肝纤维化早期为可逆过程^[1]，但肝纤维化晚期难以逆转，因此，肝纤维化准确分期诊断具有重要意义。目前，有创的肝脏穿刺活检是分期诊断肝纤维化的"金标准"，但存在一定的不足和风险。在无创的影像学诊断方法中，MRI是公认的最佳影像学手段^[2]，其中，基于水分子高斯分布的扩散加权成像(diffusion weighted imaging，DWI)可以为肝纤维化分期诊断提供重要价值^[3]，但实际上生物体内水分子运动呈非高斯分布状态，经典DWI序列并不能真实反映体内水分子的扩散情况。而基于非高斯分布的扩散峰度成像(diffusion kurtosis imaging，DKI)作为一种反映真实水分子扩散微观结构的磁共振新技术，逐渐被应用于肝脏纤维化诊断研究中^[4,5]。有研究表明，肝脏内各肝叶肝纤维化期别不完全一致，而多数研究者将肝脏整体作为研究对象并不能准确反映各肝叶肝纤维化期别。本研究依据兔肝纤维化模型，将每个肝叶作为研究对象，旨在探讨DKI相关参数在兔肝纤维化分期诊断中的应用价值。

1　材料与方法

1.1　实验对象

       大连医科大学动物实验中心清洁级新西兰雄性大白兔，兔龄6~8个月，体重2.5~3.0 kg。造模分2批进行，第一批15只，第二批20只，随机分成实验组(30只)、对照组(5只)。大白兔分笼饲养1周。实验组大白兔颈部皮下注射四氯化碳与橄榄油混合溶液，每周2次，第1~3周0.1 mL/kg、4~6周0.2 mL/kg、7~10周0.3 mL/kg，对照组大白兔颈部皮下注射相同剂量的生理盐水。造模过程中密切关注大白兔神态、毛色、毛量、体重及饮食情况。两批实验组造模开始时间间隔3周，造模方式相同。本实验通过大连医科大学动物伦理审查委员会批准。

1.2　扫描方法及参数

       注射药物后的第5、6、7、10周末，大白兔禁食8 h、禁水4 h。MR扫描前，经耳缘静脉按照2.5 mL/kg注射10%水合氯醛深度麻醉；MR扫描时，大白兔取仰卧位，腹带固定，选用美国GE Discovery MR750W 3.0 T超导型磁共振成像系统(8通道膝关节HD线圈)采集FSE AX fs T2WI、FSE AX T1WI及DKI图像，扫描参数如下：FSE AX fs T2WI：TR 2000 ms，TE 50 ms，层厚4.0 mm，层间距1.0 mm，FOV 20 cm×16 cm，矩阵256×192，层数13，扫描时间1 min 40 s；FSE AX T1WI：TR 4000 ms，TE 2.9 ms，层厚4.0 mm，层间距1.0 mm，FOV 20 cm×16 cm，矩阵192×192，层数13，扫描时间1 min 47 s；DKI：TR 4000 ms，TE 73.3 ms，层厚4.0 mm，层间距1.0 mm，FOV 20 cm×20 cm，矩阵64×64，层数13，b值=0、500、1000 s/mm²，激励次数4，方向30°，扫描时间9 min 24 s。

1.3　病理图像

       MR扫描后，立即经耳缘静脉注射空气处死大白兔，并行剖腹手术取出肝脏，观察并记录肝脏大小、形态、颜色、质地等。用10%福尔马林固定标本24~48 h后取病理组织，避开肝脏边缘及胆囊，用常规石蜡包埋切片，行HE及Masson染色获取病理图像(图1)。由两名病理科教授根据METAVIR标准^[6]，以每个肝叶为单位分期肝纤维化：F0：正常肝组织，F1：汇管区扩张，F2：少量纤维间隔形成，F3：大量纤维间隔形成，F4：肝硬化。将其分为3组：正常组(F0)、早期肝纤维化组(F1-F2)、晚期肝纤维化组(F3-F4)。

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图1  肝纤维化Masson染色(×100)。A：F0，正常肝组织；B：F1，汇管区扩张；C：F2，少量纤维间隔形成；D：F3，大量纤维间隔形成；E：F4，肝硬化
Fig. 1  Masson’s staining in liver fibrosis (×100). A: F0, normal liver tissue; B: F1, fibrous portal expansion; C: F2, few bridges or septa; D: F3, numerous bridges or septa; E: F4, cirrhosis.

1.4　图像分析及诊断方法

       在GE AW 4.6后处理工作站，依据病理结果获取的DKI伪彩图像及由DKI拟合生成的参数包括部分各向异性分数(fractional anisotropy，FA)、平均扩散度(mean diffusion，MD)、平均扩散峰度(mean kurtosis，MK)值(图2)。根据病理结果选取F0、F1、F2、F3、F4对应肝叶的连续3个最大层面，分别在每层肝叶放置3个ROI，每个ROI面积约为20 mm²，尽量避开伪影、肝内血管、胆管、胆囊以及肝缘等区域。F0、F1、F2、F3、F4对应肝叶的FA、MD、MK值均为连续3个层面内ROI的平均值。

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图2  肝纤维化F3期MR图像。A：FSE AX fs T2WI；B：FA图(FA=0.458)；C：MD图(MD=1.568 μm²/ms)；D：MK图(MK=1.245)
Fig. 2  MR images from a stage F3 fibrosis. A: FSE AX fs T2WI; B: Mean values (0.458) shown by the FA map; C: Mean values (1.568 μm²/ms) shown by the MD map; D: Mean values (1.245) shown by the MK map.

1.5　统计学方法

       所有计数资料均采用均数±标准差表示，运用SPSS 21.0统计分析软件，采用单因素方差分析进行多组间两两比较，方差分析前对各组数据进行Levene方差齐性检验；采用Spearman等级相关分析探讨DKI各参数与肝纤维化分期之间的相关性，对于有统计学意义的参数，绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，评价各参数对肝纤维化分期的诊断效能，计算曲线下面积(area under curve，AUC)，选取最大约登指数为临界值(Cut off)，计算各参数的敏感度和特异度，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

       实验组造模过程及麻醉过程中各死亡1只大白兔；获取肝纤维化各期肝叶数分为F0=10、F1=14、F2=14、F3=14、F4=14(表1)。FA值与肝纤维化分期呈正相关(r=0.499，P<0.01)；MD值与肝纤维化期别呈负相关(r=-0.537，P<0.01)；MK值与肝纤维化期别呈正相关(r=0.635，P<0.01)；FA、MD、MK在各组间均有统计学差异(P<0.05)(表2)；F0/F1-F2中，MK、MD、FA的AUC分别为0.875、0.886、0.809(P<0.01)(图3A)，提示MD值诊断效能最高(Cut off值为0.643，灵敏度为100%，特异度为64.3%)；F0/F3-F4中，MK、MD、FA的AUC分别为0.957、0.975、0.904(P<0.01)(图3B)，提示MD值诊断效能最高(Cut off值为0.964，灵敏度为100%，特异度为96.4%)；F1-F2/F3-F4中，MK、MD、FA的AUC分别为0.751、0.663、0.661(P<0.05)(图3C)，提示MK值诊断效能最高(Cut off值为0.571，灵敏度为96.4%，特异度为60.7%)(表3)。

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图3  DKI参数(FA、MD、MK)诊断肝纤维化分期ROC曲线。A：FA、MD、MK在F0/F1-F2中诊断效能；B：FA、MD、MK在F0/F3-F4中诊断效能；C：FA、MD、MK在F1-F2/F3-F4中诊断效能
Fig. 3  Receiver operating characteristic (ROC) analysis based on pharmacokinetic parameters of DKI. A: FA, MD, MK in F0 vs F1-F2; B: FA, MD, MK in F0 vs F3-F4; C: FA, MD, MK in F1-F2 vs F3-F4.

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表1  肝纤维化不同病理分期与DKI参数比较
Tab. 1  Comparison between different pathological stages of liver fibrosis and DKI parameters

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表2  DKI参数在肝纤维化组间比较
Tab. 2  Comparison of DKI parameters between liver fibrosis groups

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表3  DKI参数对肝纤维化各组别的诊断效能
Tab. 3  Diagnostic efficacy of DKI parameters for liver fibrosis groups

3　讨论

       DKI作为一种无创性诊断肝纤维化的影像学方法，能反映水分子真实扩散运动，同时又能定量分析肝纤维化过程中肝脏内部微观结构变化。DKI需要多个较高b值，b值越高，越能体现局部水分子扩散的非高斯分布，但随着b值的逐渐增高，导致图像信噪比降低，影响图像后处理及数据测量的准确性。根据以往研究^[7]，本研究选取3个b值，分别为0、500、1000 s/mm²，能有效减弱血流灌注对信号采集的影响，既能保证DKI反映真实水分子的扩散运动和图像的质量，又能有效缩短扫描的时间。

3.1　DKI相关参数与肝纤维化分期的相关性

       DKI参数包括MD、MK、FA，其中MD值反映水分子的扩散运动。本研究结果显示随着肝纤维化程度的进展，MD值与肝纤维化分期呈显著负相关(r=-0.573，P<0.01)，提示纤维化过程中，由于大量胶原纤维在肝内沉积，导致肝内水分子数量减少，同时伴有肝细胞变性水肿、炎症细胞浸润^[8]，限制了水分子的扩散运动，导致MD值逐渐减小。本研究结果与Anderson等^[9]研究结果一致；FA值反映水分子运动的方向性。本研究结果显示随着肝纤维化程度的进展，FA值与肝纤维化分期呈显著正相关(r=0.499，P<0.01)，提示随着肝纤维化病程进展，肝内纤维束增多^[10]，使水分子扩散沿主轴方向比较明显，导致FA值逐渐增大。本研究结果与Taouli等^[11]研究结果一致，说明FA值能反映肝纤维化进程中微观结构的变化，有助于反映肝内纤维束变化的趋势。MK值作为DKI中最具特征性的参数，主要反映组织结构的复杂性。本研究结果显示随着肝纤维化病程的进展，MK值与肝纤维化分期呈显著正相关(r=0.635，P<0.01)，提示随着肝纤维化进展，肝内胶原纤维沉积增多，肝内细胞微观结构的复杂性增加^[12]，MK值逐渐增大。本研究结果与Sheng等^[13]研究结果一致。但盛若凡等^[14]探究DKI模型在大鼠炎症分级及肝纤维化分期中的诊断价值，结果表明MD值与炎症分级及肝纤维化分期呈负相关(r=-0.590、0.650，P<0.01)，MK值与其无相关性，可能原因为K值在肝纤维化分期中重叠性较高有关。

3.2　DKI相关参数在肝纤维化分期中的诊断效能

       李洁^[15]分析家兔DKI图像探讨DKI相关参数对家兔肝纤维化分期的诊断效能，结果显示FA、MD、MK值均可用于定量评价肝纤维化分期；Yoshimaru等^[16]通过分析肝纤维化病人DKI图像，发现MK值能区分早期肝纤维化和晚期肝纤维化组，MK、MD值均能区分早期肝纤维化和肝硬化组、晚期肝纤维化和肝硬化组；Sheng^[13]等及Hu等^[17]通过分析肝纤维化大鼠DKI图像，均发现MD值是诊断肝纤维化、晚期肝纤维化、肝硬化最优的参数。本实验ROC曲线结果显示，FA、MD、MK值均能区分早、晚期肝纤维化组(AUC均>90%，P<0.01)，提示FA、MD、MK值鉴别正常肝组织与肝纤维化晚期有较高的准确性。FA、MD、MK值均能区分正常肝组织与早期肝纤维化组，MK值能区分早、晚期肝纤维化组(AUC均>70%，P<0.01)，提示FA、MD、MK值鉴别正常肝组织与肝纤维化早期、MK值鉴别肝纤维化早期与肝纤维化晚期有一定准确性；FA值区分早、晚期肝纤维化组的诊断效能较低(AUC=66.1%，P<0.05)，但赵广强等^[18]比较DWI及扩散张量成像在家兔肝纤维分期诊断价值，发现FA值区分早、晚期肝纤维化组的诊断效能低于ADC值(AUC=96.4%、38.4%，P<0.05)，可能说明扩散峰度成像在反映肝纤维化严重程度上优于扩散张量成像。因此，在肝纤维化分期诊断中，MD值是区分正常肝组织与早期肝纤维化组、正常肝组织与晚期肝纤维化组最佳的参数；MK值是区分早、晚期肝纤维化组最佳的参数。本实验结果与Hu等^[17]研究结果相似，但本研究对肝纤维化早期、晚期进行明确分组，以及采用全部肝叶作为研究对象，增加样本量的同时，能较为精确反映肝纤维化分期中细微变化。

       本研究存在以下几方面局限性：首先，病理大体上取材部位与影像图像上感兴趣区不能完全对应，易导致结果误差；其次，MR扫描过程中，家兔呼吸伪影对图像观测有一定影响；最后，本实验并未进一步研究肝纤维化分期在同一肝叶是否相同。

       总之，DKI作为无创性的磁共振功能成像技术，能较早且准确地反映肝纤维化过程中病理生理改变及组织微观结构的变化。