血管性认知障碍(vascular cognitive impairment，VCI)是指由明显的或不明显的脑血管病以及脑血管病危险因素引起的认知障碍，它包括从轻度认知损害(mild cognitive impairment，MCI)到血管性痴呆(vascular dementia，VD)^[1,2]，已成为严重影响老年人认知功能障碍的最常见的疾病类型之一。因此，VCI的早期诊断、及时干预对于阻止或延迟MCI向VD转化具有重要的临床意义。现有的影像学研究表明，由脑血管病变以及脑血管危险因素引起的脑结构改变(脑梗死、白质改变、脑萎缩)与认知功能障碍存在一定的相关性^[3]。然而，由于影像学数据的局限性以及临床病理学资料的缺乏，传统的影像学指标还不足以用来表征VCI的病理改变进程，因此需要借助VCI的动物模型来进行研究。目前，改良的Pulsinelli四血管阻塞法(4-vessel occlusion，4-VO)法已被广泛地用来复制VCI大鼠模型^[4]，同时，¹H-MRS是一种无创反映脑内细胞代谢改变的技术，其代谢物浓度的变化可以在一定程度上反映疾病的病理生理改变^[5]。因此，笔者尝试利用3.0 T ¹H-MRS技术研究VCI大鼠在术后2周、1个月、3个月、5个月的大鼠脑内包括海马的代谢物浓度变化，评估3.0 T ¹H-MRS用于基础动物研究的可行性，为VCI的病生理机制的研究和早期诊断提供可参考信息。

1　材料与方法

1.1　实验动物与材料

       雄性SD大鼠50只，体重约200 g，由贵州医科大学实验动物中心提供[合格证号：SCXK(黔)2012-0001]；DMS2-Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)；5 cm四通道3.0 T小动物射频线圈(众志医疗科技有限公司)；3.0 T超导MRI扫描仪(PHILIPS Achieva 3.0 T X-Series，荷兰)；春光充电式电凝笔(金环医疗用品)；小动物手术器械。

1.2　VCI模型建立

       大鼠适应性喂养2周，随机分为对照组20只、模型(VCI)组30只，VCI组大鼠均采用改良的Pulsinelli 4-VO模拟全脑慢性缺血过程制作VCI动物模型，具体过程：大鼠术前12 h禁食，4 h禁水。10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉(300 mg/kg)。手术第一天颈后正中切口，分离出第一颈椎两侧翼孔，用电凝笔凝闭双侧椎动脉，缝合；24 h后于大鼠颈部正中切开，钝性分离双侧颈总动脉，穿线备用，用血管夹夹闭双侧颈总动脉10 min，共夹闭3次，每次间隔1 h，制造大鼠全脑缺血性改变。对照组重复以上手术过程，只是不进行血管处理。由于实验周期较长，5个月时VCI大鼠的成活率约为50%，而VCI早期2周时的存活率为80%。

1.3　Morris水迷宫实验

       所有大鼠均在术前、术后2周、1个月、3个月、5个月进行定向航行实验和空间探索实验，定位航行试验将受试大鼠按顺时针方向依次由第一、二、三、四象限入水点顺序放人水中。记录2 min内寻找平台的时间(逃避潜伏期)。如果大鼠在2 min内找到平台，记录2 min中内实际逃避潜伏期；在2 min内未找到平台，由实验者将其引上平台并停留10 s，逃避潜伏期记录为2 min。空间探索试验定位航行试验全部结束后，次日进行空间探索试验。撤去平台，然后选第一象限相同的入水点将大鼠面向池壁放人水中，测其2 min内跨越原平台位置的次数和大鼠在平台各象限停留的时间、距离，以判断大鼠记忆储存及提取再现能力。

1.4　1H-MRS扫描

       所有大鼠均使用3.0 T人体扫描仪及小动物专用四通道相控阵表面线圈进行¹H-MRS数据采集。10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉(300 mg/kg)。将大鼠头部固定于动物专用四通道相控阵表面线圈。T2加权解剖结构像，参数设置如下：视野大小3.5 cm×3.5 cm，采集矩阵256×128，片厚1 mm，片数20，TR 5800 ms，TE 80 ms。以T2加权解剖结构像为基础，活体波谱采用单体素点解析波谱(point resolved spectroscopy，PRESS)序列，谱宽4000 Hz，TR 2000 ms，TE 40 ms，波谱体元大小为5 mm×8 mm×8 mm，主要包括海马、部分视皮层和纹状体，扫描时间3 min 40 s。

1.5　病理学检查

       待所有实验和MRI数据采集完毕后，将大鼠注射过量的10%水合氯醛进行麻醉，打开腹腔，经左心室灌流300 ml生理盐水和400 ml 4%多聚甲醛(Paraformaldehyde，PBS配置，pH=7.4)。灌流完毕后，将大鼠断头取出大脑，分离出海马结构，用10%中性福尔马林固定，脱水，石蜡包埋和切片，分别进行苏木素-伊红染色(HE)和尼氏染色，观察其形态学变化。

1.6　数据处理及统计分析

       水迷宫数据处理：实验数据均以±s表示，实验结果均采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，对照组与VCI组不同时间点的比较采用ANOVA方差分析，P>0.05方差齐(等)时采用LSD检验法，而P<0.05方差不齐时采用Dunnett检验法，对照组与VCI组任意两个时间点的比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。所有大鼠的¹H-MRS原始数据导入电脑工作站，应用LCModel软件(LCModel version 6.3-1A；Stephen Provencher，Oakville，ON，Canada)自动对波谱数据进行基线校正和平滑处理，得到的主要代谢物包括总N-乙酰天冬氨酸(tNAA)：NAA及少许N-乙酰天冬氨酸谷氨酸(NAAG)、总肌酸(tCr)：Cr及磷酸肌酸(PCr)、总胆碱(tCho)：磷酸胆碱(PCh)及甘油磷酸胆碱(GPC)、肌醇(mI)、谷胱甘肽(GSH)、谷氨酸(Glu)、谷氨酸+谷氨酰胺(Glx)的浓度，所有代谢物浓度的误差均控制在≤15%。同时，由于实验动物来自于不同批次，为减小个体差异对实验结果的影响，本次实验数据均以上述代谢物与tCr的比值为准纳入统计分析。

2　结果

2.1　行为学观测结果

       与对照组相比，VCI模型各组(2周、1个月、3个月、5个月)大鼠的学习和记忆能力明显降低。VCI模型各组大鼠逃避潜伏期较对照组明显延长；第1次穿越平台时间较对照组明显延长；穿越站台次数较对照组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；VCI组术后1个月、3个月、5个月大鼠学习与记忆能力与术后2周比较、术后5个月大鼠与术后1个月比较降低，差异有统计学意义(P<0.05)；但术后3个月大鼠逃避潜伏期、第1次穿越平台时间、穿越站台次数与术后1个月大鼠比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后5个月大鼠逃避潜伏期与术后3个月比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但第1次穿越平台时间、穿越站台次数较其变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠水迷宫比较结果见表1。

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表1  各组大鼠水迷宫实验结果比较(±s)
Tab. 1  Comparative morris water maze test results in different rat groups (±s)

2.2　1H-MRS数据的可重复性验证

       为了验证数据的可重复性，选取了6只正常大鼠，将其在2周和1个月时采集的数据纳入分析，采用配对t检验，发现所有代谢物的比值在2周和1个月时没有差异(P>0.05)见表2。

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表2  对照组相同大鼠在2周和1个月时各代谢物的比较(±s)
Tab. 2  Comparation of metabolites at 2 weeks and 1 month in control rats (±s)

2.3　1H-MRS结果

       与对照组相比，术后2周，VCI大鼠即出现明显的学习记忆能力障碍，脑内的代谢物Glu/tCr显著下降(P=0.029)；术后1个月，NAA/tCr显著下降(P=0.037)，而mI/tCr显著上升(P=0.005)；术后3个月，NAA/tCr含量有所恢复，mI/tCr (P=0.007)显著上升，而GPC/tCr，tCho/tCr含量显著上升(P值均<0.05)；术后5个月，除mI/tCr仍保持在较高水平(P=0.039)外，其他代谢物均恢复至正常水平(表3；图1)。

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图1  A：红色方框表示采集波谱(ROI)所放置的位置；B：显示正常对照组大鼠的代谢物；C：显示VCI大鼠2周时的代谢物。NAA：N-乙酰天冬氨酸；tCr：总肌酸；tCho：磷酸胆碱(PCh)及甘油磷酸胆碱(GPC)；mI：肌醇；Glx：谷氨酸及谷氨酰胺
图2  A、B：均为VCI大鼠模型5个月时海马CA1区病理变化(A：HE ×200；B：HE ×400)；C、D：均为VCI大鼠模型5个月时海马区尼氏染色(C：尼氏　×200；D：尼氏　×400)
Fig. 1  A: The red box indicates the location of the spectral ROI. Representative spectra from study rats: B: Control rats (Con). C: VCI rats at 2 weeks. NAA: N-acetylaspartate. tCr: total creatine. tCho: glycerophosphocholine + phosphocholine. mI: myo-Inositol. Glx: glutamate + glutamine.
Fig. 2  A and B were the pathological changes of hippocampal CA1 region in VCI rats at 5 months (A: HE ×200. B: HE ×400). C and D were the Nissl staining of the hippocampal CA1 region at 5 months in VCI rats (C: Nissl ×200. D: Nissl ×400).

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表3  各组大鼠脑内代谢物/tCr结果比较(±s)
Tab. 3  Comparation of metabolities/tCr in different groups (±s)

2.4　病理学检查结果

       HE染色可见VCI组大鼠海马CA1区锥体细胞排列紊乱，结构模糊，少数神经元呈点状或片状嗜伊红染色增强，似红色神经元(图2A、B)。尼氏染色可见VCI组海马锥体细胞胞浆内尼氏体减少，染色减弱，部分锥体细胞胞浆内尼氏体溶解，轮廓模糊、着色浅淡(图2C、D)。

3　讨论

3.1　应用3.0 T 1H-MRS技术获取鼠脑波谱的可行性分析

       随着MRI技术的进步和场强的提高，临床MRI扫描仪也能获得高质量的小动物MRI图像，而且可以检测到既往临床MRI不能检测到的Glu峰的变化^[6]。Aradi等^[7]对大鼠进行了定量MRS的研究证实了在临床3.0 T MRI扫描仪上能可靠检测到代谢物的含量，但该研究中由于受到人体商用表面线圈的限制，不能使用更小的体元从而不能使信噪比(signal noise ratio，SNR)进一步提高，而且并未获得定量的¹H-MRS代谢物浓度。本研究通过配置了飞利浦3.0 T Achieva系统兼容的小动物线圈，内径5 cm，含4个射频通道，使扫描速度和分辨率得到了提高，由于感兴趣区与信噪比呈正相关，因此设置的感兴趣区除了海马外，还包括部分视皮层和纹状体，获得了较高质量的¹H-MRS谱线。同时，本研究应用LCModel软件进行波谱代谢物的定量检测，使研究的准确性得到了进一步提高。此外，为了验证¹H-MRS数据的可重复性，笔者选取了6只正常大鼠，将其在2周和1个月时采集的数据纳入分析，采用配对t检验，发现所有代谢物的比值在2周和1个月时差异无统计学意义(P>0.05；表2)，证明数据具有可重复性。同时也认为动物模型的¹H-MRS研究可以在3.0 T MR扫描仪上进行。

3.2　Glu对认知功能的影响

       Glu是大脑，尤其是海马内含量最为丰富的神经递质，它通过长时程增强效应参与记忆形成的过程^[8]。Rupsingh等^[9]和Westhoff等^[10]的研究发现在AD和高血压伴认知功能障碍的患者海马中均存在Glu/tCr含量的下降。本实验中VCI大鼠在术后2周出现明显的认知功能障碍，表现为逃避潜伏期与第一次穿越平台时间延长和穿越平台次数减少。与此同时，与对照组相比，大鼠脑内中Glu/tCr含量显著的下降，结果与临床研究结果一致。此外，Shiino等^[11]也发现AD和SIVD (subcortical ischemic vascular dementia，SIVD)患者海马中存在(Glu+Gln)/tCr的显著性下降。Sun等^[12]也认为中风并有脑血管病患者海马中的(Glu+Gln)/tCr的含量参与了认知功能障碍的调控。

       一方面，Glu含量的下降可能与海马中谷氨酸-谷氨酰胺循环紊乱以及细胞内的谷氨酸泄漏到细胞间隙有关，因为MRS检测到的Glu主要来自于细胞内。Sun等^[12]认为Glu含量的下降独立于可检测到的组织损伤，因此，Glu含量的变化可以作为出现认知功能障碍的一个早期检测指标。另一方面，Glu含量的下降可能与其参与了大脑能量代谢有关。改良的4-VO会引起大鼠双侧椎动脉永久性凝闭，导致其慢性脑血流灌注不足。在VCI术后2周，大脑供血的侧支循环系统可能还未完善，因此，除葡萄糖作为大脑的主要供能物质外，Glu也可以作为大脑能量代谢的底物。通常，在低血糖糖尿病患者及动物模型的MRS研究中均发现海马中Glu含量有显著性的下降^[13]。因此，在VCI术后1个月以及后续的研究中，大脑供血的侧支循环系统完善后，Glu的含量有所恢复，但低于正常水平。

3.3　mI在VCI进程中维持较高水平

       肌醇是一种类糖的物质，位于星形胶质细胞内，可以反映星形胶质细胞对外界刺激的应激。mI/tCr比值的增高可以反映胶质细胞增生或大脑肌醇代谢的改变^[14]。与对照组相比，VCI大鼠在术后2周时，脑内中mI/tCr比值有上升趋势(0.87±0.16/0.77±0.14)，在1个月时，其比值上升达到显著性，并且在后续的3个月、5个月研究中一直处于较高水平，可以理解为mI含量的上升是胶质细胞在应对脑缺血的一种可塑性表现。Yu等^[15]在对慢性脑灌注不足的动物模型研究发现，模型4个月组的神经纤维较2个月组的髓鞘破坏增多，同时神经胶质细胞增多。在对临床的VCI病人研究中，张波等^[16]的研究发现VCI患者颞叶中mI/tCr的比值升高，Chen等^[17]也发现VCI患者前额叶白质中mI/tCr比值显著高于轻度认知患者。而楼海燕等^[18]却认为VCI患者双侧海马中mI/tCr含量保持不变。通常大多数的研究也都认为mI/tCr比值的升高仅出现在AD患者的部分脑区，如海马，顶-枕叶等，而在SIVD患者脑区中保持不变。

       基于上述mI/tCr比值的不一致，推测这可能与研究者使用仪器的磁场、数据的表现形式有关。相对于其他代谢物，mI处于核磁谱峰重叠严重的区域，受波谱信噪比的影响较大，因此使用LCModel软件的分峰拟合技术得到的mI含量相对准确。

3.4　NAA、Cho在VCI进程中的变化

       NAA为大脑神经元的标志物。一般来说，神经退行性疾病患者海马、后扣带回等脑区中均存在NAA或NAA/Cr的显著性降低。本实验VCI术后2周，大鼠脑内NAA/tCr比值表现出下降趋势(P=0.08)，术后1个月NAA/tCr比值下降达到显著性。Herminghaus等^[19]和Shiino等^[11]的研究均发现AD和VD患者海马中的NAA的含量下降，Meng等^[20]也发现中风并伴有轻度认知障碍患者海马中也存在NAA/Cr的显著性下降。

       然而，在后续的3个月、5个月的研究中，NAA/tCr的比值却逐渐恢复至正常水平。近年来，也有研究发现大脑NAA的含量是可以恢复的^[13]，这可能是大脑神经元对长期疾病刺激所做的可塑性调节，因此NAA的变化不仅可以反映神经元的密度和生存能力，还可以作为神经元代谢功能和完整性的动态标志。

       Cho是胆碱复合物，GPC是磷酸化的胆碱，Cho或Cho/tCr的增加提示神经胶质增生。本研究中VCI大鼠脑内GPC/tCr和tCho/tCr比值上升，这与Mackay等^[21]研究中VD患者左侧顶叶灰质的Cho/Cr较正常对照组升高的结果类似，后扣带回Cho的升高反映了胆碱能系统受损，从而引起认知功能障碍。与此不同的是，国内楼海燕等^[18]的研究却并没有发现VCI患者(mini-mental state examinatlon，MMSE=20~23分)双侧海马的Cho/Cr与对照组的差异。但Suriyajakryuththana等^[22]却认为AD患者左前脑区存在Cho/Cr比值的下降，并推测该区域发生了神经退行性病变而不是神经胶质增生。因此，关于Cho含量的变化在AD、VD的研究中并没有一致的结论，因为在不同的病理时期，大脑的病理改变存在区域选择性，这也提示在使用¹H-MRS揭示病理变化的同时需要结合病理及免疫组化检查的结果，从而确认代谢物变化的病理基础。

       本研究不足之处主要有：为了保证一定的信噪比，设置ROI包括海马以及部分视皮层、丘脑以及纹状体；改良的Pulsinelli 4-VO法制作的大鼠VCI模型后期成活率(3个月、5个月)较低(50%)；仅在实验结束后获取VCI大鼠的病理学资料，病理学检查仅做了HE和Nissle染色；由于VCI组大鼠后期成活率低，VCI组大鼠在3个月、5个月时只数较少，行为学结果与MRS结果没有显著的相关性。以上问题将在后续的研究中改进。

       综上所述，本实验采用3.0 T ¹H-MRS技术以及结合LCModel软件对VCI大鼠模型脑内代谢物的纵向研究具有一定的可行性，对Glu、mI等代谢物的测量更加精准。VCI大鼠在术后2周即出现Glu/tCr比值下降以及VCI进程中表现出来的mI/tCr持续升高可能有助于早期VCI的诊断。