阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）好发于60岁以上人群，且患病率随着年龄的增大而增加。它越来越成为一种不仅影响老年人的生活质量，给社会及家庭造成了极大的痛苦和压力，并且对社会和经济造成巨大影响的疾病，所以对该疾病的早期诊断及治疗显得尤为重要。AD的主要神经病理学特征有脑萎缩，前脑、基底节、海马和大脑皮质的神经元丧失（neuronal loss）、细胞外淀粉样肽沉积（extracellular amyloid protein deposition）、老年斑（senile plaque，SP）、神经元胞浆内出现神经纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）^[1]。其中SP和NFT是AD临床确诊以及区别于其他类型痴呆的主要特征^[2]。AD最早发生在颞叶内侧，主要包括内嗅皮层、海马、海马旁回、杏仁核等，因此海马是MRS对AD研究的首选兴趣区。但海马位置较深，周围结构复杂，定位存在一定困难，且不易匀场，所以在体研究存在诸多局限性。本实验采用9.4 T高场强高分辨率离体型磁共振频谱研究小鼠海马的代谢物变化。不仅克服了上述诸多问题，且可以更加全面和客观的反映更多的代谢物变化。

1　材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1　动物

       3月龄昆明小鼠20只，体重为（30±2） g，雌雄各半，由广东省医学动物实验中心提供，清洁级。实验过程中动物饲养及取材均遵守实验动物管理和保护的有关规定^[3]。饲料由汕头大学医学院实验动物中心提供，自由摄食和饮水，自然昼夜节律光照，室内温度控制在18~22℃，相对湿度为60%～70%。

1.1.2　主要试剂

       亚硝酸钠（天津市科密欧化学试剂开发中心）；D-半乳糖（广东光华化学有限公司）；2，2，3，3-D4-3（三甲基硅基）丙酸钠(TMSP)（青岛腾龙微波科技有限公司）。

1.1.3　主要试验仪器及软件

       超低温冰箱（美国NBS公司）；高速台式低温离心机（德国-Eppendorf）冻干浓缩一体机（美国LABCONCO公司）；9.4 T液态高分辨率磁共振扫描仪（德国Bruker公司）；组织匀浆机（美国PRO Scientific公司）；Morris水迷宫DigBehv系统由汕头大学医学院精神卫生中心提供；MestRe-C 4.3（Mestrelab Research公司开发）。

1.2　实验方法

1.2.1　试验动物分组及造模型

       昆明小鼠常规饲养2周后，进行编号标记并随机分为2组：模型组及对照组，每组各10只。模型组小鼠连续60天颈背部皮下注射D-半乳糖120 mg/（kg.d）及亚硝酸钠90 mg/(kg.d)^[4]；对照组小鼠在相同时间注射同等剂量的0.9％生理盐水。

1.2.2　行为学测试

       实验动物打药后24 h，将全部小鼠进行Morris水迷宫测试，包括定向航行试验（place navigation test）及空间搜索试验（spatial probe test）。

       定向航行试验：用于测试动物在水迷宫中的学习和记忆能力，历时4 d。试验前一天小鼠自由游泳2 min，以熟悉环境。正式实验每天训练4次，每次间隔20 s，随机从东、西、南、北4个入水点选择一个，将小鼠面向池壁放入水中，记录动物寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期(escaping latency)。如果小鼠在120 s内未找到平台，逃避潜伏期记为120 s，由实验者将其引至平台停留10 s（此种停留对在水中高度紧张的小鼠非常重要，它可避免小鼠再跳回水中，以保证实验的成功）。每次训练之间和4次训练完成后，迅速将小鼠洗净擦干，置于加热器旁，以防动物低体温。计算每天各组4次逃避潜伏期的平均值。

       空间搜索试验：用于测量小鼠对平台空间位置准确记忆，即记忆保持能力。第5天撤去平台，从任选一入水点将小鼠放人水中，动物在水中游泳120 s，测量120 s内：（1）小鼠在目标象限（原平台所在象限）的游泳距离百分比；(2)小鼠停留在目标象限的时间百分比。

1.2.3　脑标本的获取

       行为学测试1 h后，所有小鼠均断头处死并立即取出大脑。右半脑在冰袋上迅速将海马分离，用锡箔纸封存标记后浸入液氮中急冻，后移至-80 ℃低温冰箱保存直到进行磁共振数据测量所需样本处理。左半脑取后半部，迅速放入4％甲醛溶液中，12 h后做HE染色、Bielschowsky染色及刚果红染色进行对照。

1.2.4　离体型氢质子频谱对小鼠海马代谢物测定

       (1)组织粉碎：在通风实验室环境，将小鼠海马置于2 ml玻璃研磨器中，加入适量0.5 mmol/ml冰高氯酸溶液，研磨直至脑组织完全粉碎，变成混悬液；(2)组织匀浆：混悬液用匀浆器匀浆，匀速为6000 r/min，时间为20 min，样本管外置于冰水浴中；(3)组织样本中和：匀浆后浑浊液滴加适量1 mmol/ml冰氢氧化钾进行中和，使混合液pH值为7.0；(4)高速离心去除杂质和盐离子：混合液中和后移至高速离心机中离心，去除高氯酸盐及组织匀浆后残渣，离心条件为10000×g，30 min，温度为4 ℃，离心后取上清液；(5)低温冻干样本：上清液置于真空，温度为-40 ℃的低温冻干机内冻干，时间以样本完全干燥为止（约2~3 d）；(6)将完全冻干的海马组织萃取物粉末，用精细天平称量5.0 mg，置于含有0.01 mmol/L的2，2，3，3-D4-（三甲基硅基）丙酸钠（TMSP）及重水（D2O） 500 ul的内径为5 mm的磁共振测试管中摇匀至完全溶解；TMSP的作用为内标准。D2O的作用是锁场。（7）将完全溶解均匀的样本管置于9.4 T Bruker Avance 400 MHz液态高分辨率磁共振扫描仪内进行检测，带宽为5000 Hz，采集数据点为4096，扫描次数为128次，总扫描时间为6 min。并使用机器自带的后处理软件XWINNMR（Bruker GmBH）对海马内多种代谢物进行初步处理。处理过程主要包括傅立叶转换、相位更正、基线更正及位移更正。代谢物的化学位移通过参照TMSP的位置确定。磁共振频谱数据通过MestRe-c 4.3进一步分析。

1.3　统计学分析

       利用SPSS15.0软件统计分析，数据采用均数±标准差（±s）表示，P<0.05表示差异有统计学意义。水迷宫定向航行实验中的逃避潜伏期采用多重测量的方差分析；空间搜索实验中在目标象限的游泳时间和游泳距离百分比采用单因素方差分析。

       磁共振频谱通过应用MestRe-c 4.3软件代谢物峰及TMSP分别进行峰下面积计算及积分处理。得到谱线如下图1所示。

       积分过程，使用软件自带的积分系统进行，首先选定要积分的峰及大概宽度的峰下平面，再通过软件积分系统中的积分调整系统对所积峰下平面进行微调，最后从数据库中读出峰下面积。

       各代谢物成分的浓度按照Serres等^[5]提出的修改后的公式1计算其浓度。不同组别样本的各种代谢物浓度通过t检验进行比较。

       代谢物浓度计算公式中，9代表TMSP提供的氢质子数目。

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图1  MestRe-c 4.3软件对正常小鼠海马代谢物及TMSP模拟谱线图
Fig. 1  Simulant spectra of normal mouse brain and TMSP by MestRe-c 4.3 software.

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2　结果

2.1　小鼠一般情况观察

       对照组小鼠精神状态佳，动作灵活，毛色光泽。模型组小鼠进食量减少，体重减轻，精神萎靡，行为退缩，无主动性及缺乏注意力，反应迟钝，活动范围小，喜扎堆，毛色萎黄、毛糙且无光泽。

2.2　行为学测试结果

       逃避潜伏期时间：从表1可知，两组小鼠均随着训练天数增加，逃避潜伏期总趋势不断缩短。重复测量的方差分析结果显示：(1)不同的天数之间各组逃避潜伏时间有显著差异，F=5.145，P<0.01；(2)不同组别之间的逃避潜伏时间有明显差异，F=7.436，P<0.05。结果表明，两组小鼠在历次学习训练中均己逐渐学习寻找平台，但学习记忆能力存在差异。

       单因素方差分析结果显示两组小鼠空间探索试验中，对照组在目标象限游泳距离及游泳时间百分比明显高于AD组，P值分别为0.009和0.016，有明显差异(P<0.05)，说明AD模型小鼠空间方位的记忆能力下降（表2）。

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表1  各组小鼠平均逃避潜伏期时间(s，±s)
Tab. 1  The average escape latency of mice in Morris water maze test(s，±s)

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表2  各组小鼠在目标象限内游泳距离及时间百分比(%，±s，n=19)
Tab. 2  The movement distance and time percentage of mice in the target quadrant (%，±s，n=19)

2.3　病理形态学检测结果

       HE染色：对照组海马锥体细胞呈多层规则排列，整齐而紧密，细胞周围组织结构完整，间隙无异常，细胞核清晰，核仁明显，胞浆着色均匀呈透亮或淡染，胞膜完整（图2A）；AD组锥体细胞排列紊乱，细胞周围组织疏松、水肿，与周围组织间隙增大，出现细胞死亡留下的空泡，可见多量细胞核深染、固缩，细胞浆强嗜酸性（图2B）。

       甲醇刚果红染色观察老年斑（SP）病理特征改变：对照组小鼠海马区域背景清晰干净，视野中未见刚果红染色阳性斑块，苏木素蓝染的细胞核；AD组小鼠海马区域可见刚果红染色后的桔红色沉积物，呈斑片状，系老年斑沉积（图3）。

       Bielschowsky嗜银染色法观察神经纤维缠结(NFT)病理特征改变：对照组小鼠大脑皮质及海马均未见神经纤维缠结(NFT)；AD组可见缠结变性的神经元纤维变粗或粗细不等，排列紊乱呈密集的团块状或纺织状遍布于胞质内，在轴突形成染色较深的拖尾形状（图4）。

       小鼠脑组织氢质子频谱位移图，如图5所示。各种常规的代谢物被磁共振频谱仪所探测出，根据以往的实验结果各代谢物相应的位移峰被定位如下：NAA：2.00 ppm；Glu：2.33~2.35 ppm；Cho：3.2 ppm ；mI：3.51~3.61 ppm。

       根据上述公式1，计算得出小鼠海马的代谢物浓度（表3）。模型组NAA、Cho及Glu较对照组均有不同程度的下降，mI浓度升高，组间比较存在统计学意义(P<0.05)。两组间代谢物频谱图的对比如图6所示。

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图2  A：正常对照组，海马神经元排列规则、紧密，形态完整；B：AD模型组，海马区神经元明显疏松，空泡形成(HE　×400)
图3  刚果红染色(　×400)。A，B均为AD模型组，在大脑皮层及海马区可见斑片状桔红色沉积物
图4  Bielschowsky嗜银染(　×400)，AD组海马区可见团块状神经元纤维缠结及皮层轴突形成拖尾征
Fig. 2  A: the neurons of control group were intact and arrange tightly.B: The model group has pyramidal neurons either presented a densely stained shrunken appearance with minimal cytoplasm or had disappeared (HE ×400).
Fig. 3  congored coloration (×400), in the cerebral cortex and hippocampal fields, orange amylaceous aggradation can be seen.
Fig. 4  Bielschowsky silver impregnation (×400), in the hippocampal fields of AD model group has many neurofibrillary tangles, and neuropil threads are stained.

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图5  小鼠海马代谢物¹H-MRS. A：1.3~2.8 ppm；B：2.8~4.4 ppm
Fig. 5  ¹H-MRS of mice hippocampus. A: 1.3—2.8 ppm. B: 2.8~4.4 ppm.

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图6  模型组与对照组海马高分辨率磁共振代谢频谱图对照。A为对照组频谱图，B为模型组频谱图，可见模型组海马的NAA、Cho及Glu较对照组下降，mI升高
Fig. 6  Comparison of high resolution proton spectra of hippocampus in control group and model group. A: Control group. B: Model group. The hippocampal concentrations of NAA, Cho, Glu are decrease and mI concentration is increase.

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表3  小鼠海马代谢物浓度(μmol/L，±s)
Tab. 3  The concentration of metabolites in mice hippocampus (μmol/L，±s)

3　讨论

3.1　谷氨酸的代谢与AD

       谷氨酸是哺乳类动物中枢神经系统内重要的兴奋性递质之一，大部分神经细胞以谷氨酸作为化学信使物质。谷氨酸的代谢和释放、摄取过程的异常，造成兴奋性冲动的传递障碍或过量递质对突触后膜受体的过度刺激，导致神经兴奋性中毒。Bell等发现在AD患者脑组织中谷氨酸能系统正常结构发生改变，谷氨酸转运体及谷氨酸重摄取的功能下降。

       突触是神经元之间结构和功能的接触点，它的结构和功能的完整对于保证神经元获得信息并进行信息传递、加工和信息贮存的顺利进行是非常重要的^[6]。Bertoni-Freddari等^[7]研究表明：衰老大鼠及老年人尤其是AD患者，海马CA1区突触数密度和面密度显著下降。突触丧失引起的缺陷，以致突触数密度和面积密度下降，总体上影响突触的功能，导致学习记忆障碍，是AD学习记忆减退的神经机制之一。

       本实验结果显示模型组小鼠海马Glu浓度较正常对照组明显减少，即可能与AD时离子型谷氨酸受体介导的兴奋性毒性作用及受体突触数目减少、结构退变，造成Glu代谢减退、传递功效下降（摄取、释放减弱）有直接关系。

3.2　胆碱复合物（Cho）与AD

       胆碱复合物其来源包括游离胆碱（Cho）、甘油磷酸胆碱（GPC）及磷酸胆碱（PC）^[8]。胆碱是乙酞胆碱和细胞膜磷脂酞胆碱的前体，参与生物膜的构成和髓鞘的形成，是细胞膜磷脂代谢的成分之一，反映细胞膜的运转。以往就AD病人的Cho含量变化检测存在较多争议。有作者发现脑内各部Cho含量增加^[9]，有人却未发现Cho含量改变^[10]，或Cho含量的降低^[11]。造成上述结果原因可能有：¹H-MRS Cho测量的准确性较低，皮质区Cho的信号强度较弱；一些多体素研究发现AD病人皮层下灰质Cho的变化较为明显，而这些部位不一定被列入研究范围；健康的老年人，脑内Cho代谢较快，含量会随时间而变化；此外TE的选择也会影响Cho含量的测量。基于在体研究的一些局限性，笔者采用了离体检测方法，对小鼠海马区的代谢物变化进行研究，探索在AD发生时Cho的变化趋势，为今后的临床诊断以及对AD病变的进一步认识提供依据。结合我们的研究结果发现，在3.2 ppm处，模型组小鼠Cho的浓度较对照组明显减少，且具有统计学意义。

3.3　其他代谢物的变化

       N-乙酰天门冬氨酸(NAA) ：NAA是神经／轴索密度和异型性的标志物^[12]。尽管NAA在脑内的浓度很高，但是到目前为止，其具体作用尚不明确。其水平反映了神经元及轴突的完整性，神经轴突损伤或神经功能失常带来的神经系统紊乱一般都会导致NAA水平的下降^[13]。目前在AD的研究中认为灰质NAA水平反映了神经元缺失和代谢状态的改变，白质内NAA浓度减低反映轴索损伤。大多数研究都发现在AD病变明显的脑区（系列性MRI容积测量显示进行性局部脑萎缩的结构），例如颞叶内侧、内嗅皮质、海马和边缘叶系统在AD确诊之前就可以出现NAA的降低，与正常人相比，平均降低10％左右，而视觉皮质、运动区、感觉区的NAA水平降低只有在病变后期才开始出现，这也就是本实验选择海马区作为研究的感兴趣区的原因所在。在以往的研究中，AD病人NAA浓度较正常对照组低，具有统计学差异^[9]，且有一致性，本实验结果也印证了这一结论。Shiino等^[14]认为AD病人NAA的降低可能不只是反映神经元数量的减少，更可能是反映神经元功能的衰退。结合本研究结果进一步推断AD小鼠NAA下降还可能是神经元纤维缠绕，老年斑和神经元缺失及功能衰退的结果。

       肌醇(mI)：其70％直接来自游离肌醇，30%来自磷酸肌醇。mI只存在于胶质细胞中，其作用主要是维持神经胶质细胞渗透压、营养细胞，抗氧化及生成表面活性物质，是神经胶质细胞的标志，常常参与对荷尔蒙敏感的神经传导活动。本研究结果显示AD小鼠海马有mI的增加，但其增加的原因尚不完全清楚，可能与以下几点^[15]有关：(1) mI的增加代表神经胶质的增生，AD有神经元缺失，神经胶质反应性增生，因此mI增高，维持相对增大增多的神经胶质。(2) AD小鼠和海马有广泛神经元缺失，并伴有胆碱能、5-羟色胺能和肾上腺素能递质系统障碍，毒覃碱样胆碱能受体和α-肾上腺素能受体激活时多伴有磷酸肌醇的水解。因此为了维持受体的功能必须加速从肌醇等物质再合成磷脂酰肌醇的过程，因而AD患者脑内肌醇水平较高。(3) AD可能有将肌醇转换为磷酸肌醇的抑制酶的增加，导致肌醇增加。肌醇增高支持AD有多磷酸肌醇的第二信使的改变，为研究肌醇-多磷酸肌醇-磷脂酰肌醇的代谢及兴奋性氨基酸环路提供了新的方向。

       肌酸（Cr）：主要包括Cr和PC，作为高能磷酸化的储备以及ATP和ADP的缓冲剂，可能对维持脑细胞中的能量依赖系统发挥作用。Cr参与细胞的能量代谢，当细胞能量消耗增多或由于缺血、缺氧引起能量产生障碍时，PC分解为Cr同时释放ATP，补充细胞的能量。若缺血、缺氧进一步加重，则引起ATP下降，导致细胞膜钠、钾代谢异常。在活体¹H-MRS检测中，Cr和PC中的-CH3基团会共同形成一个单峰，称为总肌酸。在9.4 T ¹H-MRS中，由于磁场强度的极大提高及磁场的均匀性更加一致，频谱分辨率极大提高，可以区分出这两种代谢物峰。Pfeuffer等^[16]在9.4 T高分辨率磁共振频谱中，分别测出脑内PC和Cr的浓度值。尽管文献报道Cr和PCr在脑组织中的含量不是恒定的，但总Cr在同一个体脑内不同代谢条件下是保持稳定的，故总Cr常作为在体¹H-MRS代谢物研究的内参照标准来评价其他代谢物浓度的变化趋势。

       综上所述，笔者采用液态离体型磁共振频谱对AD小鼠的海马代谢物变化进行分析，因为在体研究病源较难得到，而且场强低，对于海马及周围的复杂结构不易匀场，而在这方面的研究国内外报道甚少。谷氨酸是脑内兴奋性神经递质，参与神经元通讯、神经可塑性及神经病理异常等一系列病理生理过程。现在有很多学者研究突触、谷氨酸受体与AD的关系，得到的结论是在AD中谷氨酸受体及突触的功能降低，数量减少。笔者从代谢物的角度出发研究AD所发生的变化，发现小鼠海马谷氨酸是降低的，既从某种角度上印证了他们的结论，又为其更深入的研究提供了新的技术与视角。胆碱复合物不但成分复杂，而且易受代谢的影响，在前人的研究中存在颇多争议。本研究结果显示，小鼠海马胆碱复合物的浓度明显降低，究其原因还需要大量的实验来给予合理的解释。

       随着世界范围内人口老龄化问题的加剧，AD将越来越受到重视。对动物的研究，其最终目的还是希望能在这种疾病发生之前就采取必要的预防措施，或是研制出有针对性的药物对它进行有效的治疗，来提高老年人的晚年生活质量。临床上已经有对早期AD（MCI）研究的一些报道^[17]，但是很多方面未达成一致。如果能进一步利用动物模型对早期AD进行研究并得出一些有益的成果，那必将使临床对该病早期治疗提高到一个新的高度。