前列腺癌(prostate cancer，PCa)居美国男性癌症发病率第一位，死亡率第二位。在我国，随着环境污染、人口老龄化和饮食结构改变等因素影响，其发病率亦迅猛上升，已成为严重威胁中老年男性健康的第一杀手^[1]。目前对其准确诊断和有效治疗尚缺乏特异性手段。分子影像学的出现与发展有望为解决这一难题打开突破口。

       分子影像学是采用非侵入性影像学技术在生物体的细胞和分子水平探究其功能代谢能力，从而早期特异性诊断、靶向性治疗疾病以及动态实时监测疗效的一门学科^[2,3]，它构筑了分子生物学与影像医学间的桥梁，是现代医学影像学发展的里程碑。构建对肿瘤具有诊断和(或)治疗作用的分子探针是当前分子影像学的重要研究方向。分子影像探针一般包括亲和组件，治疗组件以及信号组件；其中，亲和组件分子量过大一直是阻碍分子影像学发展的瓶颈问题，这就需要寻求分子量小的亲和组件。从传统的全抗体到单克隆抗体、抗体片段到单链抗体再到单域抗体，其分子量不断变小。笔者综述目前具有最小分子量的单域抗体作为一种新型的亲和组件在前列腺癌分子影像学中的研究进展。

1　单域抗体的基本特性

       单域抗体(single-domain antibody，SdAb)，又称为纳米抗体(nanobody, Nb)或重链单域抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，vHH)，起源于二十世纪九十年代初Hamers等在骆驼血中偶然发现的一种不同于传统"标准抗体"的免疫球蛋白^[4]，它仅包含传统抗体的重链，但保留了与抗原高亲和力结合的能力，是目前可得的结构稳定的保留抗体完整功能的最小结合单元。其相对分子质量约12~15 KDa，不足传统抗体分子质量(150 KDa)的1/10^[2,5]。此外，SdAb还具有传统抗体所不具备的独特优势：(1)SdAb具有更强的抗原表位识别与结合的能力^[6]。(2) SdAb的基因能高度识别人抗体的重链可变区(VH3)，因此经该基因编码得到的SdAb相对分子质量较小且对生物体的免疫原性较弱，因而具有良好的生物相容性^[6,7]。(3) SdAb在血液中以可溶的形式存在且其清除率很高，大部分都能经肾脏快速地在体内消除；因此，在高度聚集SdAb的肿瘤部位与被快速清除SdAb的周围血液和组织中形成了较高的信噪比，从而大大提高了肿瘤诊断的灵敏度和特异性^[6,8,9,10]。(4)由于分子量小，再加上其vHHs的长度和序列的高度可变性，使得SdAb能有效地穿透组织而发挥作用，这也是其优于大分子的传统抗体的重要特性之一^[6,8]。(5)由于SdAb仅包含单个结构域，因而易于克隆，且表达量很高^[11]。

       基于以上特性，SdAb具备构建理想的分子影像探针所必需的大部分条件，而且在肿瘤的早期检测、确定目标靶点的表达以及筛选可疑患者以进行有针对性的靶向治疗等方面展现出了巨大的应用潜力^[2]。目前，SdAb在前列腺癌分子影像学方面也有了一些研究进展。

2　前列腺癌特异性SdAb的研究进展

2.1　前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)的特异性SdAb

       PSA是当前广为应用的前列腺癌特异性标志之一，主要作用是促进精子液化并最终分泌至精液中。通常，健康男性很少出现PSA逆行入血的情况，因而血液中PSA的浓度(<4 ng/ml)很低，远远小于其在精液中的浓度(0.5~5 mg/ml)。前列腺癌患者前列腺上皮细胞的基底膜受损，PSA大量释放入血而在血液中的浓度显著升高^[12]。基于PSA的这个特点，2004年，Huang等^[13]将PSA的特异性SdAb (cAbPSA-N7)连接在烷硫醇自体组装单体膜上，利用胶体金标记的夹心测定法测定其浓度。结果表明，通过引入有生物素标记的二抗以及链霉亲和素修饰的金纳米微粒的夹心测定法，以cAbPSA-N7为基础的PSA检测范围能缩小至亚纳米级，从而有利于良恶性前列腺疾病的鉴别，大大提高了诊断的特异性和灵敏度。该方法在理论上实现了与临床相关的PSA检测浓度。但除了前列腺癌，良性前列腺疾病以及物理性的前列腺创伤均可以使外周血中的PSA水平有一定程度的升高，基于此，有学者报道，针对不同亚型的PSA，其特异性的SdAb可以发生构型上的改变^[14]。这一发现可能有助于深入研究PSA灵活多变的构型，进而有助于提高PSA检测前列腺癌的特异性以及前列腺癌的分期。

2.2　前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)的特异性SdAb

       PSMA是前列腺腺上皮细胞膜上的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，在各种形式的前列腺癌组织中均呈高表达^[15,16]。PSMA作为前列腺癌的一种特异性的肿瘤标志物，在前列腺癌的早期诊断、特异性治疗以及疗效监测等方面得到了广泛应用。抗PSMA的单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)用于前列腺癌的放射免疫显像具有很高的特异性和灵敏性，是当前应用最为广泛的治疗前列腺癌的有效手段之一^[17,18]，但其存在如相对分子质量较大，难以穿透组织到达深处；肿瘤渗透性较差；反复应用易致人抗鼠的抗原抗体反应，且人源化过程复杂，成本高等局限性。

       2012年，Evazalipour等^[19]用人工合成的PSMA抗原的类似物以及表达PSMA的细胞系(LNCAP)分别免疫骆驼，得到了高效价的骆驼的重链抗体(camel heavy chain antibodies，HCAbs)，并最终获得了骆驼的PSMA的重组SdAb。经证实，这种重组SdAb具有PSMA特异性，能与LNCAP细胞高亲和力结合且亲和性远远高于之前报道的其他的抗PSMA的抗体，而对PSMA表达阴性的PC-3和DU145细胞系没有明显反应。2013年，Evazalipour等^[20]的研究小组又进一步构建、分选出了四种抗PSMA的SdAb：PSMA6、PSMA20、PSMA30、PSMA32。他们分别验证了其与重组PSMA的亲和性，并弃去了不能与LNCAP细胞系特异性结合的PSMA20、PSMA32，将余下的PSMA6和PSMA30分别标记放射性元素⁹⁹Tc^m，用SPECT/CT探测发现⁹⁹Tc^m标记的PSMA6、PSMA30均能与LNCAP细胞特异性地结合，而不能与PC-3细胞结合，且PSMA30与LNCAP细胞的亲和性显著高于PSMA6。该研究筛选出了一种新的抗PSMA的SdAb，大大改善了之前构建的SdAb的亲和性和特异性，在细胞和动物体内水平分别验证了其用于前列腺癌靶向治疗的可行性。类似地，Zare等^[21]设计并制作了重组PSMA抗原表位以及具有高亲和性结合PSMA蛋白的单克隆Nb，在体动物实验研究表明其有望作为一种新的有效的方法对前列腺癌进行早期诊断及靶向性治疗。

       近期，又有学者通过免疫骆驼构建出一种新型的抗PSMA的SdAb (即JVZ-007)，并将其与放射性的111In标记，用SPECT/CT成像仪在分别荷有PSMA阳性的PC-310前列腺癌裸鼠和PSMA阴性的PC-3前列腺癌裸鼠体内检测该抗体的活性^[22]。该研究成功构建出的复合抗体111In-JVZ-007-c-myc-his大大地提高了肿瘤特异性，而且具有极高的肾脏清除率，成像效果非常好。

2.3　前列腺癌其他特异性SdAb

       目前，除了如上所述的PSA、PSMA等前列腺癌特异性受体的SdAb，研究人员还发现在前列腺癌细胞及其组织中还存在有一些过表达的受体，它们同样可以作为SdAb的特异性靶点来进行前列腺癌的早期诊断及特异性治疗的研究。人表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factor receptor 2，HER2)，是HER激酶家族的成员，在人类的许多恶性肿瘤中都存在过表达，包括非小细胞型肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌及膀胱癌等^[23,24]。Huang等^[10]将抗HER2的SdAb(8B6)C末端的6×组氨酸标记上放射性核素三羰基⁹⁹锝^m [⁹⁹Tc^m-(H2O)3(CO)3]，并将其分别注入接种有高表达EGFR的人外阴鳞状细胞癌细胞A431和中表达EGFR的人前列腺癌细胞DU145裸鼠体内，利用SPECT成像系统来检测荷瘤裸鼠的EGFR的表达。结果表明，⁹⁹Tc^m标记的SdAb (⁹⁹Tc^m-8B6)分子探针在数小时内即能清晰地显示出肿瘤的所在部位，且A431细胞移植裸鼠瘤灶对该分子探针的平均摄取率要远高于DU145细胞移植裸鼠瘤灶的摄取率。因而，基于不同肿瘤之间以及肿瘤与正常组织或良性肿瘤之间的EGFR表达水平的显著差异，该分子探针可能有助于监测肿瘤治疗过程中EGFR的表达水平。这也进一步表明利用SdAb构建的分子探针在肿瘤分子影像学上的巨大应用前景。这种新型的非侵入性的肿瘤成像研究为前列腺癌的早期诊断及靶向性治疗又提供了一种新的思路。

3　SdAb在分子影像学上的其他研究进展概述

       SdAb作为一种有着广泛临床应用价值的新型分子，在前列腺癌以及其他各种恶性肿瘤的早期诊断和精准治疗上都有极大的发展前景。SdAb分别结合多种影像学技术手段在多种疾病的早期诊断以及靶向性治疗等方面也有不断进展(表1)。2011年，Hernot等^[25]构建了SdAb超声微泡μm-cAbVCAM1-5，可以特异性地靶向血管内皮细胞黏附分子1 (vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)。他们的实验结果显示，SdAb连接的超声微泡产生的信号强度显著高于对照组，具有更强的特异性靶向结合能力。该实验证实了以SdAb为基础的超声微泡能够获得高质量、高特异性的影像，更加显著地提高对早期病变的诊断能力。SdAb在光学分子影像学中也有很多的应用研究，有学者将抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的SdAb 7D12与近红外光(near infrared，NIR) IRDye800CW偶联，获得的7D12-IR使目标肿瘤在给药早期(给药后30 min)即可显像，且肿瘤的摄取率很高^[26]，由此也证明了以SdAb为探针的光学显像可获得疾病的早期信息，具有良好的应用价值。此外，还有学者对SdAb在核医学分子影像学中的应用进行了探讨与研究，如Vaneycken等^[27]用放射性核素⁹⁹Tc^m标记HER2特异性的SdAb 2Rs15d，在动物体内验证了其特异性靶向乳腺癌的特性；Gainkam等^[28]构建了特异性靶向EGFR的SdAb (99m) Tc-7C12，通过动物实验发现该分子具有较高的肿瘤摄取率而在肝脏中的摄取率很低，且血液清除率很高。总的来说，SdAb在分子影像学的研究中具有广阔的应用前景，已成为当前分子影像学中极为重要的明星靶分子。

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表1  基于靶向探针的分子影像学中处于在研阶段的单域抗体概述
Tab. 1  Overview of SdAbs based targeted probes in pre-clinical molecular imaging

4　展望

       自20世纪80年代mAb第一次成功地应用到临床^[31]以来，三十多年的临床实践表明mAb在恶性肿瘤的诊断与靶向性治疗上起到了巨大的促进作用^[32]。尽管如此，基于抗体水平的诊疗方法仍然非常有限。寻找一种灵敏的、非侵入性的技术手段对临床上各大疾病进行早期诊断、精准分期、精确定位、靶向治疗以及疗效监测迫在眉睫。SdAb的发现不仅为肿瘤的早期检测与特异性的靶向治疗提供了一种新的方法，另一方面也极大地推动了分子影像学的不断进展。当前，用于前列腺癌的SdAb还处于研究阶段，相信在不久的将来SdAb可以取代传统抗体，在前列腺癌以及其他恶性肿瘤的早期诊断与靶向性治疗上发挥巨大作用。