MR频谱（MR specttroscopy, MRS）技术可无创地检测活体组织或细胞的代谢物特征及变化，进而推断细胞、组织及器官的生理功能及状态变化。高场MRS可以检测到细胞及组织生理过程出现的早期及较微小的代谢特征，为在体研究打下坚实的基础。

       笔者利用9.4 T高场MRS检测离体间充质干细胞向成骨细胞分化后细胞代谢提取物的频谱及其变化特征，寻找间充质干细胞成骨分化的生物学标识，为MRI技术运用于干细胞及骨组织工程学研究做一定基础。

1　材料与方法

1.1　间充质干细胞的培养

       间充质干细胞（MSCs）来源于胎儿脐带的华尔通氏胶组织，脐带取自汕头大学医学院第二附属医院产科，为健康足月剖宫产胎儿脐带，去羊膜表皮及血管，取华尔通氏胶，剪碎为1 mm³大小的组织块，将其贴壁于底部经由多聚赖氨酸处理的塑质培养瓶中，加原代完全培养液约10 ml(含10% FBS、F12生长因子及低糖DMEM)，置温暖湿润的CO2培养箱中（37 ℃，5%CO2）行原代培养，约2周后原代间充质细胞从组织块周围长出。新生细胞呈贴壁生长，待细胞生长至70%～80％融合时进行传代培养。本实验所用的人脐带间充质干细胞的分离及纯化采用目前公认的贴壁筛选法，利用MSCs对塑料培养材料具有较强黏附性特性分离培养出高纯度的MSCs，用流式细胞仪监测干细胞表面分子标记，表明扩增后的MSCs的纯度可以达到95％以上^[1,2]。

1.2　体外诱导间充质干细胞向成骨细胞分化

       按照文献[3]介绍制备成骨分化诱导培养液，在低糖DMEM培养基中加0.1 umol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 ug/ml维生素C配成成骨分化诱导液。取2~ 3代的间充质干细胞，在细胞传代培养时换加成骨诱导液，以后每2~ 3 d换液一次。成骨诱导模型的鉴定采用茜素红钙结节染色及碱性磷酸酶染色，方法参照试剂盒说明进行。

1.3　细胞代谢物的提取

       利用甲醇／氯仿提取间充质干细胞的脂溶性代谢物（间充质干细胞的代谢物和间充质干细胞向成骨细胞分化后的代谢物），采用改良的Folsh等的方法^[4,5]，用细胞刮刀刮取收集1.0 × 10⁶的细胞，离心弃上清，向细胞沉淀中加入体积比为1:2预冷的甲醇／氯仿1.5 ml，冰浴中进行超声碎裂5 min(功率为450 W，工作2 s，停1 s)，然后再向混合液中加入0.5 ml蒸馏水，震荡混匀后置高速离心机离心，离心环境0 ℃、13000 rpm，时间为20 min。离心后溶液分层，其中上层液为甲醇和水的混合物，下层为氯仿层，用移液器小心分离吸取氯仿层溶液，置于另一离心管内用高纯氮气吹干。

1.4　高场MRS检测及后处理

       取干燥的细胞提取物样本加入0.5 ml含一定量内标为TMS的氘代氯仿，充分溶解后移入直径为5 mm的核磁共振测试管内，置入Burker 9.4 T (400 MHz，Bruker Avance，Switzerland) MR仪探头内。用机器自带氢质子频谱zgpr采集序列，机器自匀场，带宽为5 KHz，TR值为20 s，重复扫描32次，数据采集点为4096。原始数据经傅里叶转换、相位及基线校正后输出。

       后处理使用Bruker自带核磁软件Mestrec4.7，对波峰下面积进行积分及分析。

2　结果

2.1　间充质干细胞成骨分化特征

       倒置显微镜下观察，间充质干细胞形态呈梭形、漩涡状生长，体外诱导间充质干细胞向成骨细胞分化2周后，间充质干细胞形态发生变化，细胞体积变圆，排列密集且逐渐出现细胞重叠现象，在重叠的细胞之间出现散在点状高亮沉积物，茜素红染色为显著红染的钙结节沉积，碱性磷酸酶（AKP）染色见胞浆内蓝色颗粒为阳性表达的碱性磷酸酶（图1）。

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图1  间充质干细胞向成骨细胞分化形态及染色特征。A：间充质干细胞呈贴壁梭形生长(×100)；B：成骨诱导2周细胞变圆(×100)；C：茜素红染色见红染的钙结节(×100)；D：碱性磷酸酶染色见胞浆内蓝染颗粒(×200)
Fig. 1  Morphological and staining characteristic of MSCs underwent osteogenic differentiation. A: MSCs were adherent and spidle-like cells (×100). B: MSCs turned round after 2 weeks’ inducement (×100). C: Alizarin red staining showed red-stained calcium nodules (×100). D: AKP staining showed blue-staining particles in the cytoplasm (×200).

2.2　间充质干细胞成骨分化前后MRS变化特征

       诱导间充质干细胞向成骨细胞分化后，其最显著的MRH变化是位于1.77 ppm附近出现一新的代谢峰，而位于2.02 ppm及2.25 ppm的脂质峰明显减低，位于0.89 ppm和1.28 ppm的脂质峰无明显改变（图2）。

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图2  间充质干细胞及成骨分化后频谱特征。A：间充质干细胞代谢物频谱特征；B：间充质干细胞成骨分化后频谱特征，分化后1.77 ppm处出现一新的代谢峰，2.02 ppm和2.25 ppm代谢峰下降
Fig. 2  Metabolite profile of MSCs underwent osteogenic differentiation. A: Metabolite profile of MSCs. B: Metabolite profile of MSCs after induced osteogenic differentiation, there arised a new peak at 1.77 ppm and the peak at 2.02 ppm and 2.25 ppm decreased.

3　讨论

       成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间充质干细胞，除成骨细胞外，间充质干细胞还可分化成软骨细胞，成纤维细胞，脂肪细胞或肌细胞，成骨细胞是由多能的间充质干细胞在体内各种调控因素的调节下分化而来的^[6,7]。在离体培养环境下可以模拟成骨诱导分化条件进而诱导间充质干细胞向成骨细胞分化，最常采用的就是利用地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C配制成的诱导液，对间充质干细胞进行离体培养，在此环境下间充质干细胞逐渐表达并分泌I型胶原酶、碱性磷酸酶等并发生相应的形态变化及形成钙结节等。笔者采用通用成熟的诱导方法，离体培养2~ 3周后间充质干细胞逐渐合成分泌碱性磷酸酶及I型胶原酶并形成钙结节，证明本实验模型成功。

       诱导间充质干细胞向成骨细胞分化后，其最显著的MRS变化是位于1.77 ppm附近出现一新的代谢峰。由于既往未见有对此代谢峰的报道，结合频谱数据库及相关文献笔者推测该代谢峰可能为亮氨酸^[8,9,10]。因在间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的过程中，间充质干细胞逐渐表达分泌胶原蛋白酶，胶原蛋白是一种结晶纤维蛋白原，在骨骼中其被包埋在含有钙盐的基质中。胶原的分子结构为3条多肽链，每一条链含有一千多个氨基酸，分子量为95 KU。这3条肽链交织呈绳状，故又称三联螺旋结构，具有该特点的有一群氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸等，其总氮量为18.45%^[11]。丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸是非极性氨基酸，其较易溶于水而难溶于非极性溶剂氯仿，而亮氨酸为非极性氨基酸且由于其R基结构的高度对称性，在氯仿中有一定的溶解度，且亮氨酸的化学位移位于1.77 ppm左右，故笔者推测在1.77 ppm附近出现的明显代谢峰最可能为亮氨酸。

       频谱中其他代谢峰亦出现一定的变化，位于2.02 ppm及2.25 ppm的脂质峰明显减低，位于0.89 ppm和1.28 ppm的脂质峰无明显改变。细胞的脂质信号主要来源于细胞的磷脂分子层、脂蛋白及细胞浆内的脂质成分，脂质代谢峰的变化提示间充质干细胞向成骨细胞分化过程中细胞膜及细胞浆的结构和成分可能发生了一定的变化。虽然MRS不能确定该变化的具体形式，但MRS所提供的信息可引导我们进一步探索研究。

       综上所述，高场MRS可以敏感地检测干细胞代谢物，进而反映细胞的生理及功能状态，间充质干细胞向成骨细胞分化时在1.77 ppm附近出现一新的代谢峰，该代谢峰可能是干细胞成骨分化的生物学标识，脂质峰的变化亦可以为间充质干细胞成骨分化提供参考。