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基础研究
大鼠急性酒精中毒合并弥漫性轴索损伤脑干的DTI研究
张海都 孔令梅 陈若伟 刘慧敏 郑文斌

张海都,孔令梅,陈若伟,等.大鼠急性酒精中毒合并弥漫性轴索损伤脑干的DTI研究.磁共振成像, 2013, 5(1): 348-453. DOI:10.3969/j.issn.1674-8034.2013.05.007.


[摘要] 目的 利用DTI探讨急性酒精中毒对大鼠脑干弥漫性轴索损伤(DAI)的影响。材料与方法 85只雄性大鼠,分对照组(N组),急性酒精中毒组(A组),DAI组(T组)和急性酒精中毒合并DAI组(AT组)。对照组和各实验组动物(模型制作成功后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)进行MRI检查,并取脑干进行病理学检查。结果 急性酒精中毒合并DAI组脑干ADC值于伤后1 h开始降低,6 h达最低点,此后ADC值逐渐升高,24 h达到最高;FA值1 h即降低,随时间逐渐降低,24 h达到最低值。急性酒精中毒合并DAI组伤后各时间点FA值低于单纯DAI组,伤后3 h、6 h差异有统计学意义;12 h内ADC值低于单纯DAI组,24 h后高于DAI组。结论 急性酒精中毒可以加重DAI后脑水肿及轴索损伤,DTI能更敏感地检测到常规MRI不能发现的急性酒精中毒合并DAI后脑干部位脑水肿及轴索损伤情况。
[Abstract] Objective: To assess the effects of alcohol on traumatic brain injury (TBI) by using diffusion tensor imaging (DTI) in rat brainstems following acute alcohol intoxication with diffuse axonal injury (DAI).Materials and Methods: 85 male rats, divided into control group (group N), acute alcohol poisoning group (group A), DAI Group (group T) and ethanol-plus-DAI group (group AT). The control group and the experimental group (made into animal model after 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h) were examined by MRI, and the brainstem pathology.Results: After acute alcoholism with DAI, ADC values of the brainstem first decreased within 6 h after injury and then elevated. FA values began decline by 1 h, reaching a minimum at 24 h after trauma. FA values were lower in the ethanol-plus-DAI group (group AT) compared to the DAI group (group T) at 3 h and 6 h. The ADC value of the ethanol-plus-DAI group (group AT) is lower than the DAI group (group T) in 12 h, but it is higher after 24 h.Conclusions: Acute ethanol consumption affects severity after DAI by accelerating brain edema and axonal injury. DTI can sensitively to detect acute alcohol intoxication with TBI in brainstem edema and axonal, while the routin MRI cannot found.
[关键词] 弥漫性轴索损伤;酒精中毒;磁共振成像
[Keywords] Diffuse axonal injury;Alcoholism;Magnetic resonance imaging

张海都 汕头大学医学院第二附属医院放射科,汕头 505041

孔令梅 汕头大学医学院第二附属医院放射科,汕头 505041

陈若伟 汕头大学医学院第二附属医院放射科,汕头 505041

刘慧敏 汕头大学医学院第二附属医院放射科,汕头 505041

郑文斌 汕头大学医学院第二附属医院放射科,汕头 505041


基金项目: 广东省自然科学基金 编号:S2012010008974 广东省科技计划项目 编号:2010B031600129
收稿日期:2013-01-29
接受日期:2013-06-20
中图分类号:R445.2; R651.1 
文献标识码:A
DOI: 10.3969/j.issn.1674-8034.2013.05.007
张海都,孔令梅,陈若伟,等.大鼠急性酒精中毒合并弥漫性轴索损伤脑干的DTI研究.磁共振成像, 2013, 5(1): 348-453. DOI:10.3969/j.issn.1674-8034.2013.05.007.

       急性酒精中毒合并颅脑外伤的发病率近年来呈递增趋势,弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)是常见的闭合性颅脑损伤。MR扩散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)定量分析最常用的两个参数为各向异性分数(fractional anisotropic,FA)和表观扩散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)可在三维空间内定量分析组织内水分子的扩散运动,是目前惟一能进行无创性活体研究脑白质纤维束形态结构的方法。

1 材料与方法

1.1 实验方案

       85只健康SD雄性大鼠,体重240~ 260 g,由汕头大学医学院医学实验动物中心提供,随机分组为对照组10只(N组),急性酒精中毒组(A组),DAI组(T组)和急性酒精中毒合并DAI组(AT组),实验组每组25只,每个时间点5只。

1.1.1 模型制作

       A组(急性酒精中毒组):用北京红星二锅头食用白酒(56% v/v)按15 ml/kg剂量[1]一次性灌胃制作大鼠急性酒精中毒模型。灌酒后大鼠兴奋性增强、不走动、步态不稳,约10 min后逐渐出现侧卧、步态不稳、翻正反射消失、昏睡、呼吸缓慢等急性酒精中毒临床症状。

       T组(单纯DAI组):采用经典Marmarou自由落体致伤模型[2]制造DAI模型(图1)。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/kg),麻醉后剪掉大鼠顶部毛发,大鼠俯卧于20 cm厚的海绵床,将1元硬币放置于顶骨上。500克铁棒从1.8 m高处垂直自由坠落打击硬币,随即撤离海绵床避免二次打击。Marmarou模型致伤后大鼠多数立即出现全身痉挛,四肢抽搐,持续时间约30~ 40 s,多数大鼠出现寒颤,短时间昏迷(约1~ 3 min),活动较前明显减少,反应迟钝,行走不稳;呼吸深慢,主动觅食减弱。

       AT组(急性酒精中毒后脑外伤组):先以北京红星二锅头食用白酒(56% v/v)按15 ml/kg剂量一次性灌胃,0.5 h后按照Marmarou模型打击[2]。该组大鼠出现的症状较T组明显严重,全身痉挛、抽搐持续约40~ 50 s,短时昏迷(5~ 10 min),呼吸暂停,对痛觉刺激无反应,行走不稳,不能移动;呼吸深慢,不能主动觅食。

       实验组某个时间点大鼠造模过程中若有死亡,立即补充大鼠继续造模,保证每个时间点5只大鼠。A组造模成功25只,无大鼠死亡,成功率100%。T组造模成功25只,死亡3只,共用大鼠28只,成功率89%。AT组造模成功25只,死亡7只,共32只,成功率78%。对照组和各实验组大鼠分别于模型制作成功后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h进行MRI检查后立即断头处死,取脑干进行病理学检查。

图1  Marmarou自由落体致伤模型示意图
Fig. 1  schematic diagram of Marmarou moudel.

1.1.2 MRI检查

       包括常规T1WI、T2WI及DTI扫描。扫满参数:T1WI TR 2633 ms,TE 23.4 ms;T2WI TR 6000 ms,TE 109.9 ms;DTI TR 8000 ms,TE 109.4 ms,b值1000 s/mm。其他参数:层厚3.0 mm,层间隔0.0 mm,反转角90° ,FOV 24 cm × 24 cm,采集矩阵256 × 256,平均采集次数为2,采集方向为25。

       DTI数据处理:MRI扫描完成后将图像传送到工作站AW4.3(GE Mdeiacl system),2名有经验的放射科医师使用Functoo1软件测量数据,为了尽量使选区层面一致,把DTI图像和T2WI横断面层面进行匹配,确定脑干部位。ROI大小为5 mm × 5 mm,置于横断面DTI原始图像脑干部位,得到ADC图与FA图(图2),测量ADC及FA值,计算平均值。

图2  脑干ROI图(A:FA图;B:ADC图)
Fig. 2  Brainstem ROI. A: FA. B: ADC diagram.

1.1.3 病理学检查

       大鼠MRI扫描后,左心腔4%多聚甲醛充分灌注,开颅取全脑,沿正中裂纵行切开,4%福尔马林液固定24 h,常规切片(5 μm)进行HE和Gless嗜银染色。

1.2 数据分析

       采用SPSS13.0统计学软件进行统计学处理,结果用均数±标准差表示,组间及组内比较分别采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MR扫描结果

2.1.1 常规MR扫描结果

       N组T1WI、T2WI显示大鼠脑组织结构清楚,灰白质对比良好。A组脑组织灰白质对比稍模糊,未见明显异常信号灶。T组及AT组显示大鼠脑组织灰白质对比模糊,脑实质内未见明显出血灶或挫裂伤,T组3只、AT组7只脑池内可见线条样T1高信号。

2.1.2 DTI扫描结果

       ADC值测量结果见表1。N组大鼠脑干平均ADC值为(0.880±0.014) × 10-3mm2/s。

       A组ADC值1 h开始降低,3 h达到最低点,为(0.800±0.056) × 10-3mm2/s,随后升高,12 h恢复正常。1 h、3 h、6 h与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

       T组ADC值1 h轻微升高,12 h达顶峰,为(1.317±0.175) × 10-3mm2/s,随后下降,24 h仍高于对照组,3 h、6 h、12 h、24 h与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

       AT组ADC值1 h轻微降低,6 h达最低点,为(0.753±0.037) × 10-3mm2/s ,随后升高,于24 h达到最高,为(1.115±0.103) × 10-3mm2/s。各时间点与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。AT组12 h内ADC值低于T组,24 h后高于T组。

       FA值测量结果见表2。N组大鼠脑干FA值为0.341±0.062。A组FA值1 h轻微下降,3 h达到最低值,为0.314±0.021。各时间点与对照组之间差别无显著统计学意义(P>0.05)。T组及AT组FA值伤后均持续下降,于24 h达到最低值,T组为0.202±0.021,AT组为0.188±0.032。各组各时间点与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。AT组伤后各时间点FA值低于T组,伤后3 h、6 h差异有统计学意义(P<0.05) (图4)。

图3  A组、T组、AT组大鼠脑干各时间点ADC值曲线图
图4  A组、T组、AT组大鼠脑干各时间点FA值曲线图
Fig. 3  A group, T group, AT group of curve of rat brainstem ADC values at different time points.
Fig. 4  A group, T group, AT group of curve of rat brainstem FA values at different time points .
表1  对照组、A组、T组及AT组各时间点大鼠脑干ADC值情况(×10-3mm2/s)
Tab. 1  ADC values of the N group, A group, T group and AT group in different time points in the ratbraistem (×10-3mm2/s)
表2  对照组、A组、T组及AT组各时间点大鼠脑干FA值情况
Tab. 2  FA values of the N group, A group, T group and AT group in different time points in the rat brainstem

2.2 病理结果

2.2.1 HE染色(图5)

       N组大鼠脑干神经细胞排列整齐规则,细胞之间分界清楚,胞浆染色清晰,胞核染色适中,血管周围间隙无增宽。A组大鼠脑干神经元及胶质细胞出现胞体肿胀,排列散乱,胞浆染色模糊,胞核淡染,神经纤维排列疏松,轴索肿胀。T组大鼠脑干部分神经元及神经胶质细胞不同程度水变性,胞体肿胀,排列散乱,核染色较淡,以24 h改变最为明显,致伤后3 h可见粉红色圆形或椭圆形收缩球出现,散在少量斑片状蛛网膜下腔出血,血管腔内皮皱缩、细胞外间隙稍扩大。AT组大鼠脑干大部分神经元及神经胶质细胞肿胀,排列散乱,核染色变淡,细胞外间隙改变,以24 h改变最为明显。致伤后3 h可见粉红色圆形或椭圆形收缩球出现,斑片状蛛网膜下腔出血,血管腔塌陷,内皮皱缩、血管周围间隙明显扩大。

图5  大鼠脑干HE染色(HE × 400)。A:对照组;B:A组3 h;C:T组3 h;D:T组12 h;E:AT组3 h;F:AT组12 h
图6  大鼠脑干Bielschowsky’s嗜银染色(Bielschowsky × 400)。A:对照组;B:A组3 h;C:T组3 h;D:T组12 h;E:AT组3 h;F:AT组12 h
Fig. 5  HE stain of the rats brainstem (HE ×400). A: N group. B: 3 h in A group. C: 3 h in T group. D: 12 h in T group. E: 3 h in AT group. F: 12 h in AT group.
Fig. 6  Bielschowsky’s silver stain of the rats brainstem (Bielschowsky ×400). A: N group. B: 3 h in A group. C: 3 h in T group. D: 12 h in T group. E: 3 h in AT group. F: 12 h in AT group.

2.2.2 Bielschowsky’s嗜银染色(图6)

       N组大鼠脑干轴索染色均匀,排列规则,无增粗、扭曲,无断裂。A组大鼠脑干神经纤维不同程度扭曲,增粗,以3 h最明显,未见明显断裂。T组大鼠脑干部分神经纤维粗细不均,轴索肿胀、扭曲,致伤后3 h出现轴索球,部分神经纤维断裂,24 h表现最明显。AT组大鼠脑干多数神经纤维粗细不均,轴索周围间隙增宽,轴索肿胀、扭曲,呈螺旋状、串珠状改变,致伤后3 h出现轴索球,神经纤维断裂,24 h表现最严重。

3 讨论

       酒精又名乙醇,具有脂溶性,血液中的酒精10 min即可进入大脑,可迅速透过大脑神经细胞膜而影响细胞功能[3]。酒精可与卵磷脂结合,脑组织卵磷脂丰富,乙醇沉积于脑组织中最长可达1个月,故可对中枢神经系统产生较持久的神经毒副作用。小剂量酒精可以兴奋中枢神经系统,但大剂量却具有抑制作用,酒精对神经系统的抑制随剂量增加而增加。本实验病理结果A组大鼠脑干神经元及胶质细胞出现胞体肿胀,排列散乱,胞浆染色模糊,胞核淡染,神经纤维排列疏松,轴索肿胀,证实酒精对脑组织的伤害。急性饮酒会导致意识错乱,共济失调,导致以跌倒、打架及交通事故等形式出现的外伤风险增加[4]。有文献表明大约30.0%~50.0%的脑外伤患者受伤时有急性饮酒史[5]。Rehm等[6]2009年提出全球人口3.8%的死亡、5.6%的残疾与酒精有关,酒精是造成全球疾病负担及外伤的危险因素。

       DAI是一种常见的闭合性脑外伤,其发病机制目前普遍认为是头部受强大外力作用后产生旋转加速度和(或)角速度,使脑组织内部易发生剪应力作用,导致神经轴索和小血管损伤。经典Marmarou自由落体致伤模型是利用落体加速使头部产生弥漫性轴索损伤,因其条件易于控制,致伤效果明确,损伤机制单一,重复性好,受个体因素影响小等特点,得到广泛的认可和应用[2]。因此笔者选用Marmarou模型。DAI好发于不同密度组织结构之间,如灰质和白质交界处,两侧大脑半球之间的胼胝体、基底节、内囊及大脑和小脑之间的脑干上端[7]。常规CT及MRI在一定程度上有助于DAI的临床诊断,目前比较公认的CT和MRI特征包括脑白质内单发或多发小出血灶及占位效应不明显、脑干出血、胼胝体出血和脑室内出血等。也有部分患者影像所见与临床症状不一致,表明常规CT及MRI技术对诊断DAI的价值有限[8]

       新的MR成像技术DTI主要检测活体组织内水分子的扩散运动特点,反映人体组织中水分子扩散的各向异性[9]。DTI可在三维空间内定量分析组织内水分子的扩散运动,对白质结构改变十分敏感,可定量分析和评估白质各向异性改变,还可重建纤维束走行的立体结构,是目前惟一能进行无创性活体研究脑白质纤维束形态结构的方法。DTI最常用于评价组织扩散特征参数的两个常用指标是ADC和FA. ADC值可以测定脑实质的水扩散率,ADC值越大水分子的扩散能力越强,信号下降越多,可以反应细胞内水肿情况。ADC值下降代表了细胞毒性脑水肿,ADC值升高反映了血管源性脑水肿[10]。FA是表示白质各向异性及完整性的一个度量标准,FA值与神经元脱失、神经纤维方向改变及髓鞘脱失皆有联系,被称为髓鞘损伤的指针。脑白质各向异性高,FA值大,呈高信号,且在脑白质中FA值与髓鞘完整性、纤维致密性及平行性呈正相关,组织结构受到破坏,FA也就相应降低。本实验中A组(急性酒精中毒组)大鼠1 h、3 h和6 h脑干ADC值低于对照组,而FA值无明显变化,提示急性酒精中毒以细胞毒性脑水肿为主。大鼠急性酒精中毒合并DAI后6 h内脑干部位ADC值降低,随后ADC值升高,24 h内FA值持续性降低,提示早期以细胞缺血缺氧导致的细胞毒性脑水肿为主,随后血脑屏障(BBB)破坏导致的血管源性脑水肿占主要地位,FA值降低提示神经轴索损伤,这也得到病理结果的证实。另外急性酒精中毒后脑外伤其脑血流量显著减少,脑组织严重缺血、缺氧可以引起脑组织病理性自由基反应,使脑外伤后自由基反应更加强烈,脑水肿更严重,细胞坏死更广泛,神经纤维受损更严重。目前国内外对急性酒精中毒合并DAI的研究已经从大体病理改变深入到分子生物学改变,但尚未见急性酒精中毒合并DAI的相关神经影像学研究。

       笔者认为急性酒精中毒合并DAI组12 h内ADC值低于单纯DAI组,细胞内水分子扩散受到抑制,急性酒精中毒可以加重DAI后脑水肿,使外伤后脑水肿的演变及治疗变得更加复杂。有研究表明伤前醉酒可使兔脑外伤后发生显著的呼吸抑制、低血压、脑血管收缩及脑末梢血管阻力增加,使脑血流量(CBF)显著减少,并加重脑外伤后自由基反应,加重脑水肿[11]。从本实验FA值变化与病理观察对比研究可以看出,急性酒精合并DAI后FA值表现为持续降低趋势,24 h达到最低,虽然存在着细胞毒性和血管源性两类脑水肿对FA值的不同影响,但是轴索迂曲肿胀、崩解、轴索球形成等轴索规律结构的破坏是导致FA值降低的主要原因,AT组(急性酒精中毒合并DAI组)FA值低于A组(单纯DAI组),反映了急性酒精中毒能够加重DAI后轴索损伤,FA值更能反映DAI后轴索结构损伤的情况。

       笔者研究发现急性酒精中毒可以加重DAI后的脑水肿及轴索损伤,DTI反映了大鼠急性酒精中毒合并DAI早期以细胞毒性脑水肿为主,随后血管源性脑水肿占主要地位,本研究对阐明急性酒精中毒合并DAI的脑水肿类型及演变机制有重要意义,为临床针对急性酒精中毒合并DAI后不同类型脑水肿的治疗提供一定影像学依据。

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