Cuprizone （双环己酮草酰二腙，CPZ）是一种选择性铜离子螯合剂，低剂量的CPZ可诱导中枢神经系统产生脱髓鞘改变^[1,2,3]，并且仅出现脑白质的选择性损害，神经元保持完好^[4,5]，更加重要的是，周围神经系统几乎不受影响^[6]。C57BL/6小鼠是制备CPZ诱导的脱髓鞘模型发病率最高的品系^[7]，使用混有0.2% （质量分数） CPZ的动物饲料喂养4~ 6周龄的小鼠4~ 5周即可建立脱髓鞘模型，CPZ诱导的脑白质脱髓鞘程度在3~ 4周呈上升趋势，第4周达到顶峰^[8]。多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种中枢神经系统的慢性炎性脱髓鞘疾病，其病理变化复杂，主要包括髓鞘脱失与再生、轴索损伤、胶质增生、水肿以及炎性反应等。上述CPZ诱导的小鼠脱髓鞘模型是以研究中枢神经系统脱髓鞘及髓鞘再生为特点的动物模型，尤其适用于多发性硬化的研究^[9]。

       MR扩散张量成像（diffusion tensor imaging，DTI）是一项可以在体无创地反映水分子扩散运动及评价脑白质纤维束完整性的新技术。DTI的量化指标可以反映水分子的扩散特征，目前常用的有部分各向异性指数（fractional anisotropy，FA），主要反映水分子沿着白质纤维通道方向扩散的比率，间接反映白质纤维束的完整性有无破坏；平均扩散率（mean diffusivity，MD），主要反映水分子整体扩散幅度，即在各个方向上扩散的平均值。有学者将FA值进一步细化为两个矢量参数：轴向扩散系数λ∥(axial diffusivity，AD)，代表平行于纤维束水分子的扩散，径向扩散系数λ⊥（radial diffusivity，RD），为两个垂直于纤维束水分子扩散的平均值。MR T2WI能在一定程度上反映脑白质脱髓鞘在形态学上所发生的变化。

       笔者利用CPZ诱导的C57BL/6小鼠脱髓鞘模型来研究MS相关的脑白质脱髓鞘损伤，在7.0 T高场强MR扫描仪上联合使用T2WI及DTI技术，探讨其在反映MS相关脑白质脱髓鞘损伤中的优势，同时比较C57BL/6小鼠脑白质区（大脑皮层、海马、尾状核以及丘脑）对CPZ诱导的易感性。

1　材料与方法

1.1　动物准备

       动物使用过程符合《中国食品药品检定研究院实验动物福利伦理审查指导原则》，并通过汕头大学医学院动物伦理委员会批准。20只C57BL/6雄性小鼠[购自Vital River Laboratories (Beijing，China)]，4周龄，饲养于12 h/12 h白昼／黑夜循环的环境中，自由获取食物和水。小鼠适应新环境7 d后，随机分为CPZ组及正常组，各10只，分别喂食均匀混合0.2%（质量分数）CPZ粉末的啮齿类动物饲料及啮齿类动物标准饲料，时间均为4周。所有动物饲养设施的环境条件符合中国国家标准《实验动物环境及设施》 （GB14925-2001）对普通动物实验设施的有关标准，动物饲养管理和动物实验操作符合《北京市实验动物管理条例》法规的要求。所有动物实验符合美国NIH关于实验动物照顾与使用的指导性原则。

1.2　T2WI及DTI扫描

       正常组及CPZ组C57BL/6小鼠在喂食4周后均接受T2WI及DTI检查，小鼠麻醉采用3％戊巴比妥钠溶液0.04 ml/10 g进行腹腔注射，深度麻醉持续时间大约1.5~ 2.0 h。所有检查均使用安捷伦（Agilent、USA）孔径160 mm 7.0 T MR成像仪并采用表面线圈进行扫描，两组扫描方法及条件完全相同。首先采集定位图，确定动物位置摆放正确及图像质量，采用快速自旋回波序列（FSE，TR 2000 ms，TE 20 ms，FOV 20 mm × 20 mm，层面10，层厚1.0 mm，矩阵128 × 128，激励次数4次），获得T2WI，图像采集时间为2 min 12 s。DTI原始数据利用FSE-Dual序列扫描，TR 2000 ms，TE 36 ms，FOV 20 mm×20 mm，层面4，层厚1 mm，△= 14.65 ms，duration 5 ms，采集次数2，矩阵128 × 128，采用2个b值，b=0，b= 1000 s/mm²，对6个方向进行扩散扫描，图像采集时间为59 min。

1.3　数据测量

       DTI序列扫描获得原始数据后，利用7.0 T MR仪自带的图像分析软件，处理原始图像数据，获得FA图、TR图以及三组ADC图（ADC1、ADC2、ADC3）等。选取双侧大脑皮层、海马、尾状核以及丘脑作为感兴趣区(ROI)，为减小测量误差，以双侧测量数据的平均值作为各个ROI的测量值。数据测量在7.0 T MR扫描仪虚拟机（Agilent，USA）上完成，根据4个部位解剖结构的大小，设置与其大小尽量一致的ROI，同一部位左、右两侧ROI大小相同，4个部位ROI均为椭圆形。第一次手绘后进行存储，方便以后每次测量。利用体视觉分区分析法，在FA图、TR图、ADC1、ADC2及ADC3上分别获得各ROI的部分各向异性指数（FA值）、平均扩散率（MD值）、最大扩散系数(λ1)、中级扩散系数(λ2)以及最低扩散系数(λ3)。从DTI的原理可知，轴向扩散系数λ∥等于λ1，径向扩散系数等于λ2及λ3的平均值，即λ⊥=(λ2+λ3)/2。用上述方法在T2WI上得到各ROI的T2信号强度，同时测量对应层面侧脑室内脑脊液的信号强度，两者之比作为标准化的T2信号强度。

1.4　统计学处理

       采用SPSS 17.0进行统计学处理，数据均以均数±标准误表示。对正常组和CPZ组的4个感兴趣区比较两组之间是否存在显著性差异。P<0.05具有统计学意义，P<0.01具有高度统计学意义。

2　结果

       与正常组对比，CPZ组的标准化T2信号强度在大脑皮层、海马以及尾状核明显上升，差异具有统计学意义(P<0.01)，在丘脑呈上升趋势，但无统计学意义(P=0.119)（图1）。

       与正常组对比，CPZ组的FA值在大脑皮层、海马及尾状核明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，在丘脑呈下降趋势，但无统计学意义(P=0.178)(图2)。同时，在FA图上可以显示胼胝左侧出现明显脱髓鞘改变，胼胝体结构完整性受到破坏（图2中白色箭头所示）。

       在上述FA值出现明显下降的三个部位（大脑皮层、海马以及尾状核），CPZ组MD值及径向扩散系数λ⊥均明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)；轴向扩散系数λ∥在大脑皮层、海马、尾状核及丘脑均呈下降趋势，但仅在大脑皮层出现明显下降，具有统计学意义(P<0.05) （图2）。

       正常组及CPZ组的标准化T2信号强度、FA值、MD值、轴向扩散系数λ∥及径向扩散系数λ⊥的测量值以均数±标准误列出（表1），具体统计量t值及相应P值见表2。

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图1  A：为正常组及CPZ组T2加权图像对比；B：为正常组及CPZ组各感兴趣区标准化T2信号强度比较的箱式图。与正常组相比，CPZ组的标准化T2信号强度在大脑皮层(P<0.01)、海马(P<0.01)及尾状核（P<0.01）明显升高，结果具有高度统计学意义，在丘脑呈升高趋势，但无统计学意义(P=0.119)
Fig. 1  A: shows the T2 weighted imaging of control group and CPZ group. B: shows regional normalized T2 signal intensity differences in control and CPZ-fed group (n=10 each). While bold horizontal bars indicate median values, boxes and bars represent the interquartile ranges (25th to 75th percentile) and the range of measurements, respectively. Graph A-D shows that normalized T2 signal intensity of CPZ group were significantly increased in CTX (P<0.01), HP (P<0.01) and CP (P<0.01), but not in TH (P=0.119), when compared with control group.

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图2  A：为正常组及CPZ组FA图、TR图及三个方向上的ADC图的对比，白色箭头显示CPZ诱导小鼠胼胝体脱髓鞘改变，结构完整性受到破坏；B：为正常组及CPZ组各感兴趣区部分各向异性指数(FA值)、平均扩散系数（MD）、轴向扩散系数（AD，λ∥）以及径向扩散系数（RD，λ⊥）的变化趋势。^*代表P<0.05，结果具有统计学意义；^**代表P<0.01结果具有高度统计学意义；条形图由x+sx绘制
Fig. 2  A: shows the DTI images of controls and CPZ group, and the white arrow shows corpus callosum demyelination of the CPZ-fed mice. B: shows ROIs analysis of FA, MD, λ∥ and λ⊥ of CNT and CPZ groups (n=10 each). ^*means significant difference with P<0.05. ^**shows high significant difference with P<0.01. Data were expressed as .

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表1  正常组及CPZ组各个感兴趣区标准化T2信号强度、部分各向异性指数（FA）、平均扩散率（MD）、轴向扩散系数(λ∥)及径向扩散系数（λ⊥）的比较
Tab. 1  Summury of T2WI and DTI data of ROIs in CPZ group and controls

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表2  各感兴趣区T2WI及DTI参数的独立样本t检验统计结果
Tab. 2  Statistics results of VOIs data for different parameters

3　讨论

       T2WI对评估组织含水量敏感，是检测组织损伤最常用的手段^[10]。在以往的许多研究中，T2信号强度常常直接用来反映组织损伤^[11]，但T2信号强度易受部分容积效应及受试者体位等的影响，从而增加测量误差，为了减小这种误差，本研究将T2信号强度标准化，选取侧脑室中脑脊液的信号强度作为内标^[12]，两者之比作为标准化T2信号强度。本研究结果显示，CPZ诱导的脱髓鞘模型小鼠大脑皮层、海马以及尾状核的标准化T2信号强度较正常组明显升高，在丘脑中升高不明显。在脑组织损伤中，T2信号主要受组织含水量的影响^[13]，CPZ诱导小鼠脑白质发生脱髓鞘改变，组织含水量明显升高^[14]，因此T2WI表现为T2信号强度的明显升高。Yang等^[15]的病理学结果表明，相对于大脑皮层、海马及尾状核出现明显的脱髓鞘，CPZ模型小鼠丘脑脱髓鞘程度相对较轻，本研究结果与之一致。尽管T2WI对探测脑组织损伤十分敏感，但是其对反映脑白质纤维束的微细结构的异常改变缺乏特异性。

       两侧大脑通过胼胝体内的有髓神经纤维交流沟通，有髓神经纤维由轴突和包绕在轴突外富含脂质的髓鞘组成。髓鞘可以使轴突与外周绝缘，水分子不能自由出入有髓纤维的髓鞘^[16,17]。DTI的原理主要是基于水分子的扩散属性。由于水分子不能自由出入有髓纤维的髓鞘，因此，水分子在有髓纤维的扩散形式表现出较高的各向异性，采用该技术可以测量某个体素内各向异性的大小即FA值^[18]，FA值与脑白质纤维束的完整性有关，FA值的下降常常被用作脑白质损伤的证据^[19]。本研究发现CPZ喂养小鼠大脑皮层、海马以及尾状核的FA值较正常组出现明显下降，FA图上可以显示胼胝体结构完整性受到破坏（图2），表明DTI在探测脑白质脱髓鞘损伤方面十分敏感；同时也说明，相对于丘脑而言，大脑皮层、海马及尾状核对CPZ的暴露可能更敏感，这与Yang等^[15]的病理学结果一致。

       同时，在FA值出现明显下降的三个部位即大脑皮层、海马以及尾状核，平均扩散率（MD值）出现明显升高。MD值表示水分子的平均扩散率，而与扩散的方向无关。MD越大，组织内所含自由水分子则越多。CPZ诱导的小鼠脑白质胶质细胞弥漫性增生，血管周围的细胞浸润、髓鞘脱失和斑片样水肿，导致了水分子运动的结构屏障出现弥漫性损伤。虽然炎症改变和胶质增生潜在地限制了水分子的运动，但髓鞘脱失则导致细胞间隙扩大，水分子扩散增加，从而表现为MD值升高。理论上，FA值的下降是轴向扩散系数下降、径向扩散系数增加或是两者共同作用的结果^[20]。Roosendaal等^[21]发现MS病人脑白质FA值的下降都归因于径向扩散系数增加。Song等^[22]发现在动物模型中，径向扩散系数升高可以反映胼胝体脱髓鞘，轴向扩散系数下降与轴索损伤有关，而径向扩散率升高与脱髓鞘有关。值得注意的是，本实验中CPZ诱导的小鼠大脑皮层、海马以及尾状核这三个FA值出现明显下降的部位，径向扩散系数均出现明显的降低，而轴向扩散系数仅在大脑皮层出现明显的下降。这在一定程度上说明，相对于轴向扩散系数的降低，径向扩散系数的升高对FA值的下降的贡献更大，FA值的下降更倾向于与径向扩散系数的升高有关。

       综上所述，7.0 T高场强MR扫描仪具有高空间分辨率、高组织分辨率的特点^[23,24]，本研究在7.0 T MR扫描仪上联合使用T2WI及DTI技术，探测CPZ模型小鼠MS样的脑白质脱髓鞘损伤。结果显示T2WI对探测脑组织损伤十分敏感，但对区分脱2A髓鞘损伤与其他类型损伤缺乏特异性；DTI技术不仅对探测CPZ诱导的脱髓鞘损伤十分敏感，而且DTI还能特异性反映脑白质纤维束的完整性。本研究探测了CPZ模型小鼠四个较大的脑白质区，其中大脑皮层、海马以及尾状核出现了明显的脱髓鞘改变，而丘脑脱髓鞘程度相对较轻，这表明了脑白质对CPZ的易感性具有区域选择性。不仅如此，本研究结果也在一定程度上说明相对于轴向扩散系数的降低，FA值的下降更依赖于径向扩散系数的升高。