肝外胆管癌（extrahepatic cholangiocarcinoma, EHCC）是引起胆道梗阻较常见的疾病，根据恶性程度不同，分为高、中、低分化胆管腺癌，三者的治疗及预后不同，因此术前准确的分级对于合理选择治疗方案、评估预后具有重要的意义。EHCC组织结构复杂，在肿瘤恶变过程中，肿瘤细胞增殖，新鲜血管生成以及肿瘤细胞坏死等病理学的改变引起了肿瘤组织微观结构的变化。

       扩散峰度成像（diffusion kurtosis imaging, DKI）基于非高斯扩散理论，于2005年由纽约大学Jensen教授提出并由吴学奎等对相关参数进行了完善^[1,2,3]。非高斯扩散理论认识到组织中水分子由于细胞结构的复杂性呈现非高斯扩散运动。DKI通过二阶三维扩散张量联合四阶三维峰度张量来描述水分子的运动^[2,3]，所谓的"峰度"是一个无量纲值，用来量化真实水分子扩散位移偏离理想高斯分布扩散位移的"度"，即描述水分子扩散受限程度、扩散的不均质性。与传统扩散成像单指数模型相比，能够更准确的反映组织微观结构。

       目前，DKI在腹部成像中主要应用于肝、肾、前列腺等脏器^[4,5,6,7]，未见将DKI用于肝外胆管病变的研究。在将全身DKI与全身DWI比较的研究中^[8]，认为DKI适用于全身MRI，并且通常能精确描述组织扩散信息，反映组织微观结构。

       本研究旨在探讨DKI参数值在不同级别EHCC中的变化，对肿瘤的分级价值进行初步应用研究。

1　材料与方法

1.1　临床资料

       本部分采用前瞻性研究方法。纳入标准为：临床疑诊EHCC患者，有计划行MRI检查（包括常规平扫和DKI序列）及手术治疗，且检查与手术间隔期间未行任何其他相关治疗。排除标准：(1)病理证实为非肝外胆管腺癌或病理示高-中分化、中-低分化等混合型胆管腺癌或伴印戒细胞癌、肉瘤样变等；(2）经呼吸训练后患者仍配合不佳，图像伪影重，影响观察及后处理；(3)病灶太小，未能划取感兴趣区。研究选取2014年4月至2015年2月在南京医科大学附属无锡人民医院就诊、满足条件、成功完成各项检查的患者35例，入组患者基本情况：男21例，女14例，年龄35~80岁，中位年龄65岁，行MRI检查与手术间隔时间为1~36 d，中位时间12 d。临床症状多为上腹部隐痛不适伴黄疸，部分尚伴有发热、乏力、纳差、消瘦等，有2例表现为无痛性进行性黄疸，另有2例仅表现为上腹部疼痛，实验室检查：肿瘤标志物CA199多数不同程度升高，部分伴CA125和或癌胚抗原升高，其中仅有1例实验室检查肿瘤标志物均正常。

1.2　检查方法

       采用德国Siemens公司生产的3.0 T MR成像仪(Magnetom Trio Tim)，体部相控阵线圈，采取头先进仰卧位，所有患者检查前均禁食6~8 h，并接受均匀呼吸和屏气训练，总扫描时间约为12 min。

       常规MRI：扫描序列包括横断面T1WI正反相位GRE序列：TR 245 ms, TE 4.87/2.37 ms, FA 70°，层厚5 mm、层间距1.5 mm、FOV 350 mm×396 mm、矩阵320×175，冠状面T2WI HASTE序列：TR 1400 ms, TE 92 ms、FA 180°，层厚5 mm，层间距1.5 mm, FOV 400 mm×450 mm，矩阵256 mm×256 mm，横断面T2WI TSE序列：TR 3954 ms, TE 98 ms, FA 160°，层厚5 mm，层间距1.5 mm, FOV 350 mm×396 mm，矩阵384×202。扫描范围从膈顶至肝下缘，包括全肝及肝内外胆胰管系统。

       DKI序列扫描：采用单次激发自旋回波平面回波成像序列：TR 3300 ms, TE 88 ms, FA 90°，层厚5 mm，层间距1.5 mm, FOV 380 mm×420 mm，矩阵168 mm×105 mm, NEX 5; b值取（0、600、1200、1800、2400 s/mm²)，每个b值均施加15个方向的扩散敏感梯度场。研究表明^{[1, 9,10,11]}, DKI至少需要3个不同的b值和15个梯度方向，且当DKI选取的最大b值位于2000~3000 s/mm²之间时，所获得的K值对于非高斯分布的水分子扩散具有足够的敏感性，因此笔者采用与之前研究类似的b值，最大b值取2400 s/mm²。

1.3　组织病理学方法

       手术标本经10％中性福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋、厚4 μm连续切片，选取肝外胆管癌实质及癌周组织，行HE及免疫组织化学方法染色，依次采用低( ×40)、中( ×100)、高( ×400）倍光镜观察。按照消化系统肿瘤WHO分类（第四版）分级法，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级，主要特征如下：Ⅰ级，高分化管状腺癌，伴或不伴微乳头结构，成片的立方或柱状上皮细胞呈蜂窝样外观，细胞核圆或偏向一侧，染色质细腻，核仁小至不明显，胞浆丰富，花边状或空泡状；Ⅱ级，中分化腺癌由中度变形的融合成筛状的腺管，和（或）条索状结构组成，Ⅲ级：低分化癌的变形的腺管或条索状结构具有显著的细胞多形性，可见深染的胞浆和明显的细胞界限等鳞状上皮的特征。

1.4　磁共振图像后处理

       DKI图像后处理软件由西门子公司提供。所需MR图像以DICOM格式存储，后处理过程基于扩散峰度成像模型，根据DKI理论^[2,3]，S= S0·exp(-bD＋b²·D²·K/6），其中，K代表平均峰度(mean kurtosis, MK)；D值代表经过非高斯分布校正过的平均ADC值。

       将DKI序列扫描所得DKI图像导入后处理软件dkiMain，经过calculate处理，生成代表扩散信息的D、K、meanDWI参数图像（图1，图2，图3)；在病灶显示最清晰的参数图像上观察病变的大小、形态、范围、边界、信号等，划取感兴趣区（region of interest, ROI)，软件自动将ROI放置在参数图同一层面、同一位置。ROI选取病灶最大层面，避开内部坏死囊变区、邻近血管及胆管，选取病灶实性部分较大范围ROI。为减少误差，所有ROI选取由同一医师操作，每例各放置三次不同位置ROI，同一患者范围选取尽量保持一致。所有病灶ROI面积范围为2.46~31.54 cm²，平均（8.83± 6.17) cm²；测量并记录三次平均D、K值，对照病理结果进行研究，分析相应参数值的差异及其与病理分级的相关性。

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图1  男，63岁，中上腹隐痛不适伴巩膜黄染2周。临床诊断：阻塞性黄疸。行胆管癌根治切除术，术后病理示：胆总管中段高分化腺癌。K、D值分别为：0.31，1.59×10^-3 mm²/s（箭)
图2  女，72岁。中上腹不适伴皮肤巩膜黄染20 d。临床诊断：阻塞性黄疸，肝门部占位。行肝门部胆管癌根治切除术，术后病理示：肝门部中分化胆管腺癌。K、D值分别为0.46和1.54×10^-3mm²/s（箭)
图3  男，75岁。上腹不适、目黄、尿黄伴消瘦半月。临床诊断：黄疸待查。行肝门部胆管癌姑息性切除术（剖腹探查、肝门部结节切除活检术），术后病理示：肝门部低分化胆管腺癌。K、D值分别为：0.67和1.31×10^-3 mm²/s（箭)
Fig. 1  MR images of a 63-year-old man with an surgically verified EHCC of grade Ⅰ. D and K were parametric maps calculated from diffusion-kurtosis imaging data. The calculated values of D and K for the manually drawn ROIs for the EHCC were 0.31, 1.59×10^-3 mm²/s, respectively (arrow).
Fig. 2  MR images of a 72-year-old female with an surgically verified EHCC of grade Ⅱ. D and K were parametric maps calculated from diffusion-kurtosis imaging data. The calculated values of D and K for the manually drawn ROIs for the EHCC were 0.46, 1.54×10^-3 mm²/s, respectively (arrow).
Fig. 3  MR images of a 72-year-old female with an surgically verified EHCC of grade Ⅱ. D and K were parametric maps calculated from diffusion-kurtosis imaging data. The calculated values of D and K for the manually drawn ROIs for the EHCC were 0.67, 1.31×10^-3 mm²/s, respectively (arrow).

1.5　统计学方法

       所有数据采用SPSS 19.0软件包进行统计分析。计量数据以均数±标准差表示。采用Spearman秩相关分析各参数与病理分级的相关性；应用ROC曲线，比较参数诊断效能。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　EHCC影像学表现

       35例EHCC，其中22例肝门部胆管癌，13例远端胆总管癌。肝门部胆管癌多表现为肝门区域结构不清伴软组织肿块影，呈规则或不规则类圆形，边界较清晰，T1WI病灶呈欠均匀低信号，T2WI呈不均质高信号或等信号影；DKI示病灶在低信号背景衬托下表现为均匀或不均匀高信号影。远端胆总管癌，常规序列显示胆总管走行区异常软组织肿块或结节，T1WI为低或稍低信号，T2WI为稍高信号，部分仅表现为管壁增厚，管腔狭窄，或结石样等低信号，形态不规则；DKI示病灶表现为高或稍高信号影，境界尚清。EHCC均导致梗阻端以上肝内外胆管轻、中度扩张。

2.2　EHCC病理结果

       Ⅰ级11例，病灶ROI平均面积约为（9.49± 5.09) cm² (2.46~18.49 cm²)；Ⅱ级11例，ROI平均面积为（7.09±3.76) cm² (3.08~14.22 cm²) ，Ⅲ级13例，ROI平均面积（9.98±8.44) cm² (2.71~31.54 cm²)。

2.3　DKI参数与EHCC病理分级的关系

       参照EHCC病理结果，计算不同分化程度肿瘤实质组织的D、K值，并分析相关参数值在不同分化程度组别间的差异。Ⅰ级病灶D、K值分别为(1.56±0.08)×10^-3 mm²/s、0.38±0.07；Ⅱ级D、K值为（1.47±0.09)×10^-3 mm²/s、0.51±0.08、Ⅲ级分别为(1.39±0.07)×10^-3 mm²/s、0.66±0.08。

       DKI相关参数D值在高、中、低分化EHCC中存在统计学差异(P<0.001)，随着病理分化程度的降低，D值逐渐降低，两者呈正相关，相关系数为0.672；K值在不同病理分级的EHCC中存在统计学差异(P<0.001)，随着病理分化程度的降低，K值逐渐增大，两者为负相关，相关系数为0.848。ROC曲线方法得到参数D、K值的曲线下面积分别为0.860和0.951，两者差异存在统计学意义(P<0.001)（表1；图4, 图5)。

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图4，5  DKI参数D、K值ROC曲线图。两者曲线下面积分别为0.860、0.951
Fig. 4, 5  Results of ROC analysis for DsKI-derived Parameters. Area under the curve for D and K were 0.860, 0.951, respectively (P = 0.000).

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表1  D、K值与EHCC病理分级的相关性
Tab. 1  Correlation between D、K values for pathologic grade of EHCC

3　讨论

3.1　扩散模型

       既往临床多使用DWI单指数模型描述生物组织水分子运动，通过ADC值反映DWI图像信号衰减。近年来，随着对生物组织水分子运动研究的深入，认识到水分子的运动实际上由于细胞膜、细胞器、细胞内外间隔等扩散障碍物的影响，表现为复杂的非高斯扩散。于是研究出现了更准确的非高斯扩散模型。

       体素内不相干运动（intravoxel incoherent motion, IVIM）双指数模型描述病变组织内真实水分子扩散运动，认为具有一定的可行性，IVIM相关参数一定程度反映了物质微观组成结构^[12,13]。但有学者指出，虽然双指数模型属于一种非高斯扩散模型，但是信号衰减被认为是基于两个高斯分布的水分子扩散的叠加，这两个水分子池的真正属性难以评估^[14,15]。因此，为了评估水分子运动偏离高斯分布的程度，引入了新的统计量"峰度"，出现了扩散峰度成像模型。

       DKI是基于扩散张量成像（diffusion-tensor imaging, DTI）技术的拓展，DTI技术描述水分子运动基于高斯扩散理论，假定水分子运动是存在于单室模型内的高斯扩散，图像信号呈单指数函数衰减，描述其扩散分布为"二阶三维扩散张量"。Rosenkrantz等^[4]对离体新鲜肝细胞癌及前列腺癌与正常组织对照的研究采用了5个b值（0、500、1000、1500、2000 s/mm²）和3个扩散敏感梯度场^[16]。Pentang等^[17]在肾脏的可行性研究中采用3个b值（0、300、600 s/mm²）及30个扩散敏感梯度场。总之，腹部DKI成像参数差异较大，尚未形成统一标准。目前普遍认为腹部DKI至少需要3个不同的b值和15个梯度方向，最大的b值应≥2000 s/mm²。

3.2　DKI参数D、K值在EHCC分级中的价值初探

       目前，DKI探讨肿瘤病理分级的研究多应用于中枢神经系统。DKI应用于脑胶质瘤的研究中，Raab等^[11]首先采用DKI技术对Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级星形细胞瘤进行回顾性研究，结果K值随肿瘤恶性程度升高而增加，ADC值随肿瘤恶性程度升高而降低；ROC曲线分析示K值ROC曲线下面积最大，K值区分高、低级别胶质瘤的诊断效能最佳；该研究据此认为DKI可以描述不同级别胶质瘤组织细微结构的改变，有助于胶质瘤分级。在脑星形细胞瘤分级中的应用发现肿瘤实质部分K值有助于区分高低级别星形细胞瘤^[18]。在腹部的应用研究中，Quentin等^[7]比较DKI与传统DWI，评价两者区分前列腺外周带良恶性病变、诊断前列腺癌分化程度的可行性。研究发现：相对于ADC值和D值，K值在区分前列腺癌与良性前列腺增生的敏感度更高；在诊断前列腺癌分化程度方面也表现出了高敏感性。Rosenkrantz等^[19]应用DKI技术对前列腺外周带癌的初步研究亦发现：癌灶与外周带正常组织、Gleason指数高癌灶与Gleason低者相比，癌灶及Gleason指数高的癌灶其MK值均明显高于对照组的正常组织及Gleason低者。综上所述，恶性肿瘤具有较复杂的组织细胞学结构；K值能反映肿瘤组织结构的复杂性。

       本研究首次应用DKI定量参数来评估EHCC病理分级，与既往研究表现出了类似结果：K值较D值描述组织扩散信息更精确。

       应用DKI模型所得参数D与DWI单指数模型所得ADC相似，随着肿瘤分化程度的降低，D值也降低，两者呈正相关。D值反映的是单纯水分子运动，在对ADC值及细胞密度相关性的研究中发现^[20]，恶性肿瘤细胞增殖旺盛，细胞排列紧密、间隙小，细胞核增大，核异型性明显，核浆比增高。随着EHCC病理分化程度降低，肿瘤恶性程度逐渐增加，因此低分化EHCC扩散受限明显，表现为低分化者D值较高、中分化者显著低，本研究中分别为（1.39±0.07)×10^-3 mm²/s、(1.47±0.09)×10^-3 mm²/s、(1.56±0.08)×10^-3 mm²/s，然而D值与病理分级的相关性稍差，相关系数为0.672，采用ROC曲线得到D值曲线下面积为0.860，D值对于区分EHCC病理分级具有中等度诊断价值。

       此外，DKI引入了一个重要的参数K来评估EHCC，研究发现恶性程度高者K值明显高于恶性程度低者，分别为0.66±0.08、0.51±0.08、0.38±0.07。采用ROC曲线下方法分析得出K值曲线下面积为0.951，K对于EHCC病理分化程度具有高诊断效能。这与既往对胶质瘤、前列腺癌等的研究结果类似。K值作为应用最广泛的DKI参数，采用多个b值且方向相同的梯度方向上的平均值，反映组织不均质性，其大小与感兴趣区内组织结构的复杂程度成正比。肿瘤组织内细胞异型性、细胞核多形性越明显，间质血管增生越丰富，则K值越大。随着EHCC分化程度降低，肿瘤的恶性程度越高，肿瘤组织由于新鲜血管的生成、肿瘤细胞增殖、坏死、变性导致其不均质性越明显。K值从微观水平反映了病变组织结构的变化。

       研究证实DKI定量参数D、K可以用来描述EHCC微观结构的改变，间接反映肿瘤恶性程度，且K值的准确性优于D值（0.951和0.860)。

       结论：病变组织微观结构变化常早于大体形态学改变，研究证实DKI基于非高斯扩散基础，可以描述组织非高斯扩散特性，较普通单指数模型更好拟合图像信号衰减，量化相关参数，揭示组织异质性。肝外胆管癌DKI技术可在活体评价其病理分级，早期诊断疾病、定量观察病情进展，对于指导临床治疗、评估预后，提供了有意义的参考，在今后的研究中还需要进一步评估其在腹部成像中的应用价值。