动脉粥样硬化是心血管疾病发生发展的重要病理基础，而心血管疾病是一种严重影响和危害人类生命健康的疾病，有较高的致病率和致死率^[1]。动脉粥样硬化斑块的病理特征、组成成分与斑块的易损性、斑块的破裂以及破裂后导致的严重后果息息相关^[2]，因此，能够在体无创性地检测动脉粥样硬化斑块的组成成分，将对患者的治疗和预后评估有着极其重要的临床价值。目前临床常用的影像技术对动脉粥样硬化斑块的病理成分及稳定性判断具有一定的局限性，而分子影像学的发展使得准确地测定斑块的组成成分成为可能，并且具有识别易损和高风险斑块的潜能^[3,4]，可以在疾病表现出临床症状之前便提供相关的病理生理学信息。本研究用聚乳酸/羟基乙酸[poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA]作为载体，制备载配体硫酸葡聚糖(dextran sulfate，DS)的磁共振及光声双模态分子探针，以期借助分子影像技术从细胞及分子水平分析动脉粥样硬化斑块的清道夫受体A (scavenger receptor A，SR-A)，实现对动脉粥样硬化斑块的早期精准诊断，为疾病的治疗及预后判断提供重要的基础信息。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　主要试剂

       PLGA (丙交酯：乙交酯为75∶25，分子量为8000 Da，济南岱罡生物材料有限公司)、油酸修饰的Fe3O4 (10 nm，25 mg/mL，美国大洋科技有限公司)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA，分子量为30000~70000 Da，美国Sigma公司)、壳聚糖(chitosan，CS，分子量为50000 Da，上海麦金林生化有限公司)、DS (分子量为5000 Da，上海阿拉丁试剂有限公司)、DiI和DAPI染色剂(美国Sigma公司)、CCK8检测试剂盒(日本同仁)，所有试剂均为分析纯。

1.1.2　主要仪器

       超声振荡仪(VCY-500，YYSonics有限公司，中国上海)、动态光散射检测器(Malvern Instruments，马尔文有限公司)、透射电镜(日立7500，日立公司)、光学显微镜(Leica DMI8，Leica有限公司)、流式细胞仪(FACSVantage，美国)、1.5 T MRI扫描仪(HDXT2012，GE Medical Systems，美国)、光声成像仪(Vevo Laser，VisualSonics，加拿大)、激光共聚焦显微镜(Nikon A1，日本)、酶标仪(Synergy HT，BioTek Instruments，美国)。

1.2　双模态纳米粒的制备及表征

1.2.1　非靶向纳米粒的制备

       采用双乳化法，首先将50 mg PLGA加入到2 mL二氯甲烷中，制备DiI染色纳米粒时在此过程中加入少量DiI，待其完全溶解后滴加100 μL油酸修饰的Fe3O4，轻微摇晃至完全混合。加入200 μL的双蒸水作为内水相，在常温条件下用声振仪声振3 min，功率为130 W×40%，产生咖色初乳液。接着加入6 mL 4%的PVA溶液作为外水相，声振仪声振5 min，形成棕色复乳液。然后加入10 mL 2%的异丙醇，将上述溶液在冰浴条件下置于通风橱连续搅拌3 h，使得有机溶剂完全挥发，非靶向纳米粒(PLGA-Fe3O4)表面固化。最后经双蒸水离心洗涤3次除去上清液，将收集的纳米粒置于4℃冰箱内备用。

1.2.2　靶向纳米粒的制备

       在上述制备过程中，将6 mL 4%的PVA溶液替换为3 mL 4%的PVA溶液和3 mL 2%的CS溶液(溶解于3%的乙酸)混合液，除去上清液后，用双蒸水将纳米粒重悬至5 mL，然后加入10 mg DS，冰浴摇床1 h通过静电吸附作用制备PLGA-Fe3O4-DS纳米粒，离心洗涤后稀释至10 mg/mL并置于4℃冰箱内备用。

1.2.3　纳米粒的理化性质

       用动态光散射检测器测定PLGA-Fe3O4-DS纳米粒的平均粒径、表面电位和多分散指数(polydispersity index，PDI)，使用透射电镜分析其内部结构，用光学显微镜连续一周观察其分布及形态特征，用流式细胞仪检测DS的连接率。

1.3　纳米粒磁共振成像及光声成像研究

1.3.1　纳米粒磁共振成像

       将PLGA-Fe3O4-DS纳米粒与1%的琼脂溶液混合，产生浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的纳米粒后，转至5 mL Eppendorf管中，将其依次置于充满水的塑料容器中，以减少空气伪影。使用1.5 T磁共振扫描仪进行T2^*WI扫描，采用头颅专用单通道正交线圈，梯度回波序列(gradient echo sequence，GRE)。扫描参数为：回波时间(echo time，TE)=10.7 ms，重复时间(repetition time，TR)=520 ms，扫描层厚=3 mm，扫描视野(field of view，FOV)=180 mm，翻转角(flip angle，FA)=45°。

1.3.2　纳米粒光声成像

       依次将100 μL浓度为0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL的PLGA-Fe3O4-DS纳米粒加入到带孔的凝胶模型中，用波长为706 nm的激光辐照60 s后，以光声成像系统采集纳米粒的光声图。

1.4　细胞实验

1.4.1　纳米粒对巨噬细胞的靶向性

       体外培养小鼠巨噬细胞RAW 264.7，用100 ng/mL脂多糖对其进行活化24 h，取对数生长期细胞，以2.0×10⁵/孔接种于直径为15 mm培养皿中24 h后，用0.5 mg/mL的DiI标记的PLGA-Fe3O4或PLGA-Fe3O4-DS纳米粒培养基替换原始培养基，放入培养箱继续孵育2 h。用PBS洗涤细胞3次，用4%的多聚甲醛在室温下固定15 min，再次洗涤细胞并用DAPI将细胞核染色10 min，洗掉多余的染料，放置于激光共聚焦显微镜上对固定的细胞进行观察并采集图像。

1.4.2　纳米粒的细胞毒性

       将活化的RAW 264.7以1×10⁴/孔接种于96孔板中，孵育24 h，用浓度0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL的PLGA-Fe3O4-DS纳米粒培养基替换原始培养基，放入培养箱后孵育24 h，然后用PBS洗涤细胞3次，加入10μL的CCK8溶液后继续孵育2 h，最后用酶标仪在450 nm处测量溶液的吸光度，分别计算每个孔中细胞的存活率。

2　结果

2.1　纳米粒的理化特征

       制备的PLGA-Fe3O4-DS纳米粒经动态光散射检测器测得平均粒径为(263.93±21.38 nm (图1A)，表面电位为(-20.63±2.61) mV (图1B)，PDI为0.099±0.068。透射电镜下观察纳米粒大小约260 nm，油酸修饰的Fe3O4分布在纳米粒的壳上，纳米粒外膜可见DS的透明结构(图1C)。在光镜下纳米粒形态规则呈球形，大小均匀，分散性好(图1D)，连续一周内观察该纳米粒大小形态无明显变化。与对照组相比，PLGA-Fe3O4-DS纳米粒外壳波长发生了改变，流式细胞仪测得含有DS的纳米粒其连接率为90.06%(图2)。

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图1  PLGA-Fe3O4-DS纳米粒表征。A：粒径分布图；B：电位分布图；C：透射电镜图；D：光镜图
Fig. 1  Characterization of PLGA-Fe3O4-DS nanoparticles. A: Particle size distribution; B: Surface potential distribution; C: Transmission electron microscope; D: Light microscope.

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图2  流式细胞仪检测DS连接率
Fig. 2  Detection of DS connection rate by flow cytometry.

2.2　纳米粒的多模态成像

2.2.1　纳米粒磁共振成像

       磁共振扫描图显示，PLGA-Fe3O4-DS纳米粒可有效降低T2^*信号，随着样品中纳米粒浓度的增加，T2^*信号强度降低越明显(图3A)。

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图3  PLGA-Fe3O4-DS纳米粒的磁共振扫描图(A)和光声成像图(B)
图4  激光共聚焦图显示纳米粒对RAW 264.7细胞靶向性
Fig. 3  MRI (A) and photoacoustic imaging (B) of PLGA-Fe3O4-DS nanoparticles. Fig. 4 Laser confocal image shows the targeting of nanoparticles to RAW 264.7 cells.

2.2.2　纳米粒光声成像

       在激光照射下，与无光声信号的水溶液相比，不同浓度的PLGA-Fe3O4-DS纳米粒均显示出红色的光声信号，并且随着浓度的递增，光声信号强度逐渐增强(图3B)。

2.3　纳米粒的体外靶向性

       激光共聚焦显微镜下可以看到，纳米粒与活化的RAW 264.7共孵育2 h后，DiI标记的PLGA-Fe3O4-DS带红色荧光纳米粒聚集在细胞核周边，而在非靶向组中未观察到DiI标记的PLGA-Fe3O4纳米粒在细胞周围聚集(图4)。

2.4　纳米粒的细胞毒性

       将RAW 264.7细胞与不同浓度的PLGA-Fe3O4-DS纳米粒共孵育24 h后，在浓度为8 mg/mL以下时细胞存活率均在85%以上(图5)。

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图5  PLGA-Fe3O4-DS纳米粒对RAW 264.7细胞存活率影响结果
Fig. 5  Results of PLGA-Fe3O4-DS nanoparticles on the survival rate of RAW 264.7 cells.

3　讨论

       动脉粥样硬化斑块的细胞及组织成分多样，在纳米粒的制备过程中，原材料之间的相互作用及复杂繁琐的制备步骤会在一定程度上影响纳米粒对斑块的诊断效能。因此，本研究在课题组前期研究的基础上用改良的双乳化法和静电吸附法制备PLGA-Fe3O4-DS纳米粒^[5,6,7]，该制作步骤简便可操作性强，且制备的纳米粒大小均一、分散性好，在连续一周内观察无明显大小形态变化，表现出良好的稳定性。得到的纳米粒平均粒径为(263.93±21.38) nm，可减少被网状内皮系统捕获^[8]，缩短了在血液循环中的持续时间，能够充分聚集于动脉粥样硬化病变处，更好地对疾病进行动态检测。

       目前，国内外学者基于不同的影像技术制备了靶向动脉粥样硬化斑块的各种分子探针^[9,10]，单一模式的成像技术对病变的显示有自身的局限性，存在一定的偏差，而多模态成像运用两种或两种以上的成像模式，使各种成像技术能够优势互补，提供更加全面的相关组织和疾病病理生理学信息。磁共振成像技术具有软组织分辨率高、多方位、多参数成像的特点，能够进行深部及小血管检测^[11]，但噪音大、时间分辨率低。光声成像技术利用组织光能量的吸收分布推测内部结构，是生物医学领域新兴的一种成像技术，结合了纯光学与纯声学显像空间分辨率高、对比度好等优点，但其对深部组织的穿透力不如磁共振^[12]。Fe3O4可用作磁共振显像剂^[13]，同时作为"光吸收子"，也可用于光声成像。在本研究中，磁共振扫描结果显示不同浓度的PLGA-Fe3O4-DS纳米粒均能降低T2^*信号，且随着样品中纳米粒浓度的增加，T2^*信号强度降低越明显，油酸修饰的Fe3O4嵌于纳米粒壳上，不会发生明显的突释现象，稳定性优良，该纳米粒能够有效降低T2^*信号，具有良好的磁共振负性增强效果。在体外光声成像中，纳米粒在激光照射下能将光信号转化为可观测的声信号，随着纳米粒浓度递增，光声信号逐渐增强，说明纳米粒具有较强的光稳定性，能够很好地进行光声成影。因此，本研究制备的PLGA-Fe3O4-DS纳米粒能够结合磁共振成像及光声成像技术的优势，期望从分子水平对动脉粥样硬化斑块实现更全面的影像学分析。

       动脉粥样硬化易损斑块的细胞成分中巨噬细胞的含量是最为丰富的，病变的早期特征性病理变化便是巨噬细胞的活化，活化的细胞表面过表达SR-A^[14,15]，本研究选择活化巨噬细胞中的SR-A作为靶点。硫酸葡聚糖是巨噬细胞表面SR-A的配体之一，生物相容性、生物降解性良好，可降低患者血液中低密度脂蛋白的含量，具有逆转和稳定动脉粥样硬化斑块的潜能^[16]。在细胞靶向实验中，纳米粒与活化的RAW264.7细胞共孵育2 h后，在靶向组中可以观察到大量带红色荧光的PLGA-Fe3O4-DS聚集在细胞核周围，非靶向组中PLGA-Fe3O4纳米粒不含配体DS，对细胞没有亲和力，在实验过程中被PBS洗掉后几乎观察不到红色荧光，表明PLGA-Fe3O4-DS纳米粒在靶向受体作用介导下可被巨噬细胞内吞，这种靶向作用可以在一定程度上抵抗动脉血流的剪切力，使纳米粒与巨噬细胞结合以进一步实现成像及治疗潜能。此外，细胞毒性结果显示，将细胞置于各种浓度纳米粒24 h后，细胞增殖没有受到阻碍，细胞存活率都大于85%，表明纳米粒的细胞毒性作用甚低，有很好的生物安全性。

       综上所述，本研究制备的PLGA-Fe3O4-DS纳米粒具备良好的磁共振成像和光声成像能力，对活化RAW264.7细胞的SR-A有较高的亲和力，有望在分子水平分析SR-A在动脉粥样硬化斑块发展过程中的规律，为易损斑块的准确诊断、无创性治疗及活体动态评价其疗效提供新的思路。