血管外膜是血管壁的重要组成部分^[1]，其组织学结构是纤维结缔组织，血管外组织间隙（interstitium，组织间隙或者间质）可大致分为流体相（水、电解质、营养物质和一些血浆蛋白）和固相（细胞外基质)^[2]。近年来，血管外膜与血管外组织间隙流体的相互作用关系的重要性引起了广泛关注，研究表明组织间隙中的组织液可以沿血管外膜长程流动。Iliff等^[3]研究发现颅内血管旁间隙存在与脑脊液代谢相关的流体传输行为，脑脊液沿着穿通动脉血管旁间隙进入脑实质，而脑组织液沿着静脉外膜流动。根据Boardman等^[4]的观察，组织间隙中组织液的流动可促进淋巴管内皮细胞迁移、增殖并最终重组成一个功能性的毛细淋巴管网络的流体通道的形成。Li等^[5]研究证实沿血管外膜的组织液流动现象不仅存在于颅内，而且在动物和人体的其他解剖部位也存在。以健康家兔为实验对象的研究发现，组织液沿血管外膜及其周围纤维结缔组织而长程流动，其液体传输功能与纤维骨架相关^[6]。Feng等^[7]的体外模式化研究从微纳米尺度流体行为角度出发，发现液体快速传输的机制为固相纤维／凝胶界面中的流体传输行为，属于限域空间流体的特殊传输现象。在健康受试者磁共振示踪成像研究证实，组织液能够沿血管外膜流动，这是一种不同于循环系统的脉管外液体长程传输通路^[6,7,8,9]，具有成为新的给药途径的潜力。Hu等^[10]使用液态金属利用该组织液长程传输通路进行了肿瘤模型给药研究，初步展示了血管外膜传输通路作为给药途径的潜能。

       药物的疗效取决于药物的理化性质，药物的生物分布依赖于给药途径。给药途径不同，药物吸收的速度和程度就不同，疗效也不同，给药途径对药物的治疗效果有重大影响^[11]。纳米药物具有广阔的生物医学应用前景^[12]，磁性氧化铁纳米颗粒不仅是用于MRI的优良对比剂，可以通过控制纳米颗粒的尺寸、结构和涂层来优化其对比效果，而且治疗药物可以偶联到纳米颗粒表面，增强其在生物系统的稳定性和溶解度^[13,14]。传统研究中，纳米药物通常采用静脉注射的方式，其生物分布和清除是由器官的特性和纳米颗粒的物理化学性质决定的^[15]，其体内分布行为不仅取决于流体力学尺寸，而且更重要地取决于纳米颗粒表面的理化性质^[16]，如亲疏水基团、正负电性、粒径等均已被证明显著影响着纳米颗粒体内外生物学效应^[17]。纳米颗粒的表面电荷对其在体发挥效应及体内生物代谢的影响作用值得引起关注。

       因此，利用这种组织液沿血管外膜长程流动的现象，基于血管外膜传输通路具有作为一种新的给药途径的潜力与表面电荷是药物重要的物理化学特性。本研究利用磁共振体内精确成像技术，探讨不同表面电荷修饰的磁性氧化铁纳米颗粒在血管外膜传输通路中传输行为，以期为血管外膜传输通路作为给药途径的实际应用提供信息。

1　材料与方法

1.1　实验动物

       12只健康的SD大鼠，雄性，6~7周龄，体重160~180 g，购自北京市维通利华，许可证号SCXK（京）2016-0006，适应性饲养1周后进行实验。本实验经过北京医院伦理委员会批准（编号：2016BJYYEC-066-02)。

1.2　主要药品

       18 nm氨基修饰Fe3O4纳米颗粒（正电荷），18 nm羧基修饰Fe3O4纳米颗粒（负电荷），18 nm甲氧基封端的磷酸化PEG修饰Fe3O4纳米颗粒（电中性)（西安超磁纳米生物科技有限公司）；异氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批号217180801)。

1.3　主要仪器

       数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号KQ-250DE)，呼吸麻醉机（美国VETEQUIP公司，型号VE5400)，布鲁克高磁场MRI/MRS小动物活体成像系统及大鼠专用线圈（德国Bruker BioSpin MRI GmbH ，7.05 T，型号BioSpec70/20USR)。

1.4　注射部位的选择

       鉴于血管外膜传输通路的解剖学位置和试验测定的方便性，选择大鼠下肢太溪穴作为注射点，其具体注射位置参照既往文献[6]。

1.5　动物分组与处理

       利用氧化铁纳米颗粒的MRI特性调整合适的给药浓度，设置不同浓度梯度的试管样品，采用磁共振T2map_MSME序列，分别测量并计算3种纳米颗粒的T2弛豫时间、r2弛豫效率；确定合适的浓度为0.2 mg/mL。

       SD大鼠分为电中性组（甲氧基封端的磷酸化PEG修饰Fe3O4纳米颗粒）、正电性组（氨基修饰Fe3O4纳米颗粒）、负电性组(羧基修饰Fe3O4纳米颗粒），每组4只。将大鼠放置于呼吸麻醉机中，吸入3％异氟烷诱导并维持麻醉，氧气流量2 L/min，呼吸频率40~60次／min，待大鼠状态稳定后将异氟烷浓度降至1.5%～2.0%。将麻醉大鼠放置于小动物核磁共振仪的动物床上并固定好，连接呼吸门控。在大鼠下肢太溪穴穿刺静脉留置针，将外套管和针芯一起刺入后抽出针芯，仅将柔软的外套管留在太溪穴进行注射，保持给药注射前后大鼠位置固定，注射前用核磁共振仪扫描后于太溪穴原位注射1 mL纳米颗粒溶液后再次扫描监测。

1.6　扫描方法及技术参数：传输行为的检测

       使用小动物核磁共振仪（大鼠专用线圈），定时检测不同表面电荷纳米颗粒在传输系统的传输行为，分别在注射前及注射后1、6、11、16、21、26、31、36 min进行MRI，使用T2map_MSME序列，调整合适的参数：TR 3000 ms，有效TE 6.5 ms，FOV 60 mm×60 mm，层数60层，层间距1.5 mm，层厚1.5 mm，矩阵128×128，平均次数1次，比较注射前后大鼠下肢的MRI影像差别。

1.7　病理检查

       维持麻醉状态下处死大鼠，动物死亡后即刻取下肢肌肉组织，用生理盐水冲洗后切取肌肉组织置于10％甲醛溶液固定48 h，石蜡包埋切片，行普鲁士蓝染色后光学显微镜下观察。

1.8　图像处理和数据分析

       体积计算：应用MATLAB R2016a分析处理图象，测量处理前后实验组动物各时间点下肢感兴趣区，分别计算信号降低区域的体素点数目、累计位移和速度，分别绘制实验组动物各时间点感兴趣区相对应的时间动态变化曲线；其中，体积计算：体积=FOV/(128×128)×体素点数目×（层厚＋层间距)=0.66×体素点数目（mm³)；累计位移计算：统计每个时间段磁共振图像中信号下降的区域出现的层数，累计位移＝层数×（层厚＋层间距)＝层数×3(mm)；速度计算：每个时间段的位移与时间的比值，速度＝位移／时间＝位移/5 (mm/min)。

1.9　统计学分析

       采用SPSS 25.0统计学分析，GraphPad Prism 8作图。实验观察数据以平均值±标准差(±s)表示，采用两因素重复测量资料方差分析进行组间是否存在差异比较，两两比较采用LSD多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　各组大鼠磁共振图像定性分析

       注射3种不同表面电荷的纳米颗粒，其传输行为通过磁共振成像表征，注射前后对比，3组均出现信号明显降低的区域（图1)。通过Mricron软件与Mricrogl软件进行图像三维重建，可见沿血管外膜传输分布的Fe3O4纳米颗粒（图2)。

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图1  注射纳米颗粒前后不同时间点同一层大鼠下肢的磁共振图像。A~D：电中性组，E～H：正电性组，I~L：负电性组
Fig. 1  The same layer of magnetic resonance images at different time points prior to and following the injection of nanoparticles. A—D: Neutral group, E—H: Positive group, I-L: Negative group.

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图2  注射纳米颗粒后大鼠下肢的磁共振三维图像。A：电中性组，B：正电性组，C：负电性组
Fig. 2  Three-dimensional magnetic resonance imaging of the lower limbs of rats after injection of nanoparticles. A: Neutral group, B: Positive group, C: Negative group.

2.2　各组大鼠磁共振图像定量分析

       注射3种不同表面电荷的纳米颗粒前后，时间因素对信号降低体素点数目（即体积）的影响具有统计学意义(F=68.644，P<0.01)，随观测时间的延长，3组大鼠下肢信号降低的体素点数目（体积）均增加（图3)；药物组间差异无统计学意义(P>0.05)；药物组间与观测时间无交互作用，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

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图3  注射不同表面电荷纳米颗粒后信号降低的体积
图4  注射不同表面电荷纳米颗粒后信号降低的速度
图5  注射不同表面电荷纳米颗粒后信号降低的累计位移
Fig. 3  The volume of signal reduction regions after injection of different surface charge nanoparticles.
Fig. 4  Velocity curve of the signal-reduced region over time after the injection of nanoparticles with different surface charges.
Fig. 5  Curve of cumulative displacement of signal-reduced regions over time after the injection of nanoparticles with different surface charges.

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表1  3种纳米颗粒对大鼠下肢信号降低区域体积的影响(mm³，±s)
Tab. 1  Effect of surface charge on the volume of lower limb signals in rats (mm³, ±s)

2.3　各组大鼠磁共振图像定量分析

       注射3种不同表面电荷的纳米颗粒前后，时间因素对信号降低速度的影响具有统计学意义(F=130.411，P<0.01)，信号降低的速度随时间的延长呈下降趋势（图4)；药物组间与观测时间无交互作用，差异无统计学意义(F=2.352，P>0.05)；药物组间信号降低的速度差异有统计学意义(F=6.657，P<0.05)。其中，LSD多重比较显示，电中性组与正电荷组比较无显著性差异(P>0.05)，负电荷组的平均速度明显低于电中性组(P<0.01)和正电荷组(P <0.05)。见表2。

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表2  3种纳米颗粒对大鼠下肢信号降低区域速度的影响（mm/min，±s)
Tab.2  Effect of surface charge on the velocity of lower limb signals in rats (mm/min, ±s)

2.4　各组大鼠磁共振图像定量分析

       注射3种不同表面电荷的纳米颗粒前后，时间因素对信号降低区域的累计层数即累计位移的影响具有统计学意义(F=1054.056，P<0.01)，信号降低区域的累计位移随时间的延长呈上升趋势（图5)；药物组间信号降低区域的累计位移差异无统计学意义(F=1.359，P>0.05)，药物组间与观测时间的交互作用具有统计学意义(F=11.543，P<0.01)；随时间的延长，药物组间的累计位移不同，电中性和带正电荷的纳米颗粒的累计位移比带负电荷的长。见表3。

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表3  3种纳米颗粒对大鼠下肢信号降低区域累计位移的影响（mm ，±s)
Tab.3  Effect of surface charge on cumulative displacement of the lower limb signal reduction region in rats (mm, ±s)

2.5　组织切片普鲁士蓝染色

       实验组注射纳米颗粒后，与空白组比较，普鲁士蓝染色镜下可见沿血管外膜分布的Fe3O4纳米颗粒。见图6。

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图6  注射纳米颗粒后组织切片普鲁士蓝染色(×100)。A：实验组；B：空白组
Fig. 6  Prussian blue staining of tissue sections after injection of nanoparticles (×100). A: Experimental group; B: Blank group.

3　讨论

       本研究通过MRI和组织学研究进一步证实了血管外膜传输通路存在长程传输的功能，表面电荷对Fe3O4纳米颗粒在血管外膜传输通路中的传输行为具有影响。

3.1　不同表面电荷纳米颗粒在血管外膜传输通路的传输行为不同

       药物通过多种途径进入体内，例如肠内，肠外或局部给药，药物分子到达其各自靶位的可及性和药物治疗在很大程度上取决于给药途径^[18]。血管外膜传输通路具有长程传输功能，可以成为一种新的给药途径。纳米药物的理化性质包括粒径、表面电荷和表面化学，是决定其药代动力学和生物分布的重要因素^[19]。体内各组织器官的生理学特点对纳米药物的吸收有表面电荷选择性，因此表面电荷是影响纳米药物在体内被动靶向作用的重要理化因素^[20]。表面电荷对纳米药物体内分布的影响很大，而关于表面电荷对纳米颗粒在血管外膜传输通路的传输行为以及体内分布的影响，相关报道较少^[9]。

       本实验结果表明，不同表面电荷纳米颗粒在血管外膜传输通路的传输行为不同。本研究观察到3种不同表面电荷纳米颗粒均可在其中传输，其传输速度不同导致位移以及信号降低区域的体积不同。其中，带负电荷的纳米颗粒在血管外膜传输通路起始速度最快，随时间延长速度下降趋势最为明显，体积与位移的增加趋势随速度的显著减慢而下降；带正电荷的纳米颗粒和电中性的纳米颗粒传输速度无明显差异，随时间延长速度的下降趋势较负电荷的缓慢，体积与位移的增加趋势随速度的缓慢减慢而下降。信号下降区域的体积可以分为横向的面积和纵向的位移，在相同的观测时间内，相较于电中性组和正电荷组，带负电荷的纳米颗粒横向面积较大而纵向位移较短，这可能与传输速度密切相关。

3.2　表面电荷影响纳米颗粒传输的潜在原因

       本研究中，纳米颗粒的表面电荷影响其在血管外膜传输通路的传输速度。分析认为：纳米颗粒的起始速度不同可能和推注速度密切相关，随时间延长，传输速度的减慢可能与纳米颗粒和传输通路中的组织蛋白和巨噬细胞相互作用有关。纳米颗粒进入生物介质后迅速与蛋白结合，组织液中的免疫细胞如固有吞噬细胞存在吞噬和消除某些纳米颗粒的倾向，蛋白的结合可以改变其表面电荷，从而影响巨噬细胞的摄取^[21]。带正电荷的纳米颗粒在血管外膜传输通路传输过程中可能与组织液中带负电荷的蛋白结合，带负电荷的纳米颗粒则易被巨噬细胞吞噬，从而导致传输速度不同。

3.3　血管外膜传输通路具有作为给药途径的潜力

       血管外膜传输通路可以长程传输荧光分子、金纳米颗粒、顺磁性对比剂甚至液态金属^{[7,8,9,10, 22]}，这种新颖的流体行为与近年来限域空间内逐步被认识的特殊流体性质密切相关^[23]。最近，Bedussi等^[24]的研究显示软脑膜动脉周围的血管旁间隙在大脑表面形成低阻力通路，促进脑脊液的流动。Benias等^[25]的研究认为间质是组织内可动态压缩和扩张的窦腔内宏观可见的间隙，间质液通过窦腔在体内流动。血管外疏松结缔组织纤维通过松散地相互连接形成多级次多孔介质骨架结构，间质流体充斥其间表现出介观尺度下限域空间中的流体行为^[26]。这类流体行为与生命体中物质的输送密切相关，利用血管外膜传输通路作为新的给药途径具有重要意义。从药物设计的应用前景来看，药物表面电荷带正电荷或者保持电中性有利于在血管外膜传输通路中快速传输，需要缓慢持久释放的药物表面可以带负电荷。

3.4　血管外膜传输通路与其他给药途径的比较

       血管外膜传输通路具有作为给药途径的潜力，药物在其输送过程虽然未通过血液循环系统，但会进入循环系统，Shi等^[22]的一项以大鼠为实验对象的研究表明，与静脉注射相比较，经血管外膜传输通路注射金纳米颗粒（AuNPs)后，用电感耦合等离子体质谱法定量分析AuNPs分布，发现其在血液、肺、心脏和肠道中的含量远低于静脉注射后的AuNPs含量，而在皮肤和肌肉中AuNPs含量则高于静脉注射，这表明经血管外膜传输通路注射AuNPs会进入血液循环系统，且其生物分布不同于静脉注射，这意味着血管外膜传输通路作为给药途径，药物可以进入血液循环经过肝肾代谢从而过滤可能的毒性。

       血管外膜传输通路的组织学结构是纤维结缔组织，其位于组织间隙，药物在其传输过程中可根据药物理化性质的不同，以扩散等方式进入血管周围的纤维结缔组织中而参与血管周围组织细胞的代谢，因此，通过血管外膜传输通路而进行的长程、定向、靶向给药还需要从药物设计的角度出发，考虑药物离开血管外膜通路后进入血管周围的组织细胞而参与其中的代谢等问题。以纳米颗粒为例，纳米颗粒自身的物理化学性质不仅影响其在血管外膜传输通路的传输行为，同时也影响其细胞效应。纳米颗粒一旦与细胞接触，通常会引起摄入反应，Sun等^[27]研究了表面化学修饰不同的3种AuNRs对血管平滑肌细胞的作用，利用双光子显微镜观察了细胞摄入AuNRs的行为，发现平滑肌细胞对3种AuNRs的反应不尽相同，这说明表面化学修饰等物化因素对AuNRs的细胞效应有明显影响。提示在以血管外膜传输通路作为给药途径进行药物的设计和应用时，药物的理化因素、生物效应与安全性评估都要予以重视。

       根据本实验结果，观察时间超过30 min后磁共振图像信号下降区域仍保持明显的黑暗现象，可以看出经血管外膜传输通路给药，药物的滞留时间长，可以有效提高局部组织药物浓度，从而可以绕开口服生物利用度较差的药物在胃肠道中的肝首过代谢作用导致的有效药量减少，药效降低^[28]，同时，通过提高靶组织局部药物浓度，减少静脉注射导致的血液中高浓度不稳定的药物输送，减少全身毒副作用，实现药物的高效、安全递送；此外，避免了生物活性物在有效透皮递送方面的巨大挑战，例如穿透角质层屏障的渗透^[29]。

3.5　本研究的局限性

       本研究存在一定的局限性：(1)本研究以健康大鼠作为研究对象，麻醉状态下对纳米药物的传输速度存在影响，与正常生理状态以及疾病病理状态存在差异，研究的结果尚不能完全反映病理生理状态的药物传输速度。(2）纳米颗粒的起始速度不同可能和推注速度密切相关，因为磁共振设备的特殊性质，不能采用输液泵等进行匀速推注，起始速度存在一定的误差。(3 )本研究仅观察纳米颗粒在血管外膜传输通路的传输行为，未进一步研究表面电荷对药物生物分布的影响。

       综上所述，3种不同表面电荷纳米颗粒均可在血管外膜传输通路传输，其传输速度不同，该实验结果对于进一步研究血管外膜传输通路、表面电荷与给药途径的关系以及药物性质的实际应用均有一定意义。血管外膜传输通路作为给药途径还需要更多相关机制与药物设计方面的研究，本研究表明血管外膜传输通路作为给药途径时应考虑表面电荷的影响。