兔VX2肝癌模型设计成熟，具有容易复制、生长周期短、成功率高、模型稳定等特点，是一种较理想的肝肿瘤动物模型^[1]。磁共振灌注加权成像(perfusion-weighted imaging，PWI)能定量分析组织微循环的血流灌注变化，反映肿瘤血流灌注情况。本文通过分析兔VX2肝癌经三维适形放射治疗(three-dimensional conformal radiotherapy，3DCRT)后的PWI特点及灌注参数变化，与病理结果对照，探讨PWI作为肝癌疗效评估的可行性。

1　材料与方法

1.1　动物模型的建立

       新西兰大白兔13只(广东省医学动物中心提供)，雌雄不限，体重1.5~2.5 kg，3~4个月龄。VX2瘤株由广西医科大学提供。于兔耳缘静脉注入速眠新(0.2 ml/kg)全麻后，采用经腹腔瘤块种植法^[2]成功建立兔肝VX2移植瘤模型。

       2周后待肿瘤直径≥1 cm时麻醉后送入肿瘤放疗中心，行3DCRT治疗，放疗剂量为20 Gy，单次放疗，放疗后送回动物中心饲养。于放疗后10天再次行MRI检查，检查完毕处死动物，取病理标本迅速固定于10%中性甲醛溶液中，石腊包埋后行DAB染色、VEGF表达测定。

1.2　扫描方法

       速眠新0.2 ml/kg深度麻醉兔后，使用自制腹带加压固定，采用Philips 1.5 T磁共振扫描仪，8通道膝关节扫描线圈，采用呼吸门控行常规T1WI、T2WI(横断位、冠状位、矢状位)扫描后，行PWI扫描，PWI扫描采用SE-EPI序列，SENSE成像参数的缩减因子(reduction factor)取值为2。扫描参数：TR 3000 ms，TE 43 ms，层厚2 mm，间距0.3 mm，采集4次，视野(FOV)150 mm×150 mm，矩阵256×256。对比剂为钆双胺注射液(Gd-DTPA-BMA)，剂量0.3 mmol/kg，采用高压注射器注射，扫描3个相位后注射对比剂，速率0.2 ml/s，扫描完采用15 ml生理盐水冲管。扫描时间共为5分16秒。每只兔采集原始灌注图像920~1080帧。

1.3　MR灌注图像后处理

       所有的灌注原始图像均传送至工作站ViewForum 6.1 V5进行处理,分别测量放疗前与放疗后肝脏、VX2肿瘤感兴趣区(ROI)信号强度，以ROI内的信号强度平均值为基础构建血流灌注的信号强度-时间曲线，分析ROI在放疗前后的MR信号变化、计算最大信号下降斜率(maximal signal reduction slope, SRSmax)，并利用工作站功能软件绘制相对肝血容量(relative hepatic blood volume, rHBV)图。

       ROI测量方法：首先根据增强扫描瘤灶边缘明显强化及PWI明显高灌注的特点确定肿瘤边界，并以此确定肿瘤中央区、肿瘤周边区及瘤周正常肝实质的选择范围。肿瘤周边区ROI选择要求：选取能显示肿瘤最大层面、强化明显的边缘区；非肿瘤区每个ROI选择在常规MR检查尚未出现形态学改变的远离瘤灶周围的肝实质区域，并注意避开肝脏的边缘、主要血管及胆管等结构^[3]，ROI应尽可能大地包括欲测区，各相关数据从画图软件左上角的图形视图中获取^[4]。SRSmax计算公式为:SRSmax=(SIpre-SIp)/TTP，SIpre为PWI图像稳定后至信号下降前的ROI信号强度的平均值, SIp为灌注峰值时刻的ROI信号强度值，TTP为达峰时间(ROI信号强度下降的开始时刻到降为峰值时刻之间的时间宽度)。

1.4　统计学分析

       采用SPSS 11.0软件进行统计分析。放疗前、后两次扫描不同ROI的SRSmax值的比较采用配对t检验，放疗后不同ROI的SRSmax值与VEGF的比较先作方差齐性分析，如有统计学意义再进一步作两两比较，所有测值采取均数±标准差表示，P<0.05认为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　放疗前、后兔VX2肝癌的MRI表现

       13只VX2瘤兔均成功建模，其中2只因治疗过程中麻醉过量抢救无效死亡，术后立即取病理标本并置入10%中性甲醛溶液中保存以作分析对照，其余11只均生存至MR检查结束。放疗前10天扫描，发现肿瘤共16个，其中10只1个病灶，3只2个病灶，瘤体平扫T1WI为稍低信号，T2WI为稍高信号，信号较均匀，部分边界欠清楚。增强扫描病灶呈结节状强化，强化较均匀，瘤体内未见明显坏死囊变。病灶局限于肝脏内，未见转移(图1)。

       放疗后10天行MRI平扫及增强，示病灶大小较放疗前体积减小，T2WI信号不均匀，可见高、低混杂信号。增强扫描呈不均匀强化，5只病灶有囊变坏死。病灶转移较明显，3只有腹腔种植，其中2只可见腹水(图2)。

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图1  放疗前T2WI示瘤体呈稍高信号，信号较均匀，边界清楚，有包膜，局限于肝组织内
图2  放疗后瘤体缩小，信号不均匀，其内可见坏死区，边界欠清

2.2　病理学表现

       2只治疗过程中死亡的荷瘤兔病理标本大体肉眼观察见瘤体呈灰白色鱼肉样，表面血管增多增粗，镜下肿瘤呈浸润性生长，边界不清，核大、分裂像多见，间质少，瘤周区血管丰富(图3、图4)。

       放疗后肉眼观察肿瘤血管减少，镜下见毛细血管内皮细胞退化，细胞坏死明显，瘤周可见水肿和炎性反应(图5、图6)。

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图3  术中死亡的荷瘤兔瘤体剖开后大体肉眼观察，瘤体呈鱼肉状，较新鲜，坏死、囊变不明显；
图4  为光镜下DAB染色(×400)，VEGF阳性物质位于瘤细胞浆内，视野内可见大量肿瘤细胞及微血管形成

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图5  (放疗后)剖开大体标本见肿瘤中央坏死明显(▲)，周围可见新鲜瘤组织(↑)；
图6  (放疗后)VEGF阳性物质位于瘤细胞浆内，染色较深，紫色、棕褐色、颗粒状，肿瘤中央区见多个液化坏死形成的空腔

2.3　放疗前、后不同ROI的SRSmax值比较

       放疗后肿瘤中央区及周边区分别与放疗前相应部位的SRSmax值比较，有统计学差异(P<0.05)。瘤周正常肝实质SRSmax值无统计学差异(表1)。

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表1  3DCRT放疗前、后不同ROI的SRSmax值比较

2.4　放疗后不同ROI的SRSmax值与VEGF的比较

       不同ROI的SRSmax值与VEGF作方差齐性分析均无统计学差异(表2)。放疗后肿瘤中央区SRSmax值、VEGF的改变最明显，下降程度均高于肿瘤周边区及瘤周肝实质，肿瘤中央区即放疗区的SRSmax值与VEGF呈正相关(r=0.487，P=0.01)。

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表2  3DCRT放疗后不同ROI的SRSmax与VEGF的比较

3　讨论

3.1　兔肝VX2种植瘤模型的建立

       VX2肿瘤动物模型复制技术成熟，已广泛应用于多领域的肿瘤基础研究。其生长迅速，制作周期短，2周左右瘤体直径可达1 cm以上^[5]，此时肿瘤切面呈实质性，中心无变性坏死，此阶段为肿瘤血管形成期，主要在肿瘤周边区形成大量粗细不均、杂乱无章的肿瘤血管，可有少数扭曲、不规则穿支血管伸入肿瘤中央；3~4周后肿瘤中央可出现变性坏死，此阶段为肿瘤血管稳定期，瘤体增长迅速，与血管生成不成比例，肿瘤周边血供丰富肿瘤细胞生长旺盛，而肿瘤中央因缺血而坏死；5周后肿瘤中央出现大片坏死液化后形成囊腔，肝内、腹腔及肺内出现多处转移灶，此阶段为肿瘤血管退化期，血管生成相对减缓，瘤体大部分坏死。本实验选择在VX2瘤种植成功后2~4周肿瘤血管生长较好的时间进行研究，旨在尽量避免因瘤体生长较长时间后自身发生囊变坏死对数据采集及试验结果的影响。

3.2　三维立体适形放疗的临床应用

       三维立体适形放疗是利用立体定向等技术，将大剂量高能X射线，高精度地分次或一次性照射到设定的靶区上的一种放射治疗技术。由于照射野形状和治疗体积与病灶的形状和体积一致，又是多野、多角度照射，所有的高能X射线都集中在肿瘤组织内并形成高剂量区，逐渐达到肿瘤致死量，使肿瘤组织变性、坏死，病灶组织受到不可逆的破坏，同时减少了靶区周围敏感器官等正常组织的照射剂量，因而更符合临床剂量学的原则，提高了肿瘤局部控制率^[6]。

3.3　PWI成像技术

       肿瘤血管生成是实体性肿瘤生长和转移的基础。肝癌具有很强的诱导血管生成能力，其血管生成程度与肿瘤的生长、转移及预后密切相关，可以作为监测肿瘤生物学特性、预测转移和估计预后的重要指标^[7]。PWI可清楚地显示肿瘤微循环血流状况，主要采用动态团注示踪法，其基本原理来源于核医学中的示踪剂稀释原理及中央容积定理，通过团注对比剂后，采用超快速成像技术，检测对比剂首过组织时引起的局部信号强度改变，计算其T1或T2弛豫率的变化，再通过适当的数学模型变换得到组织血流灌注的定量信息，用于了解其血流动力学特征，评价微循环状态^[8,9]。本试验采集组织T1弛豫信息，得到的是T1WI图像。由于肝脏微循环结构的特殊性和MRI技术的复杂性，目前还未建立统一的肝脏PWI技术及相应数学灌注模型。

3.4　兔肝VX2种植瘤模型的MR灌注图像表现

       实验发现放疗前、后肿瘤中央区、周边区的PWI原始图像、rHBV图、SRSmax存在差异，与其血管生成及破坏程度相符：①放疗后信号强度-时间曲线显示肿瘤周边区呈一过性升高，瘤周肝实质呈一过性轻度升高，中央区信号减低，是由于此阶段大量的肿瘤血管生成主要存在于肿瘤周边区，肿瘤周边区血管化程度高，所以增强时边缘强化明显，灌注程度也最高(图7、图8)。rHBV图上则表现为异常的高灌注区。瘤周肝实质随着肿瘤的浸润生长也有一定程度的血管生成，但该区域的门静脉血流灌注仍占主导地位，所以其PWI表现为信号强度随时间为一过性升高，但升高幅度及灌注强度均低于肿瘤周边区；肿瘤中央区因放疗血管生成遭到破坏，呈低灌注(图9、图10)。②放疗前后肿瘤中央区、周边区的SRSmax差异有统计学意义，其中肿瘤中央区的SRSmax值明显降低，是因为瘤实质经放疗后发生凝固性坏死，血管生成遭到明显破坏，VEGF检测亦说明了这一点。③瘤周正常肝实质放疗后信号强度-时间曲线显示SRSmax较放疗前有一个轻度升高的变化趋势(图10)，康立清等^[10]关于兔VX2脑瘤血管生成的相关研究则未观察到此类现象。分析其原因，考虑是由于试验选择在肿瘤血管生长旺盛的血管形成期至旺盛期这段时间，肿瘤细胞生长活跃，肿瘤血管逐渐向瘤周正常肝实质浸润生长，微血管数量反应性增多，但由于周围正常肝实质灌注程度也很高，故在增强扫描及PWI图上表现也不明显，只在灌注信号强度时间曲线上有显示。且兔颅脑存在血脑屏障，与肝脏的灌注情况有所不同是否也是原因之一，有待于进一步实验证实。

       总之，PWI作为一种无创的影像检查方法，能显示兔VX2肝癌不同ROI放疗前后的血流变化，是针对组织微循环构成的成像方法，可以定量检测单位肿瘤组织内的血流量、血容量、血流平均通过时间等，从而反映肝脏肿瘤血管的功能状态，为临床治疗、判断预后等提供依据。

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图7  肿瘤达灌注峰值时刻的原始灌注图像，示注射对比剂后肿瘤周边区明显强化，中央区不均匀强化；
图8  rHBV图示肿瘤周边区、中央区高灌注，瘤周肝实质灌注程度略低

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图9  (放疗前)注射对比剂后不同部位的信号强度-时间曲线

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图10  (放疗后)注射对比剂后不同部位的信号强度-时间曲线。中央坏死区信号强度明显减低，肿瘤周边区、瘤周肝实质信号强度-时间曲线呈早期一过性轻度升高