γ-氨基丁酸是大脑内最主要的抑制性神经递质，它的功能可能涉及中枢神经系统几乎所有信号处理的过程，并且其浓度可能在许多中枢神经系统疾病中发生改变，如抑郁、癫痫、AD及精神分裂等病症^[1,2,3]。如果能运用影像学技术检测其浓度改变，将对此类疾病的预防、诊断起到非常重要的作用，并能有利于探究疾病的发生、发展、预后以及评价药物疗效等。磁共振成像（MRI）是一种非侵入性的成像技术，传统的T1、T2成像能提供精致的结构细节，但难以进行临床的功能和生化评估。磁共振波谱（MRS）可以对许多代谢物进行探测^[4,5,6,7]，但由于分辨率的限制无法精确显示解剖结构，且因为γ-氨基丁酸与其他代谢物共振峰重叠，在谱线上无法获得单一的γ-氨基丁酸信号^[8]。化学交换饱和转移(CEST)成像是一种目前广受关注的MRI新方法^[9]，通过CEST成像可间接探测机体多种代谢物，如蛋白质、脂质、糖原、酶甚至基因等^[10,11]，也可探测各种机体内环境变化，包括酸碱度、温度等的变化^[12,13]，且获得的图像具有良好的时空分辨率。以往的实验对大脑中的代谢物如谷氨酸、肌酸及肌醇等进行了CEST成像^{[14,15,16,17]}，但对γ-氨基丁酸的研究较少，本研究运用该新的MRI方法，基于CEST原理对γ-氨基丁酸进行了特异成像，获得了γ-氨基丁酸的CEST图，探讨了γ-氨基丁酸的CEST效应与浓度的关系，并对其他多种代谢物的影响进行了初步研究。

1　材料与方法

1.1　模型建立

       γ-氨基丁酸及其他代谢物试管模型的建立：先用去离子水及PBS溶液配制浓度分别为2、10、20、30 mmol/L及50 mmol/L的γ-氨基丁酸溶液，在pH监测下，对所配溶液进行酸碱统一滴定至室温下pH为7.0，溶液用10 ml试管分装。同样的方法获得浓度均为50 mmol/L的谷氨酸、肌醇、肌酸及胆碱溶液，室温下pH统一为7.0，用10 ml试管分装。另外用去离子水配制1％的琼脂糖，将含有上述各代谢物的试管固定在琼脂糖中，以消除试管周边空气所带来的磁化率伪影，增加扫描时的磁场均匀性。

1.2　磁共振成像

       实验均在安捷伦7.0 T动物磁共振扫描仪(Agilent、USA、孔径160 mm)上完成，运用标准体线圈进行发射与接收。本研究采用目前国际公认的利用连续波进行预饱和并使用平面回波技术采集的化学交换饱和转移成像序列(EPI-CEST)。

1.2.1　Z谱扫描

       在代谢物试管中，使用点分辨波谱(PRESS)的方法在连续波预饱和下采集体素内水信号强度，已探索CEST效应的对应偏置频率及其最近预饱和能量。先对50 mmol/L的γ-氨基丁酸溶液进行Z谱扫描，改变预饱和能量B1值从0.5 μT到8.0 μT递增，递增幅度为0.5 μT，持续时间始终为3 s，从而获得不同B1值时的γ-氨基丁酸Z谱图。获取其他代谢物的Z谱图时，预饱和能量B1值均为6 μT，持续时间为3 s。获取γ-氨基丁酸、谷氨酸及胆碱的Z谱图，偏置频率范围设为从－6 ppm到6 ppm，间隔约为0.25 ppm；而获取肌酸及肌醇的Z谱图，偏置频率范围设为从－5 ppm到5 ppm，间隔约为0.2 ppm，均采集49幅图像^[18]。其他所使用的扫描参数如下：TR 4000 ms，TE 15 ms，Averages为1，VOI 7.0 mm × 9.0 mm × 10.0 mm，扫描时间3 min 24 s。

1.2.2　CEST图像的获取

       获取不同浓度γ-氨基丁酸溶液及其他代谢物溶液的CEST图，预饱和能量B1值均为4.7 μT，持续时间为5 s，所使用的扫描参数如下：TR 6000 ms，TE 237 ms，层厚1 mm，Averages为32，FOV 64 mm ×64 mm，Matrix为64×64，扫描时间9 min 37 s。CEST图像通过非对称性分析获得，即获取3幅图像，1幅未加预饱和的图像I0，1幅在标记位置(－2.75 ppm)加入预饱和的图像Iref，1幅在标记位置相对于水对称的位置(2.75 ppm)加入预饱和的图像Ilib。CEST图的获取使用计算公式如下^[11]：

       ICEST=(Iref-Ilib)/Iref

       特别需要强调的是，每次扫描前都对水的中心频率进行校正。

1.3　数据处理

       所有数据处理及分析在MATLAB上进行，Z谱的绘制方法如下：在不同偏置频率的每一副图像除以预饱和脉冲在300 ppm的图像（由于偏离位置离水峰很远，其CEST效应可以忽略，即相当于未加MT预饱和的图像），所得的图像选取同样的坐标范围，计算其平均信号强度，以偏置频率为横坐标，以平均信号强度为纵坐标，做出散点图，再通过曲线光滑拟合，绘制Z谱图。Z谱非对称曲线的获得：在Z谱上以中心处水为对称点，将高于水的不同偏置频率处获得的磁化信号强度依次对称减去另一侧不同偏置频率处获得的磁化信号强度^[19]。CEST图像计算公式同前。

2　结果

2.1　γ-氨基丁酸的CEST成像结果

       在γ-氨基丁酸的Z谱图上可以观察到清晰的CEST峰值围绕在低于自由水共振频率2.75 ppm的部位，Z谱非对称曲线显示在距自由水共振频率1 ppm到4 ppm范围内有广泛的CEST效应，最高峰位于2.75 ppm位置。当逐步增加预饱和能量B1值时，γ-氨基丁酸的CEST效应随之增大，但当B1值大于6 μT时该效应不再增加。设置B1值为4.7 μT，持续时间为5 s，在pH为7浓度不同的γ-氨基丁酸CEST图上显示γ-氨基丁酸的信号强度随其浓度增加而增强。在本研究成像参数条件下，每增加1 mmol γ-氨基丁酸可以观察到CEST效应增加0.58%（图1,图2,图3）。

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图1  γ-氨基丁酸的CEST效应。A：pH为7.0浓度为50 mmol/L的γ-氨基丁酸试管MRI，体素大小为7.0 mm × 9.0 mm × 10.0 mm；B：在γ-氨基丁酸的Z谱图上可以观察到清晰的CEST峰值围绕在低于自由水共振频率2.75 ppm的部位；C：由B所得的Z谱非对称曲线显示在距自由水共振频率1 ppm到4 ppm范围内有广泛的CEST效应
图2  预饱和能量B1对CEST效应的影响。A：在不同预饱和能量B1值条件下获得的50 mmol/L γ-氨基丁酸的Z谱非对称曲线；B：γ-氨基丁酸的CEST效应随着B1值的增大而增加，在6.0 μT(255 Hz)下达到最大值
图3  不同浓度γ-氨基丁酸溶液的CEST成像（pH 7.0）。A：γ-氨基丁酸的原始CEST成像图显示明显的CEST对比，图像由连续波脉冲饱和获得，预饱和能量B1设置为4.7 μT，持续时间为5 s；B：由A伪彩获得；C：γ-氨基丁酸的CEST效应与浓度呈线性正比关系，每增加1 mmol γ-氨基丁酸可以观察到CEST效应增加0.58％
图4  其他代谢物谷氨酸、肌醇、肌酸及胆碱的Z谱图均在不同偏置频率处观察到明显的CEST效应
Fig. 1  The CEST effect of GABA. A: Image from a phantom of 50 mM GABA (pH 7.0) with the localization voxel indicated. B: Z-spectra of 50 mmol/L GABA at pH 7.0 showed the CEST effect at 2.75 ppm downfield to bulk water resonance. C: CEST asymmetry curves from the same solutions corresponding to B exhibited a broad CEST effect ranging from 1 to 4 ppm from bulk water resonance.
Fig. 2  CEST effect dependence on B1 amplitude. A: CEST asymmetry curves from 50 mmol/L GABA (pH 7.0) at different B1 amplitude. B: The CEST effect of GABA increased with B1 amplitude and kept steady after the B1 reached 6.0 μT.
Fig. 3  CEST images of a phantom consisting of test tubes with different concentrations of GABA solutions (pH 7.0) immersed in a beaker containing PBS. A: Showed the CEST contrast on the original CEST image (2.75 ppm), acquired with application of saturation continuous wave with B1 amplitude = 4.7 μT (200Hz) for 5 s. B: Showed the CEST contrast color-coded on a. Color bar represents CEST contrast of GABA in percentage. C: Approximately linear dependence of GABACEST effect on GABA concentration with a slope of 0.58% mM-1 GABA.
Fig. 4  Z-spectra of 50 mM other metabolites (glutamate, myo-inositol, creatine and choline) acquired at pH 7.0 showed their CEST effects at different frequency downfield to bulk water resonance.

2.2　其他代谢物的影响

       在其他代谢物谷氨酸、肌醇、肌酸及胆碱的Z谱图上均观察到明显的CEST效应，谷氨酸、肌醇、肌酸及胆碱的CEST峰值分别位于偏离水峰3.0、1.56、2.22 ppm及0.5 ppm的部位（图4）。当B1值设置为4.7 μT，持续时间为5 s时，在2.75 ppm处对各代谢物进行的CEST成像主要为γ-氨基丁酸的CEST效应，而其他代谢物仅显示来自谷氨酸的部分贡献，其余几乎不显影。

3　讨论

       本研究运用的是一种无创、无放射性、高时空分辨率的的基于CEST的成像新方法，在Z谱图上2.75 ppm处探测到了清晰的γ-氨基丁酸CEST效应，所用γ-氨基丁酸CEST成像序列为EPI-CEST序列，在平面回波脉冲前加入一个特定的预饱和脉冲，脉冲频率偏离水共振频率2.75 ppm，对γ-氨基丁酸进行充分的预饱和，这种饱和通过化学交换，进一步影响自由水的信号强度，因此，通过EPI检测水的信号，便可间接反映这种物质的信息^[20]。与传统MRI方法相比，CEST成像具有以下优势：(1)具有良好的空间分辨率，其解剖结构清晰，接近常规磁共振图像，这一点明显优越于MRS成像。(2)无需使用外源性对比剂，不仅可以自然地反映组织本征的生理病理信息，还可以避免对比剂带来的各种不良反应。(3)具有良好的可"开关"性，因为通过预饱和脉冲激发，可以根据需要随时开关。

       在不同浓度的γ-氨基丁酸CEST图上观察到γ-氨基丁酸的信号强度随其浓度的增加而增大，所得数据通过线性回归分析示γ-氨基丁酸的CEST效应与浓度呈线性正比关系，R2值为0.9059，具有良好的相关性，γ-氨基丁酸所表现的浓度依赖性CEST效应提示获得在体的γ-氨基丁酸浓度分布结构图具有可行性。但以往的研究结果表明CEST成像受诸多因素影响，如成像参数预饱和能量B1值及饱和时间均可影响CEST效应的大小^[18]，这与本实验结果相一致，预饱和能量B1值的增加在一定范围内增大γ-氨基丁酸的CEST效应，但当B1值大于6 μT时，γ-氨基丁酸的CEST效应不再增加，本研究获得的最优参数预饱和能量B1值为6 μT。在谷氨酸、肌醇、肌酸及胆碱的Z谱图上均观察到明显的CEST峰值，但偏置频率位置与之前的文献结果存在轻微差异^{[15, 17,18]}，这一现象一方面说明预饱和能量B1值具有非常关键的影响，直接影响CEST效应的存在与位置；另一方面，由于试管微环境的不同，比如pH的不同^{[18, 21]} ，其代谢物化学交换会出现变化，但总体趋势是一致的。另外值得注意的是在0.5 ppm处观察到的胆碱的CEST效应，这是首次提出胆碱CEST效应的存在，胆碱作为细胞膜翻转的标志物，其浓度升高可发生于肿瘤、炎症及慢性缺氧，浓度减低见于卒中、脑病等，若能用CEST技术对其进行成像，将利于临床对上述疾病的诊断。为了解其他代谢物对γ-氨基丁酸CEST效应的影响，在2.75 ppm处对各代谢物进行了CEST成像，结果显示除了来自谷氨酸的部分贡献，其他代谢物的影响可以忽略不计，这可能由于其他代谢物可交换质子的偏置频率均离γ-氨基丁酸的偏置频率较远，在本实验条件下未观察到CEST效应^[18]。

       γ-氨基丁酸是大脑内最主要的抑制性神经递质，其浓度在许多中枢神经系统疾病中均发生改变，故能在生化代谢水平检查到这些疾病中γ-氨基丁酸浓度的变化显得意义重大。MRS可有效地对人体的一些代谢物进行在体测量，但是由于临床磁共振机器磁场强度低，且γ-氨基丁酸在人体内的浓度很低，特别是其他具有更高浓度的代谢物，如肌酸、胆碱等，与γ-氨基丁酸的谱线的共振峰具有很强的重叠，加之受到采集时间、大分子物质和水峰等因素的影响，一直以来，人们很难准确地对γ-氨基丁酸信号进行直接观测^[21]。本研究运用一种无创、无放射性及高时空分辨率的MRI新方法基于CEST对γ-氨基丁酸进行成像，所得γ-氨基丁酸CEST图示γ-氨基丁酸的信号强度与浓度呈线性正比关系，且除了来自谷氨酸的部分贡献，其他代谢物对γ-氨基丁酸CEST效应的影响可以忽略不计，提示获得在体的γ-氨基丁酸浓度分布结构图具有可行性。