宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，尤其在发展中国家发病率较高，且通常发病时分期较晚，已不能进行手术，故放疗是我国宫颈癌治疗的最主要方式。对放疗效果的评价方法中，磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)是公认的客观、准确性高的影像学方法，尤其磁共振扩散加权成像(diffusion-weighted imaging，DWI)，因为能够无创地在体量化组织水分子扩散情况，已经在很多机构成为常规的宫颈癌检查序列，不仅能够帮助提高癌灶的检出，还可以进行肿瘤治疗的监测和效果预测评价^[1,2,3]。但限于D W I的量化值表观扩散系数(apparent diffusion coefficient，ADC)仅采用标准的单指数模型、遵循高斯分布进行计算，数值单一，应用有限度，后出现了很多其他数学模型对DWI进行优化，从不同方面量化微观结构的扩散信息。其中基于非高斯算法的扩散峰度成像(diffusion kurtosis imaging，DKI)已成为研究热点，被认为能够反映更为复杂的组织微结构情况，在很多疾病中被证明DKI比常规模型更有价值，可以用于发现癌灶，如前列腺癌^[4,5]、乳腺癌^[6]，也与癌分化程度有一定相关^[7]。但在宫颈癌中的研究较少，与治疗的相关变化亦缺乏相关数据。本研究以宫颈癌小鼠动物模型为研究对象，着重探讨DKI相关的衍生参数因肿瘤放射治疗所产生的变化。

1　材料与方法

1.1　实验动物

       实验通过了北京大学肿瘤医院医学研究伦理委员会的批准，遵循动物实验伦理原则。11只4~6周龄BALB/C-nu/nu雌性裸鼠，体重100~150 g，饲养于SPF级(无特定病原微生物)动物实验室内。人宫颈癌HELA细胞常规复苏后传代培养，取对数生长期的细胞制备细胞浓度约4×107/ml~5×107/ml的细胞悬液，接种于小鼠通过左侧腋下及右侧腹股沟区大腿皮下组织内以制作移植瘤模型，每日观察局部肿瘤生长情况。接种后6~8 d，于注射部位出现明显质地较硬的结节，有1只小鼠腋下未成瘤、1只小鼠此期间不明原因死亡。成瘤率约88%。其余11只小鼠继续观察3周左右，局部肿瘤大小约1 cm左右，开始进行磁共振成像检查(放疗前)。然后对所有小鼠腹股沟区肿瘤进行一次性大剂量放疗照射(15 Gy)，照射后1周时(放疗后)再行磁共振检查。将腋下肿瘤作为未接受放射治疗的对照组。11只小鼠完成本实验后全部处死取肿瘤做病理切片，无因放疗所致死。

1.2　MRI检查方法

       所有小鼠逐一行MRI检查。采用1.5 T磁共振扫描仪(Aera, Siemens)，自制实验动物专用相控阵线圈。常规禁饮食2 h，扫描前腹腔注射异戊巴比妥钠麻醉(浓度0.8%，剂量50 mg/kg)。扫描取头先进、仰卧位。

       (1)常规序列：轴位T2WI，TR 3500.0 ms，TE 87.0 ms，带宽130.0 Hz，FOV 6.4×6.4 cm，层厚2.0 mm，层间距0.2 mm，矩阵192×192，扫描时间2 min 44 s。(2)多b值DWI序列：采用单次激发自旋回波扩散加权平面回波成像(single short echo planar imaging，ss-EPI)序列，选取b值11个，分别为0、50、100、200、400、600、800、1000、1200、1600、2000 s/mm²轴面，TR 3200.0 ms，TE 58.0 ms，带宽715.0 Hz，FOV 7.6 cm×7.6 cm，层厚2.0 mm，层间距0.2 mm，矩阵76×76，激励次数均为2，扫描时间13 min 6 s。中心线及所有层面定位拷贝T2WI图像。

1.3　图像分析及数据采集

       所有图像传至后处理工作站进行图像质量观察以及前后两次检查图像对比以帮助进行病灶相应层面定位。多b值DWI序列在SIEMENS syngo工作站自动生成ADC图，并传至第三方软件(DKI-tool，Matlab平台上开发)生成DKI模型相关参数图，包括平均扩散率(mean diffusivity，MD)和平均扩散峰度值(mean diffusion kurtosis，MK)，计算公式如下：

       S=S0•exp (2b• D + 1/6 • b²•D² • K)

       式中S是特定b值下的DWI信号强度，S0是无扩散加权时的基线信号强度，D是扩散率，K是峰度值。

       感兴趣区(region of interest，ROI)勾画方法(图1)：以T2WI图像为参照，选取病灶所有层面，在DWI序列的b=2000 s/mm²图像上沿病变边缘手动勾画感兴趣区，得到全病灶数值。所获参数值包括：肿瘤体积、平均(av)及中位(m) MD、MK、ADC值(此ADC值为多b值加权的混合值)。

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图1  所获各序列图像及参数图上感兴趣区勾画示例。以小鼠左侧腹股沟区肿瘤最大层面为例，以T2WI (A)为参照，定位肿瘤(白箭)位置及层面，在b=2000 s/mm²的图像上(B)沿病变边缘勾画感兴趣区，复制到ADC图(C)、MK图(D)及其他参数图上用以获取数值
图2  腹股沟区肿瘤放疗前后的平均MK值变化箱式图。放疗前平均MK值1.14±0.12，放疗后明显降低至1.02±0.10，配对t检验差异有统计学意义(P=0.003)
图3  腹股沟区肿瘤放疗前后的平均ADC值变化箱式图。放疗前平均ADC值0.571±0.063×10^-3 mm²/s，放疗后明显升高至0.611±0.055×10^-3 mm²/s，配对t检验差异有统计学意义(P=0.015)
图4  未放疗和经放疗的肿瘤MR与病理切片对照。图A~C示未放疗的右腋下肿瘤(A：MR T2WI，B：MR DWI)，病理切片HE染色10倍放大图(C)可见大量活跃生长的癌细胞聚集。图D~F示经放疗后的左腹股沟区肿瘤(D：MR T2WI；E：MR DWI)，病理图片(F)可见瘤床癌细胞出现变性反应，包括细胞收缩、核固缩、核碎裂及空泡化(HE ×10)
Fig. 1  The way to draw regions of interest on images for all sequences and parametric maps. Taking the tumor on left inguinal area of one mouse as an example. T2WI (A) is used as a reference to locate tumor (white arrow) and to select slice. ROI is drawn along the rim of the tumor on b=2000 s/mm² images (B), and is copied to ADC map (C), MK map (D) and other parametric maps to acquire the values.
Fig. 2  Boxplot showing changes of MKav of the tumors in inguinal areas before and after radiation. MKav decreased from 1.14±0.12 (before radiation) to 1.02±0.10 (after radiation) with statistical significance (pair sample t-test, P=0.003).
Fig. 3  Boxplot showing changes of ADCav of the tumors in inguinal areas before and after radiation. ADCav increased from 0.571±0.063×10^-3 mm²/s (before radiation) to 0.611±0.055×10^-3 mm²/s (after radiation) with statistical significance (pair sample t-test, P=0.015).
Fig. 4  Comparison of MR images and pathological section for tumors without and with radiation. MR images (A: T2WI. B: DWI) of a tumor without radiation. The pathological section with hematoxylin-eosin staining (C) shows abundant tumor cells with high proliferative activities. MR images (D: T2WI. E: DWI) of a tumor after radiation. The pathological section (F) shows the degeneration and shrinkage of tumor cells, in which nuclear pyknosis, karyorrhexis and vacuolization can be found, indicating the reactions because of radiation (HE ×10).

1.4　统计方法

       采用SPSS 18.0软件对各项参数进行统计学分析。经K-S拟合优度检验，所有参数数据符合正态分布。故采用Pearson相关性检验对MK、MD、ADC值进行相关性分析，采用配对t检验对比同一组肿瘤治疗前后的参数变化。P≤0.05为差异有统计学意义。

2　结果

       共11只小鼠21个肿瘤(11个腹股沟区肿瘤，10个腋下肿瘤)完成实验，其中1例腋下肿瘤因疗前扫描范围不足剔除。

2.1　DKI衍生值与ADC值之间的相关性(表1)

       共计21例肿瘤，将治疗前ADC、MK、MD的中位值与平均值分别进行Pearson相关性检验，r>0.9，说明存在强相关性。无论平均值还是中位值，ADC与MK之间存在负相关性(r>0.7)；ADC与MD之间存在正相关性(r>0.7)，而MK和MD之间仅中位值存在负相关性(r为-0.538)，平均值无相关性。

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表1  MK、MD、ADC值之间的相关性分析
Tab. 1  Correlation analysis between MK, MD and ADC values

2.2　腹股沟区放疗组肿瘤随治疗的参数值变化情况(表2)

       腹股沟区11个肿瘤治疗前长径平均值8.29 mm(范围6~11.5 mm)，治疗后长径平均值7.83 mm (范围6.1~8.9 mm)。相对于治疗前，放疗后肿瘤的MK明显降低(图2)、ADC值明显升高(图3)，均具统计学显著性差异(配对t检验，P<0.05)。MK平均降低幅度约9.4%，ADC平均升高幅度约7.5%。MD有升高趋势但未达统计学差异。病理切片HE (hematoxylin-eosin)染色可以看到经放疗打击后的瘤床癌细胞收缩、有核固缩、核碎裂及空泡化等变性表现，间质增加(图4)。

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表2  放疗前后MK、MD及ADC各值变化情况(±s)
Tab. 2  Changes of MK, MD and ADC values before and after radiation (±s)

2.3　腋下对照组肿瘤两次MRI的参数值变化情况(表3)

       对照组腋下10个肿瘤第一次检查(腹股沟组的治疗前时间点)长径平均值10.61 mm (范围8~12.8 mm)，第二次检查(腹股沟组的治疗后时间点)长径平均值11.01 mm (范围7.7~13.3 mm)。两次检查的MK、MD及ADC值差异均无统计学意义。病理切片可以看到大量生长活跃的癌细胞聚集、间质少(图4)。

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表3  对照组肿瘤前后两次检查的MK、MD及ADC各值变化情况(±s)
Tab. 3  Changes of MK, MD and ADC values in tumors of contrast group (±s)

3　讨论

       既往多部位的肿瘤研究已经证实，由于癌细胞分布相对密集、微环境复杂，水分子扩散受限程度普遍明显高于正常组织，ADC值较低，与宫颈癌结果相似^[8,9,10]，且ADC值与无病生存率和复发等相关^[2,3]。DKI模型是在DWI基础上由Jenson等^[11]在2005年提出的非高斯模型算法，在常规采用的组织受限程度测量基础上提出了新的度量值"峰度" ，用以描述组织微结构的复杂程度，要求尽可能使用超高b值的敏感梯度场。本研究中建立的宫颈癌小鼠模型扩散b值最高为2000 s/mm²，符合DKI的计算要求。

3.1　扩散峰度成像量化值与常规ADC值之间的相关性

       本研究结果中，MD、MK、ADC各值的平均值与中位值之间均具强正相关性(r值均>0.9)，符合正态分布的预期。本组数据中，ADC值与MD、MK之间分别具有强正相关和强负相关(r>0.7)，也基本符合三者的理论预期关系。ADC值是采用高斯模型计算的混合值，受分子内水分子扩散情况以及细胞微环境的影响，而D亦为扩散相关值，是修正的ADC值，被认为比ADC值更能反应水分子的真实扩散受限情况，故两者反映的是相似的内容，应当具有正向的强相关性。根据既往文献提供的数据，MD值普遍高于ADC值^[7,12]，与本组的数据情况相符。K作为一无量纲的数值，理论上反映的是真实水分子扩散位移与理想的非受限高斯分布扩散位移的偏离大小，越大则代表感兴趣区内水分子真实扩散受限情况越显著、细胞微环境越复杂(MK为各个方向的峰度系数平均值)，与ADC值的越低则说明水分子扩散受限显著有相反趋势，故存在负向的强相关性符合预期。

3.2　ADC值及扩散峰度成像量化值随放疗产生的变化

       在体研究均显示，宫颈癌经放疗后ADC值会升高^[13,14]，是由于肿瘤细胞坏死收缩、间质体积增大致水分子扩散增加。本研究中，荷瘤小鼠经一次大剂量放疗后，肿瘤的ADC值确实出现明显增高，与之相符的表现是MK明显降低。因MK反映的是细胞微环境复杂程度，即不均质性，细胞微结构在恶性病变中更为复杂和不均质，活跃的细胞分裂和强增殖能力增加每个体素的细胞密度，然后影响水分子扩散，高级别的癌比低级别的K值高^{[7, 15]}，宫颈癌的低分化组MK低于中高分化组^[16]。在治疗后MK的明显降低说明肿瘤细胞内部因放疗引起微环境损伤，所代表的组织间质、细胞膜结构等产生破坏而使微环境复杂程度降低，即不均质性降低。此点从本研究所获病理切片中获得证实，未放疗的癌组织中可见大量癌细胞密集，因增殖活跃，细胞拥挤，间质成分少，符合癌肿微环境复杂、细胞密度高的推论。而经放疗后，放射线通过损伤细胞DNA而引起细胞凋亡^[17]，病理切片中表现出典型的癌细胞皱缩、核固缩、核碎裂及空泡等退变表现，间质成分增加、细胞密度减低。上述表现符合MK降低的预期。虽然MK和ADC两值都产生相应变化，但MK平均降低幅度(约9.4%)高于ADC的平均升高幅度(约7.5%)。在既往大多数研究中认为K值比ADC值更有意义，但亦有认为两者作用相仿。

       在DKI模型算法中获得的扩散系数D值在既往研究中与ADC值的趋势基本相仿，例如在恶性肿瘤中明显低于良性肿瘤、且与病理分化程度相关^{[7, 18]}，在一项前列腺癌的研究中甚至认为D用于反映病理特征方面比K和ADC值更好^[19]。相关病理对照研究较少，仅有的关于前列腺癌的影像病理镜下结构的对比研究结果认为，峰度值K反映肿瘤细胞结构不均质性的增加；扩散率D则反映正常前列腺组织均匀的小管间隙及细胞结构^[20]。在本研究中，治疗前后的MD值虽有一定升高趋势但未达到统计学显著性差异。考虑对治疗的反映中，ADC作为混合值混杂了扩散率和峰度的影响因素，而可能其中起主要作用的还是峰度值，而单纯扩散率因素相对小或无。另一原因考虑受本研究病例数所限而未能达到显著性差异亦有可能。

       综上，作为DWI的衍生序列，DKI不仅具有方便、可以非侵袭性量化组织内水分子布朗运动程度的优势，而且提供了更为多样性的衍生值。宫颈癌放疗后会引起ADC值的升高和MK的降低，其中MK的变化幅度较高，提示扩散峰度成像用于放疗评价的可行性。由于小鼠肿瘤仅在皮下，和活体的宫颈癌位置不同，受体内其他影响因素较小，而且小鼠肿瘤体积小、本研究样本量小，与人体的活体研究可能存在差异，仍然需要在体研究进一步验证DKI在肿瘤治疗中的价值。