子，也可以进一步结合特殊的抗体、氨基酸、蛋白或酶而具有吸收特异性。氧化铁纳米粒子被细胞吸收后聚集于溶酶体中，在溶酶体中低的pH环境里，氧化铁被分解成为铁离子，可用于合成血红蛋白，因而氧化铁在体内具有低的毒性^[1]。氧化铁纳米粒子进入脑内后，也没有发现直接的毒性作用^[1]。然而，氧化铁纳米粒子会在脑内保留相当长的时间，如颅内直接注入的氧化铁纳米粒子会在脑实质中存在三个月以上，虽然未引起任何病理现象，但其长期清除的机理尚须进一步研究^[1]。氧化铁纳米粒子被用于体内(in vivo)和体外(in vitro)生物医学研究，如磁共振成像（MRI，fMRI）^[1,2,3,4,5]、细胞分离与标记^[6,7,8,9]、DNA分离^[10]、肿瘤的检测^{[11,12,13,14]}、磁热治疗^[15]及靶向药物载体^{[16,17,18,19]}等，是纳米材料研究的热点，Nel等^[20]对纳米粒子与生物系统之间的界面处的生物物理化学方面的相互作用作了专题综述。

1　超顺磁性氧化铁纳米粒子合成工艺及常用修饰剂

       常用的氧化铁纳米粒子修饰剂有葡聚糖及其衍生物^[5]、聚乙二醇及其衍生物^[12]等高分子，柠檬酸^[6]、四甲基氢氧化胺^[21]等小分子，及SiO2、CdS、Au、Pt等无机物^[22]。作为对比增强剂，氧化铁粒子的尺寸及表面修饰物的物理化学性质决定了其被生物体内吞噬细胞吸收的几率，也就决定了其分布的特异性或选择性。一旦纳米粒子进入血液，血浆蛋白对纳米粒子产生非特异性吸附，被吸附的纳米粒子很快被吞噬细胞清除。葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等有机物有避免血浆蛋白吸附的功能，从而使氧化铁纳米粒子具有长的血液半衰期。特殊表面修饰的超细氧化铁纳米粒子（USPIO）能够较长时间保留在血液中进行循环，可用于细胞及分子示踪、血管及血容量成像的对比增强研究^[4]。

       常用的氧化铁纳米粒子合成方法有共沉淀法、微乳液法、超声空化法等^[22]。共沉淀法是将摩尔比2∶1的Fe³⁺与Fe²⁺盐在水溶液中同时水解沉淀，或Fe²⁺盐在氧化剂存在条件下部分氧化沉淀实现Fe3O4纳米粒子的合成^[21]。共沉淀法具有方法简单、成本低廉的优点。但是共沉淀方法存在粒度分布宽、易团聚的缺点，而且由于氧化铁与水之间反应较为复杂，可生成多种化合物^[22]，因此产物中常混入其它相杂质，而不能充分发挥纳米氧化铁在生物体系中的作用。经过改进的微乳液法及超声空化法制备的纳米氧化铁，普遍存在结晶度差、磁性能低，及其粒度、形貌难以控制的缺点^[22]。目前商业化的氧化铁纳米粒子如Resovist、Feridex、Endorem、Combidex及Sinerem等的产品都是由共沉淀方法制备的^[1]，性能还有提升的空间。

       采用铁的羰基化合物制备氧化铁纳米粒子是近年来发展的一个成功的合成方法^{[23,24,25,26]}。Sun等将乙酰丙酮铁Fe(acac)3与油胺溶于二苯醚中后，300 ℃加热反应1 h生成粒径小于20 nm的Fe3O4纳米晶体^[23]。Cheon等将五羰基铁溶于邻二氯苯中，以十二胺为表面稳定剂在180 ℃空气气氛中加热可制备10 nm左右的γ-Fe2O3纳米晶体^[24]；这类方法得到的氧化铁纳米晶体，表面修饰有长烷基链或其它所使用的有机溶剂小分子，只能溶解或分散于非极性或弱极性的有机溶剂中，不能在单个微粒尺度上被用于生物医学领域，必须通过修饰体置换才可以使氧化铁纳米粒子表面具有亲水性。更简便地合成能够直接在水中稳定分散的、具有生物相容性的磁性氧化铁纳米粒子的研究仍在继续^[25,26]。

       我们在实验室中，采用文献报道的方法^[25]，将2 mmol乙酰丙酮铁Fe(acac)3在20 ml三乙二醇中280 ℃通氩气保护加热2 h还原反应制备了能够在水中稳定分散的纳米Fe3O4。其透射电子显微镜像见图1，平均粒径为9.6±1.4 nm，图1中纳米粒子的磁滞回线的剩磁和矫顽力都为零。表明所合成的纳米Fe3O4粒子具有超顺磁性，饱和磁化强度为58 emu/g。

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图1  Fe3O4超顺磁性纳米粒子的TEM照片及其磁滞回线
Fig 1  The TEM image and M-H curve of the Fe3O4 superparamagnetic nanoparticles

2　MRI、fMRI基本原理

2.1　成像原理及表征参数

       自旋的带电粒子（如质子）会产生电磁场，质子数为奇数的原子核（如氢原子核）中未配对的质子会产生一个净磁场，处于外磁场（B0）中时，在常温下，它们自身的净磁场大部分会沿外磁场方向排列。当对病人（或被试动物、或样品）发射一个特定频率的90°射频脉冲，这个射频脉冲的磁场(B1)的作用会导致一些自旋质子改变它们的排列方向。关闭射频脉冲后，这些质子发生弛豫，即自旋减小到它们的最低能态或返回到平衡状态，质子会重新沿外磁场（B0）的轴向排列，并且以电磁波的形式放出多余的能量，发出的电磁波信号，就是要检测的磁共振信号，电磁波信号由接受线圈转换为电流。弛豫过程中，质子重新回到纵轴(Z轴即外磁场方向)原磁化矢量63%所需要的时间称为纵向弛豫时间T1；而在横向（XY平面内）的质子自旋磁场矢量衰减到原横向磁化矢量的37％所需的时间称为横向弛豫时间T2；不同组织具有不同的T1及T2(也即弛豫中质子发射不同强弱的电磁波信号)，这是磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）的成像及区分不同组织的原理。由于质子间自旋-自旋相互作用（这个相互作用反映物质的特性）引起的质子自旋的失相，造成T2不等于T1，T2的衰减速度通常要比T1的恢复速度快5~10倍。由质子之间的自旋-自旋相互作用及外磁场不均匀性共同作用带来的失相得到的横向弛豫时间称为T2^* ，T2^*显著短于T2。脑的不同状态，如兴奋引起的代谢增加导致脱氧血红蛋白（顺磁性物质，而氧合血红蛋白为抗磁性物质）的增加，及随后的血液过补偿造成的血液密度或血液量的变化都将引起T1及T2的变化，从而产生不同的亮或暗衬度。对于脑来说，在特定的时间内，接受外界的刺激后的工作区域的磁共振成像方法被称为功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging, fMRI），不接受外界刺激的脑功能磁共振成像被称为静息态脑功能磁共振成像。鉴于氢质子的普遍丰富性，MRI、fMRI中选用氢质子进行磁共振成像，不同组织中含氢原子量不同或氢原子化学环境不同，使氢质子产生不同自旋性能，造成各类组织具有不同的T1及T2值，在磁共振成像中表现出不同明暗的衬度，这就是磁共振生物体成像的基本依据^{[27,28,29,30]}。实验中采用不同的脉冲(RF)序列，可以得到不同的T1、T2或T2^*权重像，以寻求最佳衬度的磁共振像，能够更好反映测试物内部组织结构。

       在成像速度和空间分辨率方面，MRI已经超越了正电子断层扫描技术(positron emission tomography, PET)。美国的食品和药物监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)已经批准在临床使用3T和4T的MRI系统，在实验室研究阶段，已经允许使用10T的系统对人体做实验^[28]。MRI的进展得益于高场强及脉冲序列的优化，高场强MRI空间分辨率目前可以达到面上300 μm×300 μm^[29]。

2.2　氧化铁粒子与磁共振成像的结合

       在外磁场作用下，磁性粒子被磁化，具有磁通量，并在其局部产生一个诱导磁场，这个诱导磁场影响水或组织中氢质子自旋的弛豫过程，导致质子横向弛豫时间T2缩短，也导致T1缩短，在高场强下，T2权重像效果（变暗）明显；而T1权重像（变亮）适合在中等场强（如1.5 T）及较低氧化铁浓度的条件下获得^[1,31]。磁性粒子通过增加衬度而提高磁共振像分辨率^[32]。因为MRI具有高的空间及时间分辨率，有定量化的潜能及非侵入性的优点，超顺磁性氧化铁纳米粒子作为对比剂与之结合具有广阔的应用前景。

3　氧化铁对比剂在脑科学相关的磁共振成像研究中的应用

3.1　早期病理症状的诊断

       依赖于粒子的大小及表面修饰物的性质，磁性粒子在体内会被吞噬细胞特异性地或非特异性的吸收或吸附^[1]。多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是人类神经系统的自身免疫性脱髓鞘性疾病，实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis, EAE），是研究人类MS的理想动物模型。在EAE动物模型病变的实验中，采用尾静脉注射将USPIO (Sinerem产品，氧化铁纳米粒子4~6纳米，粒子表面修饰以葡聚糖，流体力学粒径为30纳米，用作血池成像对比剂^[32])试剂注入大鼠^[33]，若干小时后（该类磁性氧化铁纳米粒子具有长的血液半衰期^[32]，只有经过长时间后才能检测出吞噬细胞所吸收到的量）进行磁共振成像监测发现：USPIO在炎症部位聚集，推测USPIO可能是被血液中的单核或巨噬细胞所吞噬，随吞噬细胞到达炎症部位的。USPIO的磁场效应缩短炎症周围氢质子的T2，从而对炎症病变有（变暗）对比增强作用。其对比增强位置与随后的组织解剖及病理学检查显示的炎症细胞浸润范围一致。USPIO对比异常强化的范围反映巨噬细胞的浸润程度，这可作为脱髓鞘病变定位或严重程度的参考。而用钆(Gd)对比剂的磁共振成像中未发现EAE大鼠脑内异常增强灶。目前临床普遍采用的Gd对比剂是一种细胞外间隙磁共振小分子成像对比剂，在中枢神经系统主要反映血脑屏障的破坏，而在EAE模型中巨噬细胞浸润和血脑屏障的破坏是疾病的不同先后阶段，这可能是Gd对比剂未能检测出病理早期症状的原因^[33]。USPIO可以缓慢地以渗漏方式通过血脑屏障，但其机理尚不明确^[1]。USPIO也可能借助于血液中单核或巨噬细胞穿过血脑屏障，到达大鼠脑内炎症或损伤部位^[1,33]，从而可以检测MS的亚临床病变。USPIO被脑实质细胞吸收后，在脑内可存在于细胞内，也可以存在于细胞间隙^[1]。

       血管内皮细胞粘附分子（VCAM-1）及其配体α4β1整联蛋白是调节白细胞募集及引起机体损伤效应的关键因素。通过选择合适抑制剂，能够与α4β1连接而阻止其与VCAM-1相互作用，就可以明显减少MS的复发率。检测到首先出现的VCAM-1并提前采取措施可以中止或减轻随后MS的各种损伤性病症。因此，目前迫切需要一种分子影像技术来更早地发现并量化该疾病的活动性，以指导治疗方案。采用连接鼠VCAM-1的单克隆抗体（克隆M/K2）的平均粒径约1μm量级的磁性氧化铁粒子（该研究采用的微米级的磁性粒子具有很好的对比增强效果，但难以生物降解而不能用于人体内实验），通过尾部静脉注射入大鼠体内^[34]。大鼠脑内左侧纹状体区被预先注射白细胞介素(IL-1β)来诱引内皮细胞活化并表达VCAM-1分子，采用7T的MRI观察发现，联接VCAM-1单克隆抗体的磁性粒子在注射IL-1β的脑一侧产生强的对比变暗效果。而在未注射IL-1β一侧脑没有相应的对比效果。这就开发了一种新型的分子影像探针技术，结合磁共振成像技术可以活体(in vivo)识别大鼠脑内的VCAM-1表达，并可进行定量化。在病理上还不能检测出MS明显损害性症状的时候，采用MRI就可以探测急性脑炎的VCAM-1，来早期诊断并观察MS疾病的发展程度，并采取相应的治疗。可通过改变磁性氧化铁粒子的表面修饰配体，来对其它炎症、癌症、粥状动脉硬化症等病症中所特异表达的内皮细胞标记物进行磁共振成像^[34]。该研究中采用的表面修饰以对甲苯磺酰基的0.76~1.63μm的磁性氧化铁粒子具有含铁量高，磁场效应强因而对比增强范围大（这个范围一般约为磁性粒子粒径的50倍），及更易表现特异性吸附的特点。

3.2　药物输运及探测

       药物输运是纳米粒子一个重要应用。由静脉注射后，纳米粒子需要通过血脑屏障才能进入脑。血脑屏障是阻止某些物质（多半是有害的）由血液进入脑组织的结构，是由特殊的血管系统，包含无窗孔的内皮细胞、毛细血管基膜及星型胶质细胞组成。血脑屏障细胞间的紧密结合阻止了血液中的病原体及化学物质进入脑，但也阻止了药物的通透。在一些疾病情况下，如神经退行性疾病或脑肿瘤，血脑屏障会发生变化，打开一些窗口，成为药物输运通道。药物也可以利用神经系统与嗅觉系统之间的连接路径来进入脑。颈部注射甘露醇、动脉或静脉注射缓激肽等物质、超声震荡方法也可以暂时性地打开血脑屏障^[18,35]。药物穿过血脑屏障的途径可采取跨细胞扩散、细胞间扩散、受体介导的跨细胞转运、吸附介导的转运及载体介导的转运等方式^[36]。载体介导途径的载体包括脂质体、聚合物纳米粒子及无机纳米粒子，这些载体表面修饰物的物理-化学性质对于穿过血脑屏障及药物输运起着关键作用。目前的研究结果表明，药物穿越血脑屏障输送至中枢神经系统是一项极其复杂的技术，需要多种学科的紧密合作共同努力才有望完成^[36]。

       即使进入到脑内，纳米粒子被细胞的吸收效率还受其表面的修饰剂的性能影响。葡聚糖是USPIO最常用的修饰剂。脑源性细胞对葡聚糖修饰的USPIO(Endorem产品，水动力学粒径80~150 nm)吸收少且慢，因此葡聚糖修饰的USPIO适合脑成像，而不适合器官或细胞内药物输运^[37]。

       通过in vitro细胞实验发现，与葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、羧基化的PVA及硫醇基化的PVA相比，胺基PVA修饰的USPIO更容易被脑源性内皮细胞和小型胶质细胞吸收，被吸收后扩散到脑软组织，其携带药物被释放出来。实验发现这类磁性纳米粒子不会引起细胞的炎症反应，即对脑器官是生物相容的。将USPIO与Cy3.5或Cy5.5荧光体结合，然后进行的荧光分析表明，USPIO是被小型胶质细胞胞内吸附的。胺基PVA修饰的USPIO，可作为生物相容性的，有潜力的脑内药物载体，与MRI相结合后，也可同时用于探测表现异常吞噬的神经退行性疾病病变区域^[37]。

3.3　检测mRNA

       Liu等^[38]将葡聚糖修饰的超顺磁性氧化铁纳米粒子USPIO，连接三类序列的磷硫酰化寡聚脱氧核苷酸（sODNs），这三类序列的sODNs分别与c-fos mRNA、β-actin mRNA，或随机序列的sODN成互补关系，分别简称做USPIO-cfos、USPIO-β-actin及USPIO-Ran。通过脑室灌注将上述磁性纳米粒子复合体直接注入大鼠的脑室，避开了血脑屏障的阻碍作用。在动物脑缺血实验中，采用9.4 T的MRI观察发现，USPIO-cfos明显地驻留在脑内c-fos mRNA有增量的部位，而c-fos mRNA的增量是缺血损伤反应的结果。对于USPIO-β-actin及USPIO-Ran没有观察到这个驻留效应。这项研究表明可用结合USPIO的MRI探测中枢神经系统病理模型中的mRNA的改变。

       已知短时记忆（工作记忆）涉及蛋白质的共价化学修饰和突触蛋白输运；长久记忆则依赖基因转录（如与突触可塑性相关的即刻早期基因的转录）、蛋白质合成和新突触连接的形成。因此在MRI中，用USPIO探针检测即刻早期基因（如c-fos）转录的mRNA及其它与神经系统发育和分化相关的基因转录的mRNA，可能成为研究记忆的神经机制的新途径。

3.4　细胞及分子的磁共振成像

       Lee等^[39]采用将荧光染料与磁性氧化铁纳米粒子结合在一起形成新一代的纳米探针，具有荧光效应及磁共振成像对比剂功能。他们利用Sulfo-SMCC(C16H17N2NaO9S)上的顺丁烯二酰亚胺集团，先与掺杂了罗丹明荧光染料的二氧化硅纳米粒子表面的胺基结合，再与二巯基丁二酸修饰（通过与表面油酸置换获得）的磁性氧化铁纳米粒子表面的硫醇基结合，获得了一种复合纳米粒子，并通过复合纳米粒子表面的Sulfo-SMCC与HmenB1抗体结合。HmenB1对表达聚唾液酸(PSAs)的细胞具有特殊的靶向性。PSAs是与神经传导途径、突触的可塑性、学习记忆相关的聚合物，同时PSAs也是成神经细胞瘤细胞（CHP-134）的表达物，也即标记物。用结合了HmenB1抗体的复合纳米粒子与过度表达PSAs的CHP-134细胞混合，清洗后检验两者结合情况，与对比实验相比，表达PSAs的CHP-134细胞可观察到T2^*权重的GE(Gradient Echo)序列的磁共振像中明显的负增强（变暗）效果。更重要的是，采用共聚焦显微镜观察复合纳米粒子发出的红色荧光发现，PSAs存在于CHP-134细胞膜位置处，这与其它研究方法所推测的PSAs表达在神经细胞膜上的神经细胞粘附分子(NCAMs)上结论一致。因此，荧光磁性复合纳米粒子既能进行细胞或分子磁共振成像，又能给出亚细胞尺度信息。

       目前认为突触可塑性是学习和记忆的可能的分子机制，而PSAs通过改变神经系统的神经粘附分子的粘附性调节神经细胞发育、神经导向以及突触的形成。靶向PSAs的荧光-磁性复合纳米粒子有望用于学习和记忆的神经机制的研究。

3.5　神经系统血液动力学变化的功能磁共振成像（fMRI）

       血液中脱氧血红蛋白为顺磁性物质，在磁共振成像中可缩短氢质子的T2^*。在脑的活跃区中，表现出增量的血流，对该区域氧的消耗产生过补偿，这个过补偿局部地减少了该区域的脱氧血红蛋白浓度，导致T2^*延长，在GE序列的磁共振成像中该区信号增加（变亮），从而形成血氧依赖水平(BOLD)产生的对比度图像^[2,29,32]。采用fMRI测量神经活动引起的血液动力学变化，是一项对90年代以来的认知神经科学研究发展真正有影响的技术^[29]。

       然而，生理变化产生脱氧血红蛋白含量的改变产生的T2^*效果很小，导致这种测试方法灵敏度不高。顺磁性对比剂，如临床常用的Gd对比剂也被用来监测活跃条件下脑血容量（cerebral blood volume, CBV）变化，可以使磁共振信号对比度增加，但是由于再循环过程及血清对Gd对比剂的清除，在每一个激活或静息条件下，人们只能检测注射后"头道"流过过程。这极大地限制了对试验目标的研究次数。在这种背景下，由于USPIO对比剂具有相当长的血液半衰期（可达几小时或更长），在整个研究过程的血流中能够保持一个足够高的、稳定的浓度，可操作出稳定的磁共振图像。在中等场强下，磁性氧化铁对比剂在脑血容量变化中改变磁共振信号的幅度，大大超过BOLD方法观察到的磁共振幅度的变化。USPIO对比剂的T2权重像（变暗）与BOLD血氧浓度增加产生的对比效果（变亮）相反，但同样反映血液动力学变化，且产生的信号对比度更大，与BOLD对比效果相比较，USPIO对比剂探测CBV的灵敏度增加2~12倍^[32]。

       例如，用运动或静止的视觉刺激（屏幕上随机出现的亮点或线），观察在恒河猴脑中产生的fMRI信号，研究灵长类视觉传导通路与大脑皮层视觉区位置的关系。发现脑区V2，V3，MT/V5，vMST，FST，VIP，PEF对运动点敏感，而V4，TE，LIP及PIP对随机线信号敏感。注射葡聚糖修饰的、具有长血液半衰期的USPIO对比剂后，MT/V5区信号灵敏度比BOLD技术提高了10倍左右^[40,41]。

       fMRI衡量的是群体神经元活动的信号，它是一个能够与局部电生理学测量互补的，最有价值的成像方法^[29,41,42]。结合磁性纳米粒子可在血液中长时间稳定及其增加分辨率的特性，进行神经活动成像，促进了fMRI技术的进展^[2,32,40,42]。

4　展望

       理解人脑的工作机制，是21世纪最具挑战性的研究课题。如何使药物穿过血脑屏障进入大脑也是治疗神经疾病如阿尔茨海默、帕金森病、中风及恶性脑瘤（这些疾病中未破坏或未完全破坏的血脑屏障使药物无法进入病灶）中最需解决的课题之一。结合磁性氧化铁纳米粒子的脑磁共振成像技术，是脑病理学及药理学研究、学习与记忆的机制的研究的新手段。从生物医学角度来讲，目前需要采用更为先进的纳米制备工艺（而不局限于共沉淀方法）获得不同粒度磁性氧化铁纳米粒子，并表面修饰以不同性质的功能性有机分子，系统研究磁性氧化铁纳米粒子与脑组织之间作用，对于纳米材料应用、脑疾病及脑科学，包括认知神经科学研究都具有重要意义；从化学工作角度出发，控制磁性氧化铁粒度、分散性、结晶性，调节表面修饰物性质，开发荧光-磁性等多种性能复合的纳米粒子，掌握磁性粒子与生物分子、细胞及生物组织之间的相互作用，仍需要进行深入地研究，以满足生物医学应用提出的更高、更特殊的需求。无机及有机化学、纳米材料、物理、生物医学等学科的交叉研究对各学科有相互促进的作用，并有望带来重大的突破。