从组织或细胞中提取代谢物用于频谱检测是离体MRS研究的常用方法，从一定量的样本中高效获取足够提取物是频谱研究的前提。本研究对高场频谱研究中常用的代谢物提取方法进行比较，综合分析不同方法的提取效率及9.4 T MRS对水溶性及脂溶性提取物检测敏感性的差异，以此对高场MRS研究中代谢物提取方法的选择进行一定的优化。

1　材料与方法

1.1　人脐带间充质干细胞的获取

       人脐带间充质干细胞来自于胎儿脐带的华尔通氏胶组织，利用组织块贴壁法进行培养，经原代及传代培养后可得到纯度达95％以上的间充质干细胞。本研究所用细胞均为第四代。

1.2　代谢物的提取

1.2.1　高氯酸提取水溶性代谢物

       每个样本细胞数量为1.0×10⁷。吸净培养瓶中的培养液，用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)冲洗2次，用细胞刮棒刮取细胞后移入离心管配平离心（条件1500 rpm, 5 min），弃去上清液收集细胞沉淀。细胞沉淀加入浓度为12％冰冻的高氯酸3 ml，冰浴中进行超声波碎裂5 min，碎裂后将混合液置高速离心机离心以除去细胞碎片，离心环境0 ℃、13000 rpm，时间为20 min。离心后分离上清液，上清液中加入1 mmol/L的氢氧化钾溶液进行中和，调整pH至7.2，中和所产生的沉淀再次高速离心去除，条件同上。离心后上清液置于低压冻干机内冻干，样本干燥后置-20 ℃冰箱保存。

1.2.2　甲醇／氯仿提取脂溶性代谢物

       每个样本细胞数量约为1.5×10⁶，细胞收集方法同上。细胞沉淀加入1∶2(v/v)冰冻的甲醇和氯仿3 ml，涡旋震荡1 min，再加入0.5 ml的生理盐水，再次震荡。震荡后混合液置4 ℃静置24 h，静置后混合液分层，下层液为氯仿层，其内含脂溶性代谢物，分离后置离心管用高纯氮气吹干，样本干燥后置-20 ℃冰箱保存。

1.2.3　甲醇／氯仿／水一次性提取水溶性及脂溶性代谢物

       每个样本的细胞数量约为1.0×10⁷，细胞收集方法同上。细胞沉淀先加入2∶1(v/v)的甲醇和氯仿1.5 ml，冰浴中进行超声波碎裂5 min，再加入1∶2 (v/v)氯仿和双蒸水1.5 ml，震荡混匀。将混合液置离心机离心，离心环境0 ℃、13000 rpm，时间为20 min。离心后溶液分层，其中上层液为甲醇和水的混合物，其内含水溶性代谢物，下层为氯仿层，其内含脂溶性代谢物。用微量取样器小心分离两层液体，上层液置于低压冻干机冻干，下层液用高纯氮气吹干。样本干燥后置-20 ℃冰箱保存。

1.3　代谢物的9.4 T MRS检测

       用精密微量天平称量并记录不同方法所提取的细胞代谢物干重（mg），其中水溶性部分溶解于0.5 ml含有一定量内标为三甲基硅烷丙酸钠(3-trimethylsilyl propionic acid-d4 sodium salt, TMSP)的重水，脂溶性部分溶解于0.5 ml含内标为四甲基硅烷（tetramethylsilane, TMS）的氘代氯仿，充分溶解后分别移入直径为5 mm的核磁测试管中，置于Burker 9.4 T (400 MHz, Bruker Avance, Switzerland)核磁共振仪检测探头内。频谱采集参数为：含抑水脉冲的zgpr序列，机器自动匀场，带宽为5 kHz，扫描次数为32次，数据采集点为4096。分别获取水溶性及脂溶性提取物的氢质子频谱原始数据，经傅里叶转换，基线及相位校正后得到频谱图像输出。将频谱数据输入微机，应用Bruker自带的频谱后处理软件Mestrec 4.7对谱线中主要代谢物的化学位移进行定位。

1.4　统计学处理

       每种方法样本数为12个，提取物干重（mg）以±s表示。PCA（水溶性）和M/C（脂溶性）法所得提取物干重分别与DPE法所得相应部分进行配对资料的t-检验，数据分析采用SPSS 17.0软件包，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　人脐带间充质干细胞的频谱代谢特征

       人脐带间充质干细胞的水溶性提取物频谱中主要代谢峰有乳酸、醋酸、谷氨酸、苏氨酸、肌酸、肌醇及胆碱复合物等；脂溶性代谢提取物频谱中主要代谢峰为饱和及不饱和脂肪酸类等，特征谱线分别如图1、图2示。

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图1  人脐带间充质干细胞水溶性提取物频谱特征。提取物分别来自于PCA和DPE法的水溶性部分
Fig 1  Water-soluble metabolite profile of the human umbilical cord mesenchymal stem cells. Cell extractions were prepared by PCA and DPE method.

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图2  人脐带间充质干细胞脂溶性提取物频谱特征。提取物分别来自于M/C和DPE法的脂溶性部分
Fig 2  Lipid-soluble metabolite profile of the human umbilical cord mesenchymal stem cells. Cell extractions were prepared by M/C and DPE method.

2.2　不同方法提取物产量

       PCA与M/C法所得提取物的干重分别与DPE法的水溶性及脂溶性部分配对比较。PCA与DPE法使用的细胞数量为1.0×10⁷，M/C法使用的细胞数量为1.5×10⁶，PCA所得水溶性提取物干重(9.64±0.65 mg)与DPE法的水溶性部分干重（2.95±0.35 mg）之间存在显著性差异（P<0.001），M/C所得脂溶性提取物干重(2.52±0.30 mg)与DPE法的脂溶性部分干重(2.83±0.43 mg)之间无显著性差异(P>0.05)，然而考虑到所使用细胞数量的显著差异，M/C法仍是提取脂溶性代谢物的高效方法（图3）。

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图3  不同方法所得提取物产量。提取物分别由高氯酸(PCA)、甲醇／氯仿（M/C）和甲醇／氯仿／水（DPE）法获得；**：P<0.001
Fig 3  Extraction yields of different methods. Metabolites were extracted by PCA, M/C and DPE methods. **: P<0.001

2.3　9.4 T MRS对水溶性及脂溶性提取物检测的敏感性

       称取不同干重的水溶性和脂溶性提取物进行频谱检测，方法同1.3，以能获得清晰明显的代谢峰及平滑的基线作为评价谱线的质量的简易标准。在脂溶性提取物谱线中，不足1 mg的提取物就可以得到平滑的基线及数个明显的代谢峰，而在水溶性提取物谱线中，约6 mg的提取物才可以得到良好的谱线质量（图4、图5）。

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图4  不同干重的脂溶性提取物谱线。所检测提取物分别为：a：0.7 mg，b：1.5 mg，c：3.0 mg
Fig 4  Spectra of the lipid-soluble metabolite extraction of different net weights for detection. a: 0.7 mg, b: 1.5 mg, c: 3.0 mg

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图5  不同干重的水溶性提取物谱线。所检测提取物分别为：a：1.4 mg，b：3.2 mg，c：5.6 mg
Fig 5  Spectra of the water-soluble metabolite extraction of different net weights for detection. a: 1.4 mg, b: 3.2 mg, c: 5.6 mg

3　讨论

       磁共振频谱技术是利用磁共振化学位移现象来才测定组成物质的分子成分的一种检测技术，亦是目前惟一可测得活体组织代谢物的化学成分和含量的检查方法，磁共振频谱已广泛运用于良恶性疾病的鉴别、疗效评估及随访中^[1,2,3]。间充质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在组织损伤修复及再生医学中具有广阔的应用前景^[4,5]。干细胞的磁共振频谱特征研究已见报道，其频谱信息的明确对干细胞生物学特性研究，干细胞凋亡、分化及移植后生理状态的监测有重要意义^[6,7]。

       提取细胞或组织代谢物进行检测是高场MRS研究的常用方法，目前常用的是利用高氯酸提取水溶性代谢物，利用Tyagi等^[8]介绍的甲醇／氯仿1∶2 (v/v)法提取脂溶性代谢物，后来Bligh等^[9,10]对Tyagi的方法进行改进，使用甲醇／氯仿／水1∶1∶1(v/v/v)从同一批细胞或组织样本中一次性地提取出两类代谢物。在细胞的频谱研究中，由于所使用的细胞数量较大，细胞培养的工作量不可忽视，利用较少的细胞数量高效地获得较多提取物供检测以及能同时获得细胞水溶性与脂溶性的全面代谢特征信息是频谱研究所期望的，从该角度看，DPE法似乎是较合适的备选方案。DPE是由经典的M/C法经改进而来，Belle等^[11]研究发现，DPE对水溶性代谢物特别是对谷氨酸及胆碱复合物等具有良好的提取效果，而其研究并未对DPE与PCA及M/C的提取效率进行分析比较。我们的研究发现，作为经典的PCA和M/C法，其对水溶性及脂溶性代谢物提取效率较DPE法高，而DPE法虽能同时获得两类代谢提取物，其提取效率特别是对水溶性代谢物的提取效率相对较低。虽然本研究中DPE与M/C法所获得的脂溶性提取物干重没有统计学差异，然而从DPE法处理的同一细胞样本中所得的水溶性部分却不足以获得良好的谱线质量，要想利用DPE法获取足够的水溶性提取物供检测，则须增加所使用的细胞数量，而这无疑又大大增加了研究的工作量。

       利用高场磁共振对不同干重的提取物进行频谱检测，发现极少量的脂溶性提取物就可以得到较好的谱线质量，而要得到良好的水溶性代谢物谱线则需要更多的提取物。由于脂溶性提取物频谱中大部分代谢组份为饱和及不饱和脂肪酸类，其在氘代氯仿中具有良好的溶解性且化学结构中含有丰富的氢质子，这可能是较少的脂溶性提取物即能获得良好谱线质量的原因^[12]。在PCA法所得的水溶性提取物谱线中，可以看到位于1.28 ppm处代表不饱和脂肪酸的亚甲基峰(-CH2-)及位于0.89 ppm处代表饱和脂肪酸的甲基峰(-CH3)^[13]，而在DPE所得水溶性部分提取物谱线中，这两个位置并未检测到明显的代谢峰，这也从一定程度上说明溶剂的选择对代谢物提取效率会有一定的影响。

       综合本实验的研究结果，我们认为可以利用PCA提取细胞的水溶性代谢物联合M/C提取脂溶性代谢物，在获得两类提取物频谱特征的同时，达到对细胞的合理利用和减少研究工作量的目的。虽然该提议额外增加了利用M/C法提取脂溶性代谢物的过程，却大大减少了细胞的使用数量及繁琐的细胞培养的工作，具有更高的可操作性和实用价值。虽然本研究是对人脐带间充质干细胞代谢物提取效率的比较，我们在进行肺癌细胞、小鼠成骨细胞的代谢物提取时亦得到相同的结论，因此该方法具有较强的可推广性。然而我们认为在对活体组织进行代谢物提取时，由于取材的限制性相对较小，亦可以考虑使用DPE法进行提取。

       综上所述，在代谢提取物的高场MRS研究中，可以根据不同方法的提取效率及MRS对水溶性和脂溶性代谢物检测敏感性的差异，对提取方法的选择进行一定的优化，在获取细胞全面代谢特征信息的同时达到对细胞的合理利用及工作量的简化。