糖尿病脂质代谢紊乱导致的高胆固醇、高甘油三酯血症以及多不饱和脂肪酸与骨髓细胞减少、微血管病变和骨质疏松等密切相关^[1,2,3]，糖尿病患者容易罹患骨质疏松、病理性骨折等疾病^[4,5]。骨髓脂肪已经成为糖尿病骨髓病变的生物标志物，活体定量评价骨髓脂肪含量对于揭示糖尿病骨代谢及骨髓微血管病变病理生理机制具有重要的意义。

       磁共振骨髓脂肪定量技术在监测骨髓脂肪变化和判断骨髓功能状态方面具有独特优势。氢质子磁共振波谱分析的缺点在于扫描条件要求高，时间长，尤其在骨骼系统不甚稳定，且后处理过程十分繁琐，限制该技术的发展应用^[6]。定量非对称回波的最小二乘估算法迭代水脂分离序列(iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least-squares estimation quantitation sequence，IDEAL-IQ)技术作为改进的DIXON成像，经过T2^*衰减的修正和脂肪的多谱峰分布，在IDEAL技术的基础上把定性的水脂分离提高到定量的脂肪比例测量，该技术在活体骨髓脂肪含量的定量研究中显示了巨大优势^[7,8]。

       目前，尚未见IDEAL-IQ技术评价糖尿病骨髓脂肪含量的相关研究，本研究探讨IDEAL-IQ定量评价兔糖尿病模型椎体骨髓脂肪含量的可行性，为探索糖尿病骨髓微血管病变的脂肪-血流调控机制奠定技术基础。

1　材料与方法

1.1　兔糖尿病模型的建立

       动物实验经武汉大学医院伦理委员会审查通过。武汉大学动物实验中心提供3月龄健康新西兰雄性大白兔12只，空腹1.5~2.0 kg，平均(1.7±0.2) kg。实验动物由武汉大学人民医院实验动物中心单笼饲养，室温控制在25℃。12只兔适应性饲养一周后，测量空腹血糖，12只兔血糖均在正常水平且无明显差异[(5.5±0.5) mmol/L]。

       12只兔禁食、水8 h后，随机将兔分为实验组(A组)6只、对照组(B组)6只。将四氧嘧啶(Sigma公司)用生理盐水配制成2.5%溶液，按照100 mg/kg于30 s内由耳缘静脉摄入实验组兔体内，对照组给予注射生理盐水，之后自由进食、进水。24 h内用血糖仪(强生PEB003006P)每小时监测末梢血糖一次。对于血糖低于2.0 mmol/L或出现嗜睡、不进食、惊厥、尖叫等低血糖症状的大白兔，经耳缘静脉给予葡萄糖。48 h后，测量外周血糖浓度。单次外周血糖测量值大于14 mmol/L或两次测量大于11 mmol/L被认定为造模成功^[9]。若对于48 h后，实验组白兔血糖仍正常，补加50 mg/kg四氧嘧啶，直至血糖达上述标准；对于血糖大于30 mmol/L兔，肌注长效胰岛素，将血糖控制在30 mmol/L以下。

1.2　影像设备及成像技术

       实验组兔分别于造模成功后0、4、8、12、16周经耳缘静脉注射15 g/L戊巴比妥钠(2 ml/kg)麻醉。麻醉后将兔仰卧位，足先进固定于8通道膝关节专用相控阵线圈，运用3.0 T超导MR机(Discovery MR750 Plus，GE Healthcare)行常规腰椎矢状位FSE-T1WI、FSE-T2WI和IDEAL-IQ扫描。

       矢状位T1WI扫描参数：TR 400 ms，TE 13 ms，扫描层厚3 mm，视野16 cm×16 cm，矩阵512×512，激励次数为1，扫描时间2 min20 s。

       矢状位T2WI扫描参数：TR 2500 ms，TE 102.9 ms，扫描层厚3 mm，视野16 cm×16 cm，矩阵512×284，激励次数为1，扫描时间3 min 25 s。

       IDEAL-IQ参数：翻转角6°，TR 19.6 ms，TE 1.2 ms、3.2 ms、5.2 ms、7.2 ms、9.2 ms、11.2 ms。带宽125 kHz，扫描层厚3 mm，视野16 cm×12.8 cm，矩阵288×288，激励次数为2，扫描时间4 min21 s。

1.3　IDEAL-IQ骨髓脂肪含量百分比测定

       IDEAL-IQ扫描图像传入AW4.6工作站(GE Healthcare)，在造模成功0、4、8、12、16周，由同一研究者选取Fat Fraction像椎体中心层面，对糖尿病组与对照组的兔腰3~7椎体勾画感兴趣区(region of interest，ROI)，勾画ROI时，避开椎体头尾侧的终板软骨和椎体前后缘骨皮质。系统自动生成所画区域的脂肪含量比值(FF%)。每1个椎体脂肪百分比测量3次，取平均值记为椎体脂肪含量百分比(图1)。

点击查看大图

图1  实验组兔腰椎常规MRI和IDEAL-IQ。A：矢状位T2WI像，黑色箭头所指为兔腰7椎体；B：矢状位T1WI像，黑色箭头所指为兔腰7椎体；C：矢状位Fat Fraction像，红色区域为勾画的用于测量椎体脂肪含量比的兴趣区
图2  A：对照组16周兔椎体骨髓HE染色(　×400)；B：实验组16周兔椎体骨髓HE染色(　×400)，脂肪细胞(红色箭头)数量及体积明显多于对照组，骨髓细胞(蓝色箭头)数量明显少于对照组
Fig. 1  A rabbit in the alloxan-induced diabetic group at the week of 16. A: The sagittal T2-weighted image of the rabbit, black arrow refers to L7; B: The sagittal T1-weighted image of the rabbit, black arrow refers to L7; C: The sagittal Fat Fraction image, the red area is the ROI used to measure the fat content of the vertebral body.
Fig. 2  A: Bone marrow HE staining in the control group rabbit at the week of 16 (　×400); B: Bone marrow HE staining in alloxan-induced diabetic group rabbit at the week of 16 (　×400). The amount and volume of the fat cell (red arrow) in alloxan-induced diabetic group are more than the control. The bone marrow cells (blue arrow) reduced in alloxan-induced diabetic group rabbit contrasted to the control.

1.4　骨髓脂肪含量组织病理学检查

       在第16周完成检查后，采取空气栓塞法处死12只兔，取腰3~7椎体用10%多聚甲醛固定，脱钙两周，石蜡包埋，沿椎体短轴位切4μm厚薄片，行HE染色。骨髓中脂肪细胞数目计数由人工完成。在显微镜(OLYMPUS BX51)下拍片，随机选取3个相互不连续的区域，分别于高倍镜(×400)视野下统计脂肪细胞数目。取平均值为脂肪细胞计数。

1.5　统计学分析

       采用SPSS 16.0统计软件，在实验组造模成功后对各时间点IDEAL-IQ测量所得的实验组与对照组腰椎体骨髓脂肪比进行重复测量的方差分析。IDEAL-IQ测量腰椎体脂肪比参数与HE切片镜下脂肪细胞计数进行Pearson相关分析，所有结果以P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

       16周实验组兔腰椎常规矢状位T1WI和T2WI显示诸腰椎椎体信号轻度增高。常规HE染色显示，16周糖尿病组兔椎体终板下骨髓腔脂肪含量较对照组明显增多，骨髓细胞明显减少(图2)。

       糖尿病组各时间节点兔椎体脂肪含量比服从正态分布，且组间数据方差齐。球形检验结果P>0.05，符合F-H条件，采用重复测量资料的方差分析。实验组各时间点IDEAL-IQ测量椎体骨髓脂肪含量百分比的差异具有统计学意义(F=50.387，P<0.01)。进一步对各时间点的脂肪比参数进行两两比较，IDEAL-IQ测量实验组16周椎体脂肪含量百分比与0、4、8、12周差异存在明显统计学意义(表1)。16周实验组与对照组的FF值差异有统计学意义(t=-10.726，P<0.05)，见图3。对照组的各时间节点椎体脂肪含量比服从正态分布，且组间数据方差齐。对照组的各时间节点椎体脂肪比差异无明显统计学意义(F=1.477，P>0.05)。

       16周椎体骨髓脂肪含量比参数近似正态分布，Pearson相关分析结果显示IDEAL-IQ测量脂肪含量比与病理脂肪细胞计数呈显著正相关关系(r=0.925，P<0.05)，见图4。

点击查看大图

图3  各时间点糖尿病组与对照组IDEAL-IQ测量兔椎体骨髓脂肪比例的比较
图4  IDEAL-IQ测量脂肪含量比与病理脂肪细胞计数的相关性
Fig. 3  Comparison of bone marrow fat fraction with IDEAL-IQ between the diabetes group and the control group rabbits at each time point.
Fig.4  Correlation between fat content and the amount of the fat cells

点击查看表格

表1  糖尿病组、对照组各时间点IDEAL-IQ椎体脂肪比的比较(%)
Tab. 1  Comparison of IDEAL-IQ vertebral body fat content between the diabetic group and the control group at each time point (%)

3　讨论

       本实验结果显示糖尿病兔椎体骨髓脂肪含量比值在第16周时较0、4、8和12周明显增高，IDEAL-IQ测量骨髓含量与组织病理脂肪细胞计数具有高度相关性，显示IDEAL-IQ技术活体测量糖尿病骨髓脂肪含量是可行的。

       正常机体骨髓葡萄糖的代谢是肌肉组织的两倍^[10]。糖尿病由于胰岛素的缺乏，机体糖代谢的紊乱会导致椎体骨髓的脂肪堆积，而堆积的反式脂肪酸会反过来抑制骨髓葡萄糖的代谢^[11]。另一方面，由于骨髓脂肪细胞的填充，能够代谢葡萄糖的骨髓细胞减少，骨髓微环境的糖代谢进一步减弱。研究表明，同一机体不同椎体之间或者不同个体的椎体脂肪含量由于性别、年龄、疾病等因素也会存在差异^[12]。糖尿病、肥胖以及年龄的增长会导致骨髓脂肪含量的增加^{[6, 13,14]}。而椎体骨髓脂肪化与骨质疏松、椎间盘退变关系密切^{[10, 15,16]}，糖尿病患者的椎体脂肪化是椎体骨质疏松、椎间盘退变发生的早期重要表现。Sakellaridis N^[15]在对临床椎间盘手术病人的回顾性分析中发现，糖尿病患者发生重度椎间盘退变的概率更大；Ville Huovinen^[10]运用高分辨率多魔角离体波谱对猪糖尿病椎体的脂肪含量进行了定量分析，同时论证了葡萄糖代谢与椎体脂肪含量呈负相关关系。本实验结果显示骨髓脂肪含量可能可以作为糖尿病骨髓病变的影像学生物标志物。

       IDEAL-IQ技术利用"混合型水脂分离算法"对多回波复数数据进行重建、整合，最终计算出组织脂肪比^[17]。Ideal-IQ技术结合非对称采集技术与迭代最小二乘水脂分离算法，利用3D FSPGR在一个TR中采集6个梯度回波，利用fiy-back方法进行k空间填充。相对于传统IDEAL技术^[18]，IDEAL-IQ用时短，一次扫描可以产生6幅图像，分别是fat、water、in-phase、out-phase、R2^* maps和fat fraction maps。IDEAL-IQ所产生的fat fraction maps可以直接由计算出骨髓感兴趣区内的脂肪含量百分比。该方法由于无创、可重复性好，可以对椎体脂肪含量的变化进行定量评价，进而客观反映骨髓代谢功能的变化。Ergen FB^[19]首次采用IDEAL-IQ技术显示女性椎体骨密度和椎体脂肪含量存在负相关。Anne^[7]在利用活体波谱和水脂分离脂肪定量技术研究骨质疏松与椎体脂肪含量关系时发现，这两种技术在评价椎体脂肪含量方面具有高度一致性。而Jens-Peter Kühn^[8]论证经过T2^*衰减的修正和脂肪的多谱峰分布的水脂分离技术对于评估骨质疏松患者腰椎椎体脂肪含量具有更高的诊断效能。本研究首次探索IDEAL-IQ运用于糖尿病兔椎体脂肪比的定量研究，结果显示IDEAL-IQ可以便捷、有效、动态检测糖尿病骨髓脂肪含量的变化，为揭示早期糖尿病骨髓病变以脂肪代谢为中心的病理生理机制以及未来相关临床药物治疗效果的评估提供了影像学证据。

       本研究的局限性：(1)本研究实验组兔血糖水平维持在(14±2) mmol/L，且实验组兔血糖波动幅度小，糖尿病兔椎体脂肪化程度、进展速度与血糖浓度水平以及波动情况的相关性有待进一步确认；(2)IDEAL-IQ技术仅是骨髓组织脂肪比例的定量研究，下一步需要离体骨髓标本高分辨率波谱或质谱分析深入研究脂肪酸成分的变化；(3)本研究实验样本较小，欲探索糖尿病椎体骨髓脂肪变化详细机制，仍需后续大样本实验研究证实。另外，兔糖尿病椎体骨髓脂肪化特点是否与人体椎体相一致，仍需后续临床研究进一步证实。总之，IDEAL-IQ定量评估兔糖尿病模型椎体骨髓脂肪含量是可行的。