肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是长期慢性肝实质反复损伤-修复后肝内结缔组织异常增生，细胞外基质弥漫性异常沉积的病理过程^[1]。HF是慢性肝病的共同基础，随着HF进展可出现终末期肝硬化甚至肝癌^[2]，精准分期并抗纤维化治疗可有效阻遏甚至逆转早期HF，因此，HF准确分期对指导治疗方式及患者预后判断具有十分重要的意义^[3,4]。肝穿刺活检虽然是临床诊断HF的金标准，但是25%~40%的病人会产生疼痛，0.3%~0.6%的病人出现出血，严重者甚至可导致死亡^[5]，因此寻求无创、有效的HF诊断及分期的方法成为当前研究的热点。

       钆塞酸二钠(gadolinium ethoxybenzyl diethylenetriamine pentaacetic acid，Gd-EOB-DTPA)兼具细胞外间隙及肝细胞对比剂特性^[6]，基于Gd-EOB-DTPA的磁共振纵向弛豫时间成像(T1 mapping)不仅可通过直接测量增强前后的T1值的变化反映对比剂分布情况，还可以通过间接测量肝细胞外容积(extracellular volume fraction，ECV)变化反映HF时细胞外体积变化^[7,8]，所以T1 mapping具有量化HF的潜在优势。因此，本研究拟探讨基于Gd-EOB-DTPA的T1 mapping成像技术定量评估HF的价值，为HF无创诊断及治疗提供影像学依据。

1　材料与方法

1.1　动物模型

       本研究经苏州大学附属第三医院伦理委员会审核批准。前瞻性纳入100只新西兰雌性健康大白兔(苏州大学动物实验中心提供)，6月龄，体重2.0~2.6 kg，随机分为HF组(n=80)和正常对照组(n=20)。HF组通过颈背部皮下注射50%CCl4油溶液(100%CC14与橄榄油1∶1混合)，每周注射1~2次，第1~3周剂量0.1 mL/kg，第4~6周剂量0.2 mL/kg，第7~10周剂量0~3 mL/kg；对照组实验兔接受同剂量、等频率的生理盐水注射。

1.2　MRI扫描方案

       MR扫描采用Philips Ingenia 3.0 T超导磁共振扫描仪，18通道相控阵膝关节线圈。扫描前兔禁食12 h，肌注水合氯醛4 mL/kg，仰卧位下用腹带固定腹部抑制呼吸。在第4、5、6、15周末随机选取HF组20只及对照组5只兔行轴位肝脏MRI扫描：①轴位T1WI；重复时间/回波时间=400/18 ms，翻转角=90°，层厚=4 mm，层间距=0.4 mm。②采用改良Look Locker序列分别于增强前、增强后10、20 min获取T1 mapping图像：重复时间/回波时间=3/1 ms，翻转角=20°，层厚=4 mm，层间距=0.4 mm。

1.3　图像分析

       所有图像均传送至Philips工作站，由两位腹部影像研究方向的医师在双盲前提下对获取的MR图像分别进行独立分析，如遇分歧则通过讨论解决。在T1native、T110 min、T120 min的图像上避开肝血管、胆管、肝脏边缘后，分别在肝左、中、右叶勾画ROI，ROI面积为15~20 mm²，获取的参数平均值作为最后肝脏的T1native、T110 min、T120 min的定量参数值。最后，通过公式获取ECV参数值，ECV=(1/LT1post-1/LT1native)/(1/AT1post-1/AT1native)×(1-HCT)，其中T1native为增强前肝脏T1值，T1post为增强后(10、20 min)T1值，AT1native为腹主动脉增强前T1值，AT1post为腹主动脉增强后(10、20 min)的T1值，HCT为血细胞比容(hematocrit)。

1.4　病理学检查

       扫描后利用空气栓塞致死实验兔，取兔肝脏10%福尔马林溶液浸泡，甲醛固定后制石蜡切片，行Masson染色后两名富有经验的病理医师于显微镜下进行Metavir分期：F0：无HF；F1：门静脉汇管区扩大，局限窦周、小叶内纤维化；F2：汇管区周围纤维化或少量间隔形成，小叶结构保留；F3：大量纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；F4：肝硬化。

1.5　统计学分析

       采用SPSS 22.0和MedCalc 18.2软件进行统计学分析。Kolmogorov-Smirnov检验计量资料是否符合正态分布，正态分布数据则用±s表示。采用Spearman相关性分析各定量参数值(T1native、T110 min、T120 min、ECV10 min、ECV20 min)与HF分期的相关性，并以相关系数r值的绝对值大小表示相关性高低，|r|>0.7、|r|=0.4~0.7、|r|=0.2~0.4分别代表强、中等、弱相关，|r|<0.2表示无相关性。使用单因素方差分析的LSD方法比较各HF分期之间定量参数值的差异性。应用ROC曲线方式分析各定量参数值鉴别诊断F0 vs F1-F4(≥F1)，F0-F1 vs F2-F4(≥F2)，F0-F2 vs F3-F4(≥F3)，F0-F3 vs F4(F4)的价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　兔HF模型和病理学结果

       在初步纳入的100只实验兔中，7只HF兔因CC14不耐受死亡，3只HF组和3只正常对照组兔麻醉时意外死亡而排除，2只正常对照兔因呼吸运动伪影造成的T1 mapping图像质量较差而未纳入，最终HF建模成功及完成MR扫描85只。如表1所示，F0、F1、F2、F3、F4期分别为14、19、15、19、18只。HF病理特征及T1 mapping图像如图1所示。

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图1  A、E、I：F0、F2、F4期HF病理图(×100)；B、F、J：T1native伪彩图，T1native测量值为582.31、651.28、700.47 ms。C、G、K：T110 min伪彩图，T110 min测量值为311.22、358.43、437.19 ms。D、H、L：T120 min伪彩图，T120 min测量值为298.34、347.56、415.27 ms
Fig. 1  Representative masson’s trichrome staining, T1native, T110 min and T120 min images of HF stages F0, F2, F4. A, E, I: HF stages F0, F2, F4 (Masson’s trichrome, 10×10). (A) Stage F0. (E) Stage F2. (I) Stage F4. B, F, J: T1native, maps of rabbit liver. (B) stage F0, T1native value = 582.31 ms; (F) stage F2, 651.28 ms; (J) stage F4, 700.47 ms. C, G, K: T110min maps of rabbit liver. The T110 min value was 311.22 ms, 358.43 ms, and 437.19 ms for stage F0 (C), F2 (G), F4 (K), respectively. D, H, L: T120 min maps of rabbit liver. (D) F0 stage, T120 min value= 298.34 ms; (H) F1 stage, 347.56 ms; (L) F2 stage, 415.27 ms.

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表1  不同HF分期T1 mapping及ECV参数值
Tab. 1  Summary values of T1 mapping and ECV parameters in different HF stages

2.2　T1 mapping定量参数与HF进展相关性

       如图2所示，T120 min、ECV20 min随着HF进展均呈明显正相关(r=0.818、0.766，P<0.001)，T1native和T110 min与HF进展有中等正相关(r=0.685、0.428，P<0.001)，而ECV10 min呈现出弱相关性(r=0.278，P=0.01)。

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图2  T1native (A)、T110 min (B)、T120 min (C)、ECV20 min (D)与HF进展箱式图
Fig. 2  Boxplot of T1native (A), T110 min (B), T120 min (C) and ECV20 min (D) values with HF ranging from F0 to F4.

2.3　不同分期T1 mapping定量参数值比较

       如表1所示，正常对照组和HF组(F1-F4)5个定量参数值(T1native、T110 min、T120 min、ECV10 min、ECV20 min)差异均具有统计学意义(P<0.05)。除F1 vs F2和F3 vs F4期，其余各期HF组两两比较T1native差异均有统计学意义(P<0.05)。T110 min在F0 vs F2，F1 vs (F2、F3、F4)，F3 vs F4组差异无统计学意义(P>0.05)，其余各组T110 min差异具有统计学意义(P<0.05)；T120 min可有效鉴别除F0 vs F1外的其余各HF组；除F0 vs F4期ECV10 min值有明显差异外(P<0.05)，其余各组ECV10 min两两比较差异均无统计学意义。对于ECV20 min值，除F0 vs F1，F2 vs F3期ECV20 min值有统计学差异外(P>0.05)，其余各组ECV20 min值两两比较均有统计学意义(P<0.05)。

2.4　ROC曲线分析

       T120 min鉴别诊断≥F1、≥F2、≥F3、≥F4的AUC分别为0.90、0.93、0.93、0.92，整体高于ECV20 min(AUC=0.85、0.89、0.89、0.95)和T1native (AUC=0.98、0.81、0.85、0.76)，T110 min (AUC=0.80、0.68、0.76、0.66)及ECV10 min (AUC=0.65、0.65、0.66、0.65)诊断价值较低，如表2和图3所示。

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图3  T1native、T110 min、T120 min、ECV10 min、ECV20 min鉴别诊断≥F1(A)、≥F2(B)、≥F3(C)、≥F4(D)的ROC曲线
Fig. 3  Receiver operating characteristic curves analyzing the ability of T1native, T110 min, T120 min, ECV10 min and ECV20 min in identifying HF stages ≥F1(A), ≥F2(B), ≥F3(C), and≥F4(D), respectively.

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表2  T1 mapping参数值鉴别诊断HF分期的效能
Tab. 2  Efficiency of T1 mapping parameters in differenting HF stages

3　讨论

3.1　实验背景

       前期研究证实通过直接测量Gd-EOB-DTPA增强MRI肝脏信号强度、肝脾信号比评价HF及肝功能损伤^[9,10]，但肝脏信号强度与对比剂浓度并不具备明显线性相关性，且信号强度易受扫描序列、参数及技术的影响，导致通过直接测量信号强度的方法评价HF及肝功能损伤存在争议。T1弛豫时间是反映质子纵向弛豫的绝对值并与对比剂浓度呈线性相关，因此基于T1 mapping成像测量的肝脏T1弛豫时间比直接测量信号强度更客观、稳定，还可以直接用于不同时间点采集序列之间的比较^[7,11]。

3.2　T1 mapping各参数值结果以及原因分析

3.2.1　T1native分析

       本研究发现T1 mapping成像的平扫T1native参数值与HF进展呈现明显正相关性并具有较高的诊断、鉴别诊断效能。T1native反映肝细胞及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分及含量，HF时伴随的慢性肝损伤导致肝细胞功能障碍^[12]，大量缺乏内皮细胞的新生血管产生，纤维蛋白及红细胞进入ECV，肝脏的含水量增加，因此平扫T1native值与HF进展呈增加趋势，但T1native值难以有效鉴别诊断F1 vs F2和F3 vs F4期，推测原因是早期HF细胞外基质沉积差异较小以及晚期HF伴随的铁沉积干扰。

3.2.2　T110 min及T120 min分析

       Gd-EOB-DTPA是肝细胞特异性对比剂，较常规非特异性肝对比剂可被肝细胞膜上有机阴离子转运多肽(organic anion transport polypeptide，OATP)摄取进入肝细胞内^[13]。Zhou等^[14]和Sheng等^[15]研究发现基于Gd-EOB-DTPA的T1 mapping成像可有效鉴别诊断HF和评价肝功能损伤，这主要是由于随着HF进展导致的进行性、功能性肝细胞受损、数量减少，OATP表达减低^[15]，加之胶原纤维在细胞外间隙沉积导致Gd-EOB-DTPA单位时间内进入肝细胞的量越少，从而引起肝细胞摄取Gd-EOB-DTPA减少。Gd-EOB-DTPA随着HF进展吸收减少，必然导致磁共振对比剂缩短肝脏T1的效能减低，因此T1 mapping增强后T110 min、T120 min值随着HF进展呈增加趋势。

3.2.3　T110 min及T120 min分析诊断价值比较

       但是，比较分析增强后10、20 min的T1值鉴别诊断HF的国内外研究未见报道。目前认为标准的肝胆期是在注射对比剂后20~40 min^[16]，本研究对比分析发现各期T120 min值虽然较T110 min值低，但呈现出更高的正相关性，且鉴别诊断各期HF的价值(AUC=0.90、0.93、0.93、0.92)高于T110 min值(AUC=0.80、0.68、0.76、0.66)，提示T120 min值成像更适用于评价HF进展。这主要是与Gd-EOB-DTPA药代动力学有关：Gd-EOB-DTPA在20 min时的肝特异期可进入肝细胞内，肝细胞随着HF进展OATP受损、减少从而引起Gd-EOB-DTPA吸收减少，加之在对比剂注射20 min后Gd-EOB-DTPA被肝细胞特异性吸收进入细胞内，细胞外间隙内对比剂相比T110 min更少，从而导致肝脏T1值进一步减低，因此各期HF的T120 min值较T110 min值小。而10 min时仍处于Gd-EOB-DTPA由细胞外间隙吸收进入细胞内的过程中，因此T120 min相比于T110 min加大了各HF分期的T1值的差距，所以T120 min鉴别诊断HF的价值更高，提示T120 min值更适用于诊断及鉴别诊断HF，为今后肝脏Gd-EOB-DTPA增强磁共振成像诊断HF时间点的选择提供了影像学依据。

3.2.4　ECV10 min及ECV20 min分析

       通过测量T1 mapping成像增强前后T1值的变化得出的ECV值能反映组织内对比剂分布，且不受患者心率快慢、磁共振对比剂计量、血细胞比容的影响。既往研究证实ECV值能无创性有效评估心肌纤维化、心肌水肿及淀粉样变^[11,17]，但关于Gd-EOB-DTPA增强后10、20 min的ECV值评价HF的研究未见报道。ECV值反映肝脏细胞外间隙大小，随着HF进展，胶原纤维为主的细胞外基质沉积引起细胞外体积增大，因此ECV参数值与HF进展存在理论上的正相关。本研究除证实ECV10 min和ECV20 min与HF进展具有正相关性于上述理论相符外，还提示ECV20 min鉴别诊断各期HF的价值高于ECV10 min，这主要可能是由于10 min时Gd-E0B-DTPA在细胞外间隙残留加上HF伴随的炎症水肿、铁沉积^[18,19]引起细胞外间隙不稳定导致ECV10 min诊断HF价值较低。

3.3　不足与展望

       本研究也存在以下不足：首先，由于相对较高的兔死亡率和严重的呼吸和运动伪影，最终只有85只兔纳入研究，所以在后续的动物实验需要防止高死亡率和避免严重的伪影。其次，由CCl4诱导的兔HF模型可能无法准确反映人肝脏的病理变化。因此，需要在临床研究中进一步证实T1 mapping和ECV定量参数值鉴别诊断HF的价值。第三，HF的病理变化同时包含肝脏炎性反应、脂肪变性及铁沉积^[20]，这些异质性因素可能影响T1 mapping和ECV定量参数与HF相关性评价。

       综上所述，基于Gd-EOB-DTPA的增强T1 mapping成像定量参数及ECV值与HF进展密切相关，且对诊断及分期具有较大的诊断及鉴别诊断价值，可作为临床HF分期、疗效评估的有效影像学参数值。