组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue type plasminogen activator，rt-PA)溶栓治疗是改善急性缺血性卒中预后的有效治疗方法，即在急性卒中发病3 h时间窗内应给予rt-PA静脉溶栓治疗^[1]。但起病3 h内，尚缺乏有关急诊分诊脑卒中的有效筛查工具及评分系统的具体数据。非增强头颅CT或头颅MRI是首先的影像学急性缺血性脑卒中诊断工具^[2,3]，并发挥着rt-PA有效指导治疗依据，但发病3 h内CT仅能提供排除脑出血的有效信息。MRI的DWI序列是缺血性脑卒中早期诊断最敏感和准确的方法^[4,5]，广泛应用于超急性和急性脑梗死的诊断和治疗过程检测，但评估量化发病时间段以及是否对缺血性脑卒中患者行rt-PA治疗选择判断方面尚不能提供更有用的客观依据。缺血性脑卒中早期诊断准确性、准确评估量化发病时间段和准确筛选适合rt-PA溶栓治疗者、治疗有效性间待需平衡的影像学客观依据及有效信息。笔者利用能准确把握发病时间段的大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型在高场7.0 T动物MR仪上通过T2WI、DWI、及¹H MRS序列来研究寻找发病3 h内缺血性脑卒中早期特征性影像迹影来评估量化缺血性脑卒中发病时间段，为筛选适合rt-PA溶栓治疗者提供早期客观依据及重要有效信息。

1　材料及方法

1.1　动物准备

       动物使用过程符合国家卫生院指导动物研究准则(实验动物饲养及使用准则)，并通过汕头大学动物伦理委员会批准。10只SD雄性大鼠(购自北京实验动物中心)，体重250~280 g，饲养于明、暗环境各12 h，自由获取食物和水。所有动物饲养设施的环境条件符合中国国家标准《实验动物环境及设施》(GB14925-2001)对普通动物实验设施的有关标准，动物饲养管理和动物实验操作符合《北京市实验动物管理条例》法规的要求。本研究已经过汕头大学医学院伦理委员会的批准，所有动物实验符合美国NIH关于实验动物照顾与使用的指导性原则。

1.2　缺血脑卒中MCAO大鼠动物模型的建立

       参照Longa等^[6]建立的大鼠大脑中动脉内栓线阻断方法，作适当改进，具体步骤如下：用10%水合氯醛溶液400 mg/kg，腹腔注射麻醉动物，大鼠仰卧位固定四肢，将大鼠颈部的毛尽量用除毛器剃干净，用碘酒消毒颈部皮肤2次，然后用75%乙醇消毒3次，颈部正中切开皮肤，钝性分离各层组织，分离到气管前肌后，沿右侧胸锁乳突肌腱向下分离，见到颈动脉鞘后可上拉钩。用眼科剪剪开颈动脉鞘，暴露右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)，沿CCA分离至颈内动脉(internal carotid artery，ICA)和颈外动脉(external carotid artery，ECA)分叉后一段，仔细分离避免损伤迷走神经和气管，置5-0慕丝线备用。将ECA近心端及远心端结扎，中间剪断，并在ICA和ECA分叉处的ECA根部置5-0慕丝线并打一个活结备用，然后将ICA、CCA用动脉夹夹闭。用眼科剪在ECA游离端剪一小口，并将ECA游离端拉至与ICA成一条直线，将尼龙线由ECA插入，插入后用所置5-0丝线适当用力结扎，以防止出血，打开ICA处动脉夹，将尼龙线插入ICA，继续插入至颅内，插入深度约(18.5±0.5) mm至微感阻力，使尼龙线头端通过大脑中动脉(middle cerebral artery，MCA)起始处，到达较细的大脑前动脉(anterior cerebral artery，ACA)，此时即实现右侧大脑MCA的血流阻塞，稍用力拉紧所置5-0丝线，以结扎ECA以固定尼龙线和防止出血。阻断成功后将ECA结扎，然后逐层缝合，以备用MRI检查。

1.3　MRI及MRS

       在体MRI及MRS实验前，将尚麻醉状态的MCAO大鼠俯卧位放置，头部固定，头部固定器内有可调节气体管道，在扫描过程中由管道通入1.5%~2.0%异氟烷和空气混合气体(250 ml/min)持续麻醉。10只MCAO大鼠全部接受MRI检查，使用Drive 2(安捷伦科技、美国)160 mm孔径7.0 T动物MR仪，400 mT/m梯度线圈，采集波谱使用专用动物脑表面线圈(20 mm，157~350 MHz，安捷伦科技、美国)，以激发及接受MRI信号。

       首先采集定位图，确定动物位置摆放正确及图像质量，而后获取FSETrace(快速自旋回波RARE，TR 2500 ms，TE 48 ms，回波链4，层厚1.0 mm，矩阵128×128)图像以备定位感兴趣区(VOI)，VOI选择缺血病变区(3.5 mm×3.5 mm×3.5 mm)，调整VOI准确定位于DWI上高信号区。采用Ge3D自动匀场，匀场效果达到水峰带宽15~20 Hz，选用超短回波时间激发序列(STEAM)获取MRS信号，TR 5000 ms，TM 12.72 ms，TE 2.35 ms，光谱宽度5000 Hz，NEX为160，扫描时间13 min。扫描前采集独立水峰，以评价匀场效果、估计涡流影响并作为物质绝对定量分析的参考，波谱采集时使用VAPOR抑制水信号。MRS采集从大脑中动脉梗塞后各1、2、3 h。

       采集MRS原始数据在使用LCModel绝对定量分析^[7]。原始数据采用标准格式(FIDs)输入，没有进一步的T1和T2校正，获取水抑制后谱线在0.2~4.0 ppm之间代表的各物质，分析以下17个代谢物：肌酸(Cr)、γ-氨基丁酸(GABA)、谷胺酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘油磷酰胆碱(GPC)、磷酰胆碱(PCho)、肌酸(MI)、乳酸(Lac)、N-乙酰天冬氨酸(NAA)，N-乙酰天冬氨酰谷氨酸(NAAG)、磷酸肌酸(PCr)，牛磺酸(Tau)。另外，基础集的基线设置包含生物大分子物质。为获取更可靠的结果，部分代谢物[天冬氨酸和乙酰天冬氨酰谷氨酸化合物(NAA+NAAG)、谷胺酸和谷氨酰胺化合物(Glu+Gln)、甘油磷酰胆碱和磷酰胆碱化合物(GPC+Pcho)、肌酸和磷酸肌酸化合物(Cr+PCr)]以总量形式参与计算，代谢产物ml和Tau单独量化。

       标准误差估计和最大下界(CRLBs)是用于评价拟合结果的可靠性的方法。用标准误差估计和最大下界(CRLBs)方法对LCModel波谱分析所得的各物质定量赋予可靠性和不确定性^[7]。

1.4　统计学处理

       所有数据分析均用SPSS 15.0统计软件包处理，计量资料以均数±标准差(±s)，用t检验，计数资料用χ²检验，运用两变量关联性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

       T2WI，10例MCAO大鼠6 h内均未显示明确的梗死灶，而10 min MCAO大鼠DWI均显示有异常的高信号在大脑中动脉供血的纹状体区、顶叶皮层区，ADC均显示有异常的低信号区在同DWI异常高信号区及同一时间段(图1)。

       对侧正常区域及大脑中动脉栓塞1 h后MCAO大鼠病变中心为感兴趣区得到的MRS，用LCModel分析结果图示(图2)。明显的看出位于1.33~1.35 ppm的Lac双峰增高，主要位于2.02 ppm的NAA峰下降。大脑中动脉梗塞后各小时段测到的Lac和NAA绝对浓度亦较对正常对侧组有显著性差异(P<0.01)。

       1、2、3 h各段GABA、NAA和NAA+ NAAG，短TE序列可见的谷氨酸类抑制性神经递质谷氨酰胺(Glutamine)、主要位于2.1~2.4 ppm和3.65~3.8 ppm的谷氨酸类化合物Glx(Gln+Glu)和兴奋性神经递质谷氨酸(Glutamata)、抗氧化与渗透有关代谢物牛磺酸(taurine)、主要位于3.05 ppm的Cr+PCr浓度，1 h开始逐渐上升，到2 h段呈高峰后3 h段明显下降的趋势。其中taurine、Glx和Cr+PCr 2 h段的绝对浓度比1、3 h段测到的浓度高，差异有统计学意义(P<0.01)。1、2、3各时间段主要位于3.20 ppm的GPc+PCh和Lac浓度未见特异性改变(图3)。

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图1  大脑中动脉栓塞10 min MR成像图。从左至右依次为T2WI、DWI、ADC图，T2WI上未见明显的缺血病变，DWI上纹状体及皮层区明显的异常高信号，相应病变区ADC低信号影
Fig. 1  A T2-weighted image (left), DWI (middle), and ADC map (right) of a rat 10 min after middle cerebral artery occlusion. Hyperintense lesions in the right corpus striatum and parietal cortex are clearly identified on DWI, and a corresponding reduction of the ADC (hypointense) is seen on the ADC map, whereas no lesion signs are seen on the T2-weighted image.

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图2  A：DWI上高信号区为VOI得到的MRS，经LCmodel后处理图像。B：对侧对照组，大脑中动脉栓塞1 h后，1.33 ppm的乳酸峰明显增高，2.02 ppm的NAA明显下降
Fig. 2  Multislice diffusion-weighted axial images of an MCAO rat brain with the volumes of interest (VOI) centered in the ischemic lesion regions, and in vivo ¹H-NMR spectra acquired from the corresponding brain regions are shown. Representative spectra were obtained from the ischemic lesion regions of each group (3.5 mm×3.5 mm×3.5 mm) and were fitted by LCModel. Spectra were acquired with an ultra-short echo-stimulated echo acquisition (STEAM) pulse sequence (TE/TR/NS=2/5000/160) (A). ¹H-MRS of an MCAO rat 1 h after ischemia onset and (B). ¹H-MRS of a normal rat. The Lac peak was significantly higher in the MCAO rat (1.33 ppm), but the NAA peak was lower in the MCAO rat (2.02 ppm).

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图3  大脑中动脉栓塞后各1、2、3 h得到的波谱，并LCmodel处理图(A)。各小时段测到的脑代谢物绝对浓度的对比(B)。病变区Tau、Cr+PCr化合物及Gln+Glu化合物在栓塞2 h有明显的高峰，有统计学意义(P<0.05)
Fig. 3  A: Each ¹H-MRS of an MCAO rat 1, 2, 3 h after ischemia onset. B: Quantitative data of the concentrations of the analyzed neurochemical metabolites in ischemic lesion of MCAO rat. Comparisons were made between 1, 2, 3 h groups. ^*P<0.05.

3　讨论

       不能获得足够的信息指导溶栓治疗，限制了rt-PA静脉溶栓治疗给患者带来的益处。如何快速、有效、简便筛查出适合rt-PA静脉溶栓治疗的急性脑梗死患者一直是关注和研究的热点，影像学指导的缺血性脑卒中个体化溶栓治疗是今后发展的一个方向。近年来随着CT、MRI技术的发展，可对缺血性脑卒中进行快速神经影像学评价，在急性缺血性脑卒中个体化治疗方面发挥一定的作用。但CT对超急性期的脑梗死以及脑缺血半暗带的诊断敏感性较低，而且对某些部位如幕下病变的敏感性不如MR。MRI通常比其他断层扫描具有高的空间分辨率,随着MRI技术的不断进步，能够同时进行解剖定位、生理、代谢方面的分析；快速评估组织血流变化为临床制定个体化治疗提供帮助。比如，依据MRI界定的病理生理治疗窗DWI和PWI不匹配理论判定缺血半暗带等，使影像学指导的个体化溶栓治疗成为急性缺血性脑卒中研究的热点和发展方向^[8,9,10,11]，但早期DWI可视化扩展及PWI随时间变化等有待解决的问题尚多。笔者初步研究表明：经多模式MRI检查序列可以评估量化超急性期缺血性脑卒中发病时间分段在发病3 h之内，其在筛选溶栓治疗患者和判断疗效方面均有较大应用价值，特别是筛选rt-PA溶栓治疗时间窗不明确者的选择和判断上。

       DWI对急性脑梗死的定性诊断有很高的敏感性和特异性。Fiebach等^[12]在对100例急性期脑卒中患者的CT和DWI诊断对比研究中现，CT的敏感度(61%)和特异度(65%)远比DWI敏感度(91%)和特异度(95%)低，就是说DWI在急性脑卒中定性诊断精度和评分可信度上明显高与CT。本研究中大脑中动脉栓塞10 min后12只MCAO模型DWI上均显示异常高信号，但T2WI上栓塞后6 h后才可出现异常高信号。因此，脑卒中后诊断中起到金标准的DWI和T2WI联合观察可用于评估量化并且能判断发病开始后至少6 h的时间段。

       ¹H MRS是目前惟一能无创性观察活体组织代谢及生化变化的技术，已在神经系统的临床上广泛应用^[13,14,15]。¹H MRS在脑内所能探测到的代谢物都与三羧酸循环和能量代谢有关。特别是缺血缺氧所引起的急剧能量衰竭、钙过度的积累、线粒体基因表达失调、自由基的产生、酸中毒及细胞凋亡有关急性脑卒中早期诊断中能提供有效影像学信息及客观依据^[16,17,18]。本研究中大脑中动脉梗塞1 h时测到的波谱显示，MCAO大鼠病变中心VOI(DWI高信号区)比对侧正常区域有明显的乳酸峰增高及N-乙酰天冬氨酸(NAA)峰下降。随时间的变化，1、2、3 h时γ-氨基丁酸(GABA)、NAA和天冬氨酸和乙酰天冬氨酰谷氨酸化合物NAA+NAAG浓度呈逐渐下降的趋势。另外，有研究表明Lac值升高而NAA值无明显下降的区域既可能是缺血后可以挽救的组织，既可能诊断缺血性半暗^[15]。但本研究中大脑中动脉栓塞3 h内病变区Lac和NAA的浓度未见相关性。

       谷氨酸类化合物Glx和兴奋性神经递质谷氨(Glutamata)、抗氧化与渗透有关代谢物taurine、Cr+PCr浓度，1 h开始逐渐上升，到2 h时呈高峰后3 h后明显下降的趋势。特别其中taurine、Glx和Cr+PCr 2 h段的绝对浓度高峰比其他时间段测到的浓度，在统计学上有明显的意义(P<0.05)并且有特异性。此种特异性变化有可能对定量缺血性脑卒中发病时间段以及有关筛选rt-PA治疗者中起到重要的作用。

       利用影像学工具评估量化急性缺血性脑卒中发病时间段目前还缺乏循证医学依据，因缺血责任血管不同、不同程度侧支循环的存在及脑组织自身功能程度不同，引起脑梗死发病时间不同，所以对脑梗死的病因评价尚需综合分析。另外，in vivo实验结果虽然与应用于患者可能存在着巨大差异，但可弥补准确把握发病时间段及结合7.0 T高场可得到很重要的影像学信息，有待及时挽救缺血脑组织的急性缺血性卒中患者获益而服务。神经影像如何更准确地确定可挽救脑组织、可评估量化脑卒中发病时间段，更加准确筛选适合溶栓治疗者，在临床患者上尚有待技术的开发和进一步研究。