随着MR成像技术的迅速发展，不但能提供高分辨率的结构影像，而且可以在微观、代谢水平反映组织的特性。MR灌注加权成像（perfusion-weighted imaging, PWI）能够在活体上检测组织或病变血流灌注、了解微循环状态及血流动力学特征，能无创反映身体的结构和功能，它在脑、肝、心缺血性病变及肿瘤血供研究领域中具有良好的应用前景^[1,2]。

       微血管密度（microvessel density, MVD）是反映肿瘤微血管生长和周围侵润的重要标志^[3]。笔者旨在探讨VX2兔肝癌高能聚焦超声（high intensity focused ultrasound, HIFU）治疗前、后的PWI特征和变化规律，并与MVD进行比较，探讨MR功能成像下肿瘤微血管的生长、破坏情况及对组织器官血流灌注的影响。

1　材料与方法

1.1　实验动物

       新西兰大白兔42只，雌雄不限，体重1.5～ 2.5 kg，平均体重1.85 kg，3~4月龄，由广东省医学动物中心提供。所有实验兔均采用单笼饲养，全价营养颗粒饲料喂养，自由饮水，饲养管理由我院实验动物中心专人负责，饲养环境及条件一致。

1.2　VX2瘤株制备和接种

       VX2瘤株购于广西医科大学。采用瘤组织块包埋法^[4]制作兔VX2肝癌模型，于兔耳缘静脉注入速眠新(0.2 ml/kg)全麻后无菌条件下逐层开腹，暴露肝脏，以眼科镊于肝左叶较厚处刺破肝组织并形成口小（3~5 mm）底大（5~8 mm）的"烧瓶"样窦道，将2~3块剪碎的瘤株植入其中，并以明胶海绵碎块埋塞窦口。确切止血后回纳肝脏，逐层关腹，注入青霉素8万U/kg。术后3 d常规注射青霉素和庆大霉素各4万U/kg。成功建立40只兔VX2肝癌模型。2周后行MR扫描，观察肿瘤大小，待肿瘤直径≥10 mm时，随机抽取20只瘤兔麻醉后送入HIFU治疗中心，行HIFU治疗，另20只作为对照组，不做治疗。HIFU治疗后14 d治疗组和对照组再次进行常规MRI和PWI。检查完毕立即处死动物，取标本迅速置于液氮和10％中性甲醛溶液中保存，然后石蜡包埋切片作病理检测。

1.3　治疗及扫描方法

       JC-1型高强度聚焦超声肿瘤治疗系统位于我院HIFU治疗中心。该系统由功率发生器、B超定位监控装置、治疗头、运动控制装置、治疗床和声藕荷装置等部分组成。组合治疗头置于水囊内，水囊内装循环脱气水，其含气量<3 ppm。治疗机由我院HIFU治疗中心消化内科资深医师负责操作，我院设备维护科工程师负责维护。治疗头的工作频率为0.8 MHz，治疗声功率为220 W。采用直线扫描，线长10 mm，靶点距兔体表距离均为11 mm。

       MR扫描方法：速眠新0.2 ml/kg深度麻醉兔后，使用自制腹带加压固定，采用Philips 1.5 T MR扫描仪，8通道膝关节扫描线圈，采用呼吸门控行常规MRI及PWI，PWI采用SE-EPI序列。扫描参数：TR 3000 ms，TE 43 ms，层厚2.0 mm，间距0.3 mm，各向同性，采集次数4，FOV 150 mm×150 mm，矩阵256×256。对比剂为钆双胺注射液（Gd-DTPA-BMA），剂量0. 3 mmol/kg，采用高压注射器注射，注射流率2 ml/s，扫描时间约5 min，每只兔采集原始灌注图像920~1080帧^[5]。

1.4　PWI数据后处理及统计学方法

       所有的灌注原始图像均传送至工作站用其配套软件（ViewForumR6.1V5）进行处理，分别测量治疗前、后兔肝VX2肿瘤不同ROI信号强度。ROI测量方法：首先根据增强扫描瘤灶边缘明显强化及PWI明显高灌注的特点确定肿瘤边界，并以此确定肿瘤中央区、肿瘤周边区及瘤周正常肝实质的选择范围。选取能显示肿瘤最大层面、强化明显的边缘区；非肿瘤区ROI选择在常规MRI检查尚未出现形态学改变的远离瘤灶周围的肝实质区域，并注意避开肝脏的边缘、主要血管及胆管等结构，在肿瘤中央区和瘤周正常肝实质各画1个ROI，肿瘤周边区画3个ROI（取平均值），各相关数据从画图软件右上角的图形视图中获取。以ROI内的信号强度平均值为基础构建血流灌注的信号强度-时间曲线，分析各ROI在治疗前、后的MRI信号变化，计算最大信号下降斜率(maximal signal reduction slope, SRSmax)。SRSmax计算公式：SRSmax=(SIpre-SIp)/TTP。式中SIpre为PWI图像稳定后至信号下降前的ROI信号强度的平均值，SIp为灌注峰值时刻的ROI信号强度值，TTP为达峰时间（ROI信号强度下降的开始时刻到降为峰值时刻之间的时间宽度）。利用Philips扫描机的配套软件包绘制相对肝血容量（relative hePatic blood volume, rHBV）图^[4,5]。

       病理检测：肿瘤内MVD检测采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidinperosida, SP)三步法，HE染色，所用一抗为抗CD34（武汉博士德公司，工作浓度1:50），采用PBS液代替一抗作阴性对照；VX2瘤组织作为阳性对照。MVD计数先在低倍镜（40倍）下全面观察切片，选出血管密度区（即"热点"），然后在高倍镜（400倍）下分别取3个视野计数微血管，以染成棕色的血管内皮或内皮细胞束作为1条血管数，血管腔和腔内的红细胞不作为计数单位，与抗体起反应的巨噬细胞和浆细胞等在镜下根据形态学差异予以排除，以3个高倍镜视野的微血管平均数作为该切片的MVD值^[6,7]。

       采用SPSS 13. 0软件进行数据分析，两组之间肿瘤SRSmax的比较及各组内不同部位SRSmax值、MVD的比较均先作正态性检验和方差齐性检验，符合条件则进一步行单因素方差分析和SNK检验，若不符合条件，则作Dunnett's T3检验。所有均数采取±s表示，MVD与SRSmax值作相关性分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　治疗前、后兔VX2肝癌的MRI表现

       40只VX2瘤兔均成功建模，2只分别于种植后16、20 d自然死亡（对照组）。1只于治疗后5 d自然死亡，1只于治疗后9 d自然死亡（治疗组）。其余36只均生存至MRI检查结束。

       36只荷瘤兔中有33只在扫描过程中呼吸平稳，麻醉深浅适度，基本得到满意的肝脏图像质量，其中治疗组18只，对照组15只。其余3只因呼吸门控、伪影等因素导致图像质量欠佳不纳入最后统计。术后14 d扫描，发现病灶共36个，其中30只1个病灶，3只2个病灶，瘤体直径为（1.45± 1.12） cm，瘤体平扫T1WI为稍低信号，T2WI为稍高信号，信号较均匀，边界较清楚。增强扫描病灶呈结节状强化，强化较均匀，瘤体内未见明显坏死囊变（图1）。

       治疗后14 d治疗组和对照组行平扫及增强MRI，示病灶大小均较前增大，但治疗组瘤体增大程度较对照组为小，治疗组瘤体直径为（2.78±1.73） cm，对照组瘤体直径为（3.86± 1.06） cm，两组之间瘤体大小差异有统计学意义(t＝2.52, P＝0.04)。T2WI信号不均匀，可见高、低混杂信号，边界不清，增强扫描呈不均匀强化（图2）。解剖后发现5只病灶有囊变坏死。

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图1  治疗前增强扫描，示肿瘤不均匀明显强化
图2  治疗后增强扫描，肿瘤边界变清，中央区强化差，边缘环形强化
图3  治疗前rHBV图，示肿瘤周边区、中央区高灌注
图4  治疗后rHBV图示肿瘤周边区高灌注，中央区灌注程度明显降低
图5  肿瘤中央区治疗后呈大片无结构坏死区（HE　×400）
图6  肿瘤中央区见一瘤巢，周围为肿瘤细胞和间质微血管包绕，MVD着色于血管内皮细胞内（Tunel法凋亡检测　×400）
图7  对照组镜下视野内可见大量核大、深染、异型性明显的肿瘤细胞及微血管腔（Tunel法凋亡检测　×400）
图8  对照组周边区瘤细胞增多，紫色、颗粒状，染色较深，MVD计数明显增多（HE　×400）
Fig. 1  Tumor parenchyma showed unevenly enhanced before HIFU therapy.
Fig. 2  Tumor border were clearer and cycloidal enhanced, tumor central were lower enhanced after HIFU therapy.
Fig. 3  Before HIFU therapy, hypertransfusion of tumor border and tumor central showed in rHBV.
Fig. 4  After HIFU therapy, hypertransfusion of tumor border and hypoperfusion of tumor central showed in rHBV.
Fig. 5  After HIFU therapy, tumor central showed large scale of necrosis area without structure (HE ×400).
Fig. 6  A cancer nest founded in the tumor central, surrounding by tumor cells and interstitial microvascular, MVD showed in the plasma vascular endothelial cells in treatment group (Tunel ×400).
Fig. 7  Lots of, deeply dyeing and heterogenic tumor cells and microvascular were founded in control group (Tunel ×400).
Fig. 8  Tumor cells increased, purpe, granular and deeply dyeing of tumor border, MVD counted increased obviously in control group (HE ×400).

2.2　治疗前、后兔VX2肝癌PWI表现

       治疗前rHBV图显示两组肿瘤病灶范围与增强MRI显示病灶范围基本一致，肿瘤中央区、肿瘤周边区血供丰富，呈红色（图3）。治疗后rHBV图示治疗组肿瘤周边区灌注程度较治疗前有所下降，但仍为高灌注区，中央区灌注强度明显降低，表现为绿色；瘤周肝实质灌注强度未见明显变化（图4）。

2.3　治疗前、后不同ROI的SRSmax值比较

       治疗组治疗后肿瘤中央区及周边区分别与治疗前相应部位的SRSmax值两两比较，差异有统计学意义；瘤周正常肝实质SRSmax值两两比较差异无统计学意义（表1）。

       对照组前、后两次PWI扫描，肿瘤中央区SRSmax值两两比较差异有统计学意义，肿瘤周边区、瘤周肝实质的SRSmax值比较差异无统计学意义（表2）。

       治疗后治疗组与对照组肿瘤瘤周区的SRSmax值两两比较差异有统计学意义，中央区及周围正常肝实质的SRSmax值比较差异无统计学意义（表3）。

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表1  兔VX2肝癌治疗组HIFU治疗前、后SRSmax比较结果(±s)
Tab. 1  Comparison of SRSmax value between before and after HIFU in treatment group (±s)

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表2  兔VX2肝癌对照组前、后两次SRSmax的比较结果(±s)
Tab. 2  Comparison of SRSmax value between the first and the second in control group章(±s)

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表3  HIFU治疗后治疗组与对照组不同ROI的SRSmax结果比较(±s)
Tab. 3  Comparison of SRSmax value between treatment group and control group in different ROI (±s)

2.4　组织病理学表现

       治疗组中央区肿瘤血管明显减少，细胞坏死明显，瘤周可见水肿和炎性反应；中央区出现微黄色或棕黄色坏死组织，镜下观察为凝固性坏死，MVD计数较治疗前明显减少，中央部分区域出现组织机化，可见少量微血管残留（图5）；周边区仍可见较多肿瘤细胞及间质血管，MVD主要表达于病灶周边区的血管内皮细胞，呈棕黄色、深褐色；肿瘤区内的巨噬细胞、浆细胞及肿瘤和正常肝实质汇管区内的少量血管亦偶有非特异性染色（图6）。对照组肿瘤细胞多见，异型性明显，见多发微血管腔形成，中央区可见坏死液化（图7），肿瘤周边区肿瘤细胞及间质、微血管生长仍然非常活跃（图8）。

2.5　两组兔肝VX2瘤不同ROI的SRSmax与MVD的比较

       治疗组治疗后肿瘤周边区SRSmax、MVD的改变最明显，均高于肿瘤中央区及瘤旁肝实质（表4）；瘤周区的SRSmax与MVD呈正相关（图9）。

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图9  治疗组瘤周区SRSmax与MVD的表达呈线性正相关
Fig. 9  Positively correlated between SRSmax value and MVD of tumor border in HIFU group.

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表4  HIFU治疗后治疗组不同ROI的SRSmax与MVD比较(±s)
Tab. 4  Comparison between SRSmax value and MVD of different ROI in treatment group (±s)

3　讨论

3.1　VX2肿瘤的血管生成

       实体性肿瘤生长和转移的前提是肿瘤微血管的生成，肝癌具有很强的诱导血管生成能力，VX2肿瘤生长迅速，制作周期短，肝癌模型制作技术成熟，有利于实验研究^[8]。

3.2　HIFU的疗效

       HIFU利用超声波的组织穿透性和易于聚焦等物理特性，将体外低能量的超声波束聚焦在肿瘤靶区，通过焦域处高能量超声波产生的热效应、空化效应及机械效应等，其中最主要的是热效应，使局部产生高温(≥65 ℃)，导致焦域区内细胞产生不可逆死亡、蛋白质变性和组织凝固性坏死，同时能破坏内径< 2 mm的肿瘤滋养血管，而位于通道上的组织及焦域周围的组织不会受到损伤^[9,10]，提高了肿瘤局部控制率。

3.3　PWI

       实验发现治疗组经HIFU治疗后肿瘤周边区、中央区灌注程度较治疗前减低，但程度有所不同，中央区降低更明显。病理检测证实是由于此阶段中央区大部分肿瘤微血管被高能量的超声波破坏，发生凝固性坏死；而肿瘤微血管主要生成于周边区，其血管化程度仍较高，所以在增强扫描及rHBV图上仍呈明显强化和较高灌注，仅仅在统计学比较上有差异，即是说，SRSmax值测量比增强扫描及rHBV图在判断肿瘤微血管形成、瘤细胞浸润方面更准确。瘤周肝实质随着肿瘤的浸润生长也有一定程度的血管生成，但该区域的门静脉血流灌注仍占主导地位，升高幅度及灌注强度均低于肿瘤周边区。

       对照组兔肝PWI示肿瘤中央区第二次扫描灌注强度较第一次明显下降，有统计学意义；肿瘤周边区、瘤周肝实质两次扫描均呈高灌注，差异无统计学意义，分析是因为此阶段肿瘤周边的微血管生成处于稳定期，仍然是肿瘤细胞浸润与转移的基础；病理检测发现中央区因血管生成不足肿瘤细胞缺血而发生液化性坏死，呈低灌注，但与治疗组肿瘤中央区低灌注的发生原因有本质的不同，需要区别。

       治疗组HIFU治疗后周边区SRSmax值较对照组第二次PWI后肿瘤周边区SRSmax值明显降低，两者差异有统计学意义，说明HIFU在破坏肿瘤微血管生成、防止瘤细胞向周围扩散等方面都有肯定的疗效，治疗组与对照组中央区SRSmax值两两比较差异无统计学意义，是因为这一阶段中央区都发生了大范围瘤细胞坏死，但两者坏死的机制不同，前者是HIFU治疗后导致的凝固性坏死，后者是自身肿瘤血管生成赶不上瘤细胞生长的需要，发生的液化性坏死，病理检测也证实了这一点。

       综上所述，兔VX2肝癌SRSmax与MVD计数的程度、范围一致，两者呈正相关；SRSmax测量能反映VX2肝癌HIFU治疗前后不同ROI的微血管生成、破坏状况，在组织微血流循环水平上监测其变化，且早于传统的增强扫描及PWI伪彩图的变化，对肿瘤早期诊断、术后疗效评估等有较好的研究前景。