肺癌的发病率高居世界恶性肿瘤之首，随着影像学技术日新月异的发展，传统的形态学研究，已不能满足人类对肿瘤机制的进一步探索，磁共振扩散加权成像(diffusion weighting imaging，DWI)在评价肿瘤的内部特征及发病、治疗、预后相关机制等方面都有了较大的飞跃。很多肿瘤的表观扩散系数(apparent diffusion coefficient，ADC)与肿瘤细胞密度、肿瘤的细胞构成和肿瘤分级之间存在负性相关关系^{[1,2,3,4,5,6]}。笔者初步探讨非小细胞肺癌(NSCLC)的ADC值与肿瘤细胞密度及细胞构成等因子的相关性，从而较好地反映非小细胞肺癌的组织病理学特征。

1　材料与方法

1.1　研究对象

       2008年9月至2011年6月，来院诊治的非小细胞肺癌患者46例，其中男23例，女23例，平均(60.04±9.79)岁；腺癌33例，鳞癌13例，均取得患者知情同意并配合行MSCT检查后3 d内行MRI检查，检查完成后1周内均在我院胸外科行手术病理证实。

1.2　MR检查

       采用GE 1.5 T Excite HD MR成像系统，梯度场强40 mT·m^-1，梯度切换率150 T·m^-1·s^-1，8通道体部相控阵线圈成像，患者仰卧位，采用呼吸门控和心电门控技术。监测心率不超过90 bpm，训练患者屏气。

       先行常规T1WI、T2WI(横断面+冠状面)扫描，以确定病变位置。DWI序列采用单次激发自旋回波回波平面成像(Echo-Planar MR Imaging，SE-EPI)，并行采集空间敏感性编码技术(array spatial sensitivity encoding technique，ASSET)，成像参数：TE 26.4 ms，FA 45°，FOV 40 cm×40 cm，Matrix 256×128，b值=0、300、600、900、1200 mm²/s (依据设备成比例增长特性设置)。层厚5 mm，扫描层数4/6层，心电参数：RR interval：2/3(分别对应扫描层数4/6层)，Trigger window：20，Trigger Delay：Minimum，Inter-Seq Delay：Minimum；扩散参数：扩散方向：TENSOR，b值1200，Optimize TE；ASSET factor：2，扩散采集方向：*3；自由均匀呼吸(呼吸节律一致)，平均扫描时间约1~2 min。

1.3　图像分析和数据处理

       (1)在ADW 4.2后处理工作站上，用Function tool软件中的ADC图进行图像后处理。(2)评价DWI信号强度特征和测量ADC值，选取病变ROI时，取病灶信号强度最大且最均匀的层面作测量，对于较均匀病灶所取病变ROI包括病灶最大径的60%以上，对于含空洞和毛玻璃成分的不均匀病灶，选取多个较小面积的ROI计算平均值，尽可能包括最大信号强度中心区域，每例不同b值的图像选用同样大小的ROI进行测量，ROI范围20~500 mm²。用测量一个系列中不同b值对应的13个不同等级的信号强度(SI)值，代入公式计算ADC值。ADC值计算公式为：ADC=-In(SIn1+SIn2+SIn3/SIm1+SIm2+SIm3)/(bn-bm)。m=0、n=300、600、900、1200 s/mm²，SI为DWI图测得的信号强度值，b为扩散敏感系数。(3)数据测量由两位有丰富MRI诊断经验的放射科医生在未知病理结果的情况下，独立测量，记录数据，取其平均值，作为计算ADC值的SI值。

1.4　病理分析

       (1)肺癌标本及染色：将手术切除标本在肿瘤实质的无坏死区取材，做石蜡包埋、切片、常规HE染色以及免疫组化染色。以4 μm层厚，连续切片5张，1张行HE染色，参照1999年WHO肺癌分类方法进行病理组织学分类。(2)病理切片分析：①肿瘤细胞密度分析，每个标本取两张病理切片(HE染色)，每个切片随机取5个视野(×200)，选取实质性肿瘤区域，尽量避开血管、坏死、炎性细胞及组织切片伪影。摄片后将彩色病理照片扫描入计算机。用Olympus imaging显微图像分析系统，Leica Qwin Plus分析软件经图像输入、图像增强、图像分割、图像二值化处理及图像识别及图像分析处理进行分析。在图像分析仪上勾画出视野内肿瘤细胞的面积，计算细胞的总面积占整个视野面积的平均百分比，计算公式为肿瘤细胞面积即面积密度=10个视野内细胞的面积/10个视野总面积×100%。②肿瘤核质比分析：每张切片随机选取5个视野(×200)，选取实质性肿瘤区域，尽量避开血管、坏死、炎性细胞及组织切片伪影，肿瘤组织细胞核显示为蓝色，细胞质及周围的胶质层为粉红色，以人工二值法将细胞核的蓝色区域标定为总核面积区域，勾画出视野内肿瘤细胞的面积，总胞质面积设定为总的细胞面积减去总核面积。肿瘤的核质比=总核面积/总胞质面积。每个肿瘤核质比为10张照片的平均值。

1.5　统计学分析

       采用SAS 9.13软件进行统计分析，定量资料用均数±标准差表示。非参数统计中的Pearson等级相关分析评价肺癌ADC值与肿瘤细胞密度、核质比、核胞比间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　肺癌不同b值对应的ADC值

       肺癌的ADC值随b值升高而下降，ADC值分别为(1.40±0.54)、(1.23±0.53)、(1.10±0.51)、(1.00±0.38)×10^-3 mm²/s (图1)。

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图1  女，63岁，右肺尖结节，中分化腺癌。A~M为多b值(b=0、300、600、900、1200 s/mm²，分别对应A、B~D、E~G、H~J、K~M) DWI图像，显示不同程度的高信号；N、O：横断面T1WI/T2WI分别显示稍低、稍高信号；P：病理图片，证实为腺癌(HE ×200)；Q：免疫组化图片分析Ki-67(10%阳性)
Fig. 1  Transverse MR images in 63 year old woman with moderately differentiated lung adenocarcinoma. (A—M) DW image obtained with diffusion gradient of 0, 300, 600, 900, 1200 s/mm² (A: b=0. B—D: b=300. E—G: b=600. H—J: b=900. K—M: b=1200 s/mm²) showed hyperintense nodule. N, O: Transverse T1/T2-weighted imaging showed slightly htpointende or hyperintense nodule in relation to skeletal muscle. P: Photomicrograph of the nodule showed adenocarcinoma (HE ×200). Q: Immunohistochemical photo showed Ki-67(10% positive).

2.2　ADC与肿瘤细胞密度、核质比、核胞比的相关性

       不同b值时46例手术肺癌的ADC值与肿瘤细胞密度相关性好，呈明显负性相关(b=300 s/mm²时，r=-0.792，绝对值最大，P<0.01)。b=300 s/mm²时，肺癌的ADC值与肿瘤细胞核质比相关性好，呈明显负性相关(b=300 s/mm²时，r=-0.739，P<0.01)。b=300 s/mm²时，肺癌的ADC值与肿瘤细胞核胞比相关性好，呈明显负性相关(b=300 s/mm²时，r=-0.607，P=0.0187)。可示任意b值时肺癌的ADC值与肿瘤细胞密度均呈负性相关关系(表1)，说明肿瘤细胞密度越高，核质比越大，ADC值越低。

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表1  肺癌ADC值与病理指标的相关性分析
Tab. 1  Correlation analysis between ADC and pathological indices of lung cancer

3　讨论

3.1　多b值DWI在肺癌中的应用

       MR扩散加权成像可以洞察组织微观结构，评价组织中水分子的扩散率，从而反映肿瘤的内部结构特征。ADC值可以反映肺癌的病理微状态，恶性肿瘤细胞繁殖旺盛，细胞密度高，细胞外间隙减少，同时细胞生物膜的限制和大分子物质如蛋白质对水分子的吸附作用也增强，这些因素综合作用阻止了恶性肿瘤内水分子的有效运动，限制了扩散，因而ADC值降低^[7,8]。

       大b值需要用较长的TE，对于肺部这样TE值较短的器官来说，图像的信噪比就会明显下降，同时随b值增大，图像伪影会增多，病灶的信号衰减更加明显，会使图像质量下降而影响观察；如果减小b值，图像的质量较好，但所得的扩散图像和ADC值就不能真实地反映组织内水分子的布朗运动^[8]。为了兼顾图像质量和减小血流灌注对ADC值的影响，需要平衡b值的选择。体部一般选用500或更高的b值成像，然而不同厂家设备不同，成像参数不同，很难统一，尤其在肺部的应用更有待于进一步探讨^[8,9,10,11]。

3.2　DWI与肺癌病理特征的相关性

       国内外对全身肿瘤行DWI研究，大多数结果均显示出ADC值和肿瘤细胞密度的负性相关性^{[1,2,3,4,5,6,12,13,14,15,16,17,18]}。有学者对兔VX2瘤行DWI扫描，结果显示ADC值和肿瘤细胞密度有显著负性相关性(r=-0.695，P=0.000)^[1]。VX2肿瘤不同时期的肿瘤细胞密度比较，21 d比14 d时密度增高，随时间的进展，肿瘤的ADC值降低。Liu等^[2]评价子宫颈肿瘤组织与正常宫颈的ADC值，显示子宫颈癌ADC与肿瘤细胞密度(r=-0.711，P=0.000)及宫颈癌分级(r=-0.778，P=0.000)有明显负性相关性。Barajas等^[3]中枢神经系统淋巴瘤，计算ADC值和肿瘤细胞密度，分析ADC与密度之间的相关性，并预测预后。肿瘤细胞密度高，ADC值低，恶性度高，预后差。Gibbs等^[4]对前列腺癌进行分析，结果表明ADC值，T2值与肿瘤细胞密度均存在负的相关性，ADC值可以作为一个有价值的预后因子，来提示前列腺的Gleason评分，从而预测其转移和侵袭性。Woodhams等^[5]乳腺黏液腺癌的ADC值高于良性病变和其他类型的乳腺恶性肿瘤，乳腺黏液腺癌的ADC值与细胞密度存在显著负性相关关系。

       本研究结果显示任意b值时肺癌的ADC值与肿瘤细胞密度呈明显负性相关(b=300 s/mm²时，相关系数最高，r=-0.792，绝对值最大，P<0.01)，与文献报道结果^{[1,2,3,4,5,6,9,10,11,12,13]}一致。b=300 s/mm²时，肺癌的ADC值与肿瘤细胞核质比和核胞比也呈明显负性相关(r=-0.739，P<0.01；-0.607，P=0.0187)。b=300 s/mm²时肺癌的ADC值与肿瘤细胞密度的相关性最好，表明我们的研究中300是对肺癌成像优化的b值，可能与高b值时肺组织质子密度低，DWI中图像伪影与变形较大有关。分析结果证明肿瘤细胞密度越高，核质比越大，ADC值越低；这由细胞内外两方面的因素决定：恶性肿瘤细胞数量增多、排列致密、胞外间隙减小致细胞外水分子运动减慢；肿瘤细胞内胞核增大、细胞器增多、胞浆减少致细胞内水分子运动减慢，以上均是其ADC值较低的重要原因^[8,11,12]。

       然而并非所有的肿瘤的ADC值均与细胞密度呈负相关，个别病例偏离较多，可能是由于在肿瘤细胞构成比以外还存在其他影响ADC值的因素，有待于进一步研究。Gauvain等^[6]在评价儿童恶性脑肿瘤与细胞构成的关系时发现1例髓母细胞瘤的ADC值与细胞构成相关性比较特殊，这种肿瘤表现为大的总核面积，而细胞数不多，但ADC值很低，这说明扩散受限可能与高的核质比有关，细胞构成的分析并不适用于所有的病例。Jenkinson等^[9]少突胶质细胞瘤的ADC值与肿瘤细胞密度不存在线性相关性，可能说明该类肿瘤与其他胶质瘤相比，其生物学分化不同，尽管细胞外间质可能比细胞密度对ADC值产生更大的影响。

       活体内低的ADC值代表水分子的自由扩散受限，可以推测在细胞密度高的肿瘤，半透膜高度浓聚，细胞内水分子的成分比细胞外空间更大程度决定ADC值^[8]。决定ADC值的因素，除了细胞密度外，还有其他因素，如大的异常的细胞核，占据细胞内的大量空间，减少了细胞内水分子自由扩散的空间。此外，细胞外的成分，如间质的密度，也可以影响水分子的扩散。

       本研究应用Olympus imaging显微图像分析系统，Leica Qwin Plus分析软件进行照片实时分析，定量测定了肺癌细胞的核质比，核胞比和肿瘤细胞密度，是通过HE染色切片显微镜下图像自动分析软件完成的，根据染色深浅的差异，测量出胞核和整个肿瘤细胞面积后，二者相减得出胞浆的面积，这样的测量存在一定的偏差，只是表达了细胞内水分子扩散的影响因素，但除了细胞构成外，还有其他影响DWI的因素，如细胞外间隙，如间质的黏滞性，分隔空间的屏障性，主动转运，微循环，及扩散范围的而观察等，核质比只可能说明扩散的屏障性及分子的拥挤程度，但不能用来解释其他的原因。

       DWI可区分坏死与残存有活力的肿瘤细胞。当肿瘤细胞存活时胞膜完好，可以阻止水分子的扩散运动。反之，细胞死后，胞膜破裂，无法阻止水分子扩散运动，此时水分子自由无阻。坏死区肿瘤组织信号强度较存活肿瘤组织区明显降低。因此，ADC值对肿瘤微病理状态的反映，可以在肿瘤大小出现变化之前，反映肿瘤早期在形态学改变之前的内部结构的微小变化，可以用来评价肿瘤治疗的疗效、评估肿瘤的预后和复发情况等，这在国内外的大量临床和动物实验中都得到了证实，肿瘤的活动性组织和坏死组织之间的ADC值存在差异^[10]。

       总之，本研究结果显示，肿瘤细胞密度大，核质比越高，细胞扩散受阻越显著，ADC值越低，ADC有望在肿瘤的分级和预后评估中可作为一个有用指标。