在世界范围内，脑卒中是主要致死和首要致残病因^{[1, 2, 3]}。在我国脑血管病所造成的经济和社会负担更为严重，每年直接治疗支出为680亿人民币^[2]。在脑血管病亚型中，近70%的患者为缺血性脑卒中^{[4, 5]}，其中临床最常见的责任病变是头颈部大动脉粥样硬化^{[6, 7, 8]}。作为传统血管造影技术，如CT血管造影（CT angiography, CTA）、磁共振血管造影（magnetic resonance angiography, MRA）或数字减影血管造影（digital subtraction angiography, DSA）的重要补充，磁共振管壁成像（magnetic resonance vessel wall imaging, MR-VWI）越来越广泛地应用于脑血管病的诊断和随访^{[9, 10, 11, 12]}。MR-VWI可以很好地定性和定量评价血管腔、管壁及其病变情况，直观评估动脉粥样硬化斑块的形态、成分、斑块负荷和稳定性等。

       近年来，各种3D MR-VWI成像序列也被逐渐开发和应用^{[13, 14, 15, 16, 17]}。3D管壁成像实现了各向同性高空间分辨率、高信噪比、大覆盖范围的管壁成像，克服了2D技术扫描速度慢、覆盖范围小等缺点，例如头颈联合扫描可以一次成像将头颈部的动脉管壁完整且连续地呈现，也可提供T1、T2和重T1等多对比加权图像^[18]，无疑将提高脑血管病的病因探查效率。可变翻转角快速自旋回波序列（通用医疗称为CUBE序列）是目前临床应用较广的3D管壁成像序列。另外，血流抑制技术与3D MR-VWI联合可进一步增强管壁病变的对比噪声比^[19]，近年来一种新兴的3D黑血预脉冲序列——延迟交变章动调整激发（delay alternating with nutation for tailored excitation, DANTE）技术被应用于动脉管壁成像。Sannananja等^[20]研究表明与T1-SPACE相比，血流抑制增强T1-DANTE-SPACE具有较好的信噪比和血液抑制效果、较高的图像质量和较少的图像伪影。然而，DANTE预备序列与3D管壁成像序列联合在对动脉粥样硬化评估的准确性等方面还有待全面和严格的验证。本研究以兔动脉粥样硬化的腹主动脉为研究对象，评价DANTE黑血预脉冲结合CUBE序列对动脉管壁定量评估的可靠性，探索该序列量化评价动脉粥样硬化斑块的实验依据，为将来的临床推广提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

       本研究经过上海长海医院伦理委员会批准（批准编号：CHEC2018-092）。海军军医大学实验动物中心提供纯种成年新西兰大白兔20只（雄:雌=1∶1），体质量2.5～3.4 kg/只，每只单笼饲养，基础饲料适应性喂养两周后随机分为2组，实验组12只，对照组8只。实验组高脂饲料（兔维持饲料79.5%，猪油5%，蛋黄粉15%，胆固醇0.5%）喂养，自由饮水，4周后经股动脉穿刺行球囊拉伤腹主动脉内膜手术^{[21, 22]}，术后继续高脂饲料喂养。对照组始终基础饲料喂养，控制食量，自由饮水。第12周检测所有实验动物的血脂含量。

1.2 磁共振扫描

       兔在磁共振检查前禁食12 h、禁水4 h，扫描过程中采用MRI兼容的动物麻醉机（MSS-3S，上海任谊生物科技有限公司）吸入式麻醉（异氟烷，浓度1.5%～2.0%，流量0.5 L/min）。运用3.0 T磁共振扫描仪（Discovery MR750，GE Healthcare，Milwaukee，美国）和原机自带的32通道腹部线圈覆盖躯干成像，俯卧位、尾先进。扫描序列是冠状位的3D DANTE CUBE T1WI和T2WI，扫描范围从膈肌至腹股沟下缘，成像中心为腹主动脉，层厚1.2 mm，层间距0.6 mm，FOV 200 mm×200 mm，矩阵256×256。其中T1WI的TR 1100.0 ms，TE 12.9 ms，层数92，扫描时间8 min 22 s；T2WI的TR 2000.0 ms，TE 58.6 ms，层数 84，扫描时间5 min 51 s。

1.3 病理检查

       磁共振扫描后将兔处死（10% KCl溶液1 mL/kg耳缘静脉注射），解剖分离出腹主动脉，生理盐水冲洗干净血凝块，将标本固定于10%中性甲醛水溶液，脱钙、整体包埋于石蜡中，连续切片（间距1 mm，层厚10 μm），以右肾动脉开口为原点向两侧依次编号（右肾动脉开口正中层面为0，近心端为负数，远心端为正数），行HE染色。

1.4 图像测量

       利用RadiAnt DICOM Viewer（4.2.1, Medixant, 波兰）软件进行磁共振图像测量，首先在冠状位3D DANTE CUBE原始图像中观察腹主动脉管壁情况，然后进行横轴位薄层重建（重建层厚0.8 mm）。如果腹主动脉管壁有增厚或动脉粥样硬化斑块形成，则选择管腔最狭窄处的层面进行测量；若管壁无增厚，则选择右肾动脉开口处远心端第一层进行测量。手动勾画管腔轮廓，软件可获得管腔面积（lumen area, LA），勾画管壁轮廓可获得血管总面积（total area, TA）（图1A～1D）；由此计算管壁面积（wall area, WA）和标准化管壁指数（normalized wall index, NWI）：WA=TA-LA，NWI=WA/TA。根据DANTE CUBE T1WI和T2WI计算的标准化管壁指数分别用NWIT1和NWIT2表示。上述MRI测量由一名有13年影像诊断经验的副主任医师完成。

       利用病理切片扫描仪NanoZoomer S360（C13220-01，滨松，日本）将玻璃切片在40倍放大模式下转化为高分辨率的数字切片图像，然后在Aperio ImageScope（v12.3.2.8013，Leica Biosystems，美国）软件中进行图像判读及测量。与磁共振图像测量的原则一致，如果腹主动脉管壁有增厚或斑块，则选择管腔最狭窄处的切片进行测量；若管壁无增厚，则选择右肾动脉开口处远心端第一张切片进行测量。手动勾画管腔轮廓，软件可获得LA。管壁轮廓的勾画采用两种方法：勾画血管壁外膜内边缘，获得的血管总面积表示为TAP1；勾画血管壁外膜外边缘，获得的血管总面积表示为TAP2（图1E）；分别计算获得相应的标准化管壁指数分别用NWIP1和NWIP2表示。上述MRI测量由一名高年资的病理科医生完成。

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图1  实验组兔的腹主动脉3D DANTE CUBE图像及病理对照。1A和1B：冠状位DANTE CUBE T1WI原始图像及其横轴位重建图像；1C和1D：冠状位DANTE CUBE T2WI原始图像及其横轴位重建图像；1A和1C中水平黄线分别代表1B和1D横轴位的重建位置，在1B和1D中手动勾画管腔轮廓（绿圈）和管壁轮廓（红圈），图像软件可分别获得管腔面积（标识在血管下方）和血管总面积（标识在血管上方）；1E：兔的腹主动脉病理图像（HE染色，20倍），手动勾画管腔轮廓（1号箭头）、管壁外膜内边缘（2号箭头）和外膜外边缘（3号箭头），图像软件可分别获得相应的面积（标识在图像左下角）。
Fig. 1  3D DANTE CUBE images of abdominal aorta of experimental group of rabbits and pathological image. 1A and 1B: Coronal DANTE CUBE T1WI original image and its transverse axis reconstruction image; 1C and 1D: The original T2WI images of DANTE CUBE in the coronal view and the reconstructed images in the transverse axis. The horizontal yellow lines in 1A and 1C represent the reconstructed positions in the transverse axis of 1B and 1D, respectively. The lumen contour (green circle) and wall contour (red circle) were manually delineated in 1B and 1D. The image software can obtain the lumen area (marked below the vessel) and the total area of the vessel (marked above the vessel) respectively. 1E: Pathological image of the abdominal aorta of rabbits (HE staining, 20×). The lumen contour (arrow No. 1), inner edge of the adventitia (arrow No. 2) and outer edge of the adventitia (arrow No. 3) are manually delineated. The corresponding areas are obtained by image software (marked in the lower left corner of the image).

1.5 统计学方法

       所有数据统计分析采用SPSS（Version 22, IBM SPSS Statistics）和MedCalc（Version 18.2.1, MedCalc Software bvba）软件进行分析。定量数据采用中位数和四分位区间表示。实验组与对照组的血脂水平差异采用Mann-Whitney U检验分析。MR-VWI和病理形态学定量指标在实验组与对照组之间的差异采用Mann-Whitney U检验分析。采用组内相关系数（intraclass correlation coefficient, ICC）、Bland-Altman plots评估磁共振序列之间、磁共振表现与病理之间的NWI一致性。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血脂水平

       磁共振扫描前有1只实验组的新西兰大白兔死亡，其余11只实验组兔和8只对照组兔均顺利完成实验并纳入统计分析。实验组兔的各项血脂指标均明显大于对照组（P＜0.05），具体内容见表1。

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表1  实验组和对照组兔的血脂水平比较
Tab. 1  Comparison of serum lipid levels between experimental group and control group

2.2 管壁形态学指标的定量评估

       在DANTE CUBE T1WI和T2WI的横轴位重建图像中测量并计算管壁形态学指标LA、WA及NWI。与对照组相比，无论T1WI或T2WI，实验组的LA较小、NWI较大，差异具有统计学意义（P＜0.05）；实验组的WA较大，差异无统计学意义（P＞0.05）。另外，根据数字化病理图片的计算结果也发现实验组的NWIP1和NWIP2均明显大于对照组（P＜0.05）。具体内容见表2。

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表2  实验组和对照组的MRI序列及病理的主要管壁形态学参数比较
Tab. 2  Comparison of MRI sequences and main wall morphological parameters of pathology between experimental group and control group

2.3 标准化管壁指数的一致性

       MRI两个序列之间、MRI与病理之间的NWI一致性分析，整体而言，NWIT1和NWIT2之间的一致性较好（ICC=0.7552），NWIT1或NWIT2与NWIP1的一致性次之（ICC=0.438或ICC=0.444），NWIT1或NWIT2与NWIP2的一致性最差（ICC=0.285或ICC=0.292），具体内容见表3和图2。实验组的一致性分析与上述结果类似，NWIT1和NWIT2之间的一致性较好（ICC=0.6056），NWIT1或NWIT2与NWIP1的一致性次之（ICC=0.4123或ICC=0.3409），NWIT1或NWIT2与NWIP2的一致性最差（ICC=0.1941或ICC=0.07998），详见表4。对照组中，NWIT1和NWIT2之间的一致性较好（ICC=0.6304），NWIT1或NWIT2与NWIP1的一致性较差（ICC=-0.1917或ICC=-0.05949），NWIT1或NWIT2与NWIP2的一致性也较差（ICC=-0.1989或ICC=-0.1441），详见表5。

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图2  DANTE CUBE T1WI、T2WI及病理的标准化管壁指数之间的Bland-Altman plots图。2A：T1WI和T2WI的NWI之间的一致性；2B和2C：T1WI的NWI和病理图像中根据管壁外膜内边缘或外膜外边缘计算的NWI之间的一致性；2D和2E：T2WI的NWI和病理图像中根据管壁外膜内边缘或外膜外边缘计算的NWI之间的一致性。DANTE：延迟交变章动调整激发；NWI：标准化管壁指数。
Fig. 2  Bland-Altman plots between DANTE CUBE T1WI, T2WI and pathological normalized wall index. 2A: The consistency between NWI of T1WI and T2WI; 2B and 2C: The consistency between the NWI of T1WI and the NWI calculated according to the inner edge or outer edge of the adventitia in the pathological images; 2D and 2E: The consistency between the NWI of T2WI and the NWI calculated according to the inner edge or outer edge of the adventitia in the pathological images. DANTE: delay alternating with nutation for tailored excitation; NWI: normalized wall index.

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表3  整体NWI在DANTE CUBE T1WI和T2WI之间及其与病理之间的一致性
Tab. 3  Consistency of global NWI between DANTE CUBE T1WI and T2WI and between the NWI and the pathology

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表4  实验组NWI在DANTE CUBE T1WI和T2WI之间及其与病理之间的一致性
Tab. 4  Consistency of NWI between DANTE CUBE T1WI and T2WI and between NWI and pathology in the experimental group

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表5  对照组NWI在DANTE CUBE T1WI和T2WI之间及其与病理之间的一致性
Tab. 5  Consistency of NWI between DANTE CUBE T1WI and T2WI and between NWI and pathology in control group

3 讨论

       本研究以兔腹主动脉管壁为研究对象，定量评价了3D DANTE CUBE黑血成像与病理结果的一致性，发现该管壁成像技术可以量化区分动脉粥样硬化管壁与正常管壁。然而，DANTE CUBE序列的标准化管壁指数与病理的一致性欠佳，尤其对于管壁菲薄的正常血管。

3.1 MR-VWI对病变管壁的量化研究

       管壁成像定量研究的前提在于获得高质量的成像图像和准确勾画管壁轮廓。随着人工智能技术的发展，有越来越多的医学影像研究利用计算机辅助的半自动或全自动勾画感兴趣区，包括勾画血管壁轮廓，但相关软件的勾画精度对于较纤细的血管仍有难度、需要人工审查和调整。目前，手动勾画管壁仍然是管壁成像定量研究的可靠方式，为了确保准确性，本研究的管壁勾画由一名从事血管影像研究十余年的放射科医生完成；在可重复性方面，笔者团队之前通过动物实验也验证了基于DANTE预脉冲的多对比CUBE序列重复扫描和重复测量的组内和组间一致性^{[21, 22]}；另外，为了勾画管壁时更加贴合轮廓，本研究采用了打点式的多边形工具，而非之前研究^{[21, 22]}所采用的椭圆形工具。

       通常对动脉粥样硬化的诊断是利用超声、CTA、MRA以及DSA等活体影像技术发现管腔狭窄或管腔表面不光整。这些技术仅能揭示血管腔的异常，不能完全描述血管壁内的病变，比如在动脉粥样硬化的早期，血管腔通常能够代偿性扩张（正性重塑），以适应斑块的形成，而管腔无明显狭窄^[23]，血管造影很可能会低估病变程度。另外，病理学组织学研究表明狭窄程度相同的斑块之间存在相当大的差异，某些斑块特征与缺血事件的风险增加相关^[24]。因此，将管腔狭窄度作为临床诊疗唯一的评价标准具有巨大的局限性。近25年来的研究表明，动脉粥样硬化斑块的形态和内部结构比单纯的管腔狭窄程度更能准确地评价病灶的稳定性^[23]。经病理组织学证实，利用MR-VWI多对比序列能够对颈动脉斑块的形态和成分进行定性评估^[18]。临床研究表明这些特征能有效地预测有症状或无症状患者的后续脑血管事件^{[25, 26, 27, 28]}。

       利用先进的MR-VWI方法可以识别管腔以外的病变和易损斑块，这一能力引发了一场积极的辩论，即是否需要改变范式，不再依赖于管腔狭窄程度来评估缺血性卒中的风险。Qiao等^[23]通过大量人群证明MR-VWI在颅内动脉粥样硬化狭窄的评估中是一个可靠的工具。为了加快对动脉粥样硬化病变的管壁成像分析和治疗策略的评价，有必要通过合适的动物模型探测影像学的准确性和稳定性^{[29, 30]}。本实验利用微创技术对兔腹主动脉内膜损伤配合高脂饲料喂养可在目标血管获得确切的动脉粥样硬化病变。本研究证明3D DANTE CUBE管壁成像T1WI和T2WI均可明确区分动脉粥样硬化管壁与正常管壁，且经病理组织检查印证；无论是否存在病变，标准化管壁指数（在有斑块的情况下相当于斑块负荷）在T1WI和T2WI中的一致性都较好。

3.2 管壁成像与病理比较的差异分析

       在与病理组织学的比较中，实验组管壁成像的标准化管壁指数（或斑块负荷）更接近于病理管壁外膜內边缘的计算值，而理论上标准化管壁指数应该根据外膜外边缘的测量值计算。笔者团队发现结构相对疏松的外膜形态变异较大，在病理切片制作过程中难免破坏其完整性，导致有时在病理图像中难以勾勒管壁外膜外边缘，因此才增加了对外膜内边缘的勾画。另外，对于管壁无病变的对照组，标准化管壁指数在MR-VWI与病理图像之间的一致性均不理想，说明本研究所运用的3D DANTE CUBE技术在定量测量菲薄的正常动脉管壁时仍面临挑战，分析原因可能包括：（1）本研究MR-VWI图像的空间分辨率有限。磁共振图像测量厚度等定量指标的准确性直接与其空间分辨率相关，空间分辨率有限的情况下可能对微小斑块或菲薄管壁的边界显示模糊，导致测量值较真实值有所夸大。（2）管壁成像图像和病理切片难以精准匹配。尽管本研究按照解剖改变挑选管腔最狭窄处的层面进行测量比较，但磁共振图像和病理切片的厚度不是一个数量级（前者是毫米，后者是微米）。（3）病理切片与活体状态的差别。血管的病理标本经过脱水等处理后管腔塌陷，并且可能伴有管壁褶皱或破坏等改变，其形态学固然与活体MR-VWI存在一定差异。在提高管壁成像的空间分辨率方面，有研究利用超高场强（7.0 T）的磁共振扫描仪将DANTE预脉冲模块与可变翻转快速获取弛豫增强（variable-flip-angle rapid acquisition with relaxation enhancement, VF-RARE）相结合（DANTE-VE-RARE）实现了对小鼠血管有效的血液信号抑制^[31]。

3.3 局限性

       本研究仍存在一些局限：（1）与病理的一致性比较中，考虑到影像与病理的层面匹配难度，本研究仅比较了一个定量参数NWI（仅需要选择最狭窄层面测量），没有测量狭窄率和重构指数等指标（还需要纳入正常管腔为参考）。（2）没有对动脉粥样硬化斑块本身进行定性和定量分析，如斑块成分如何、斑块面积体积的测量等。原因主要是动物模型产生的斑块较小，在MR-VWI图像中难以分辨斑块轮廓和成分等细节。今后笔者将对拟行颈动脉内膜剥脱术患者的颈动脉斑块进行进一步研究，以便在体积较大的症状性斑块中验证黑血管壁成像的准确性。在提升管壁成像的空间分辨率方面，可以采用更高场强的磁共振仪、更多通道的表面线圈或者更加优化的管壁成像序列等措施。

       综上所述，黑血DANTE预脉冲3D CUBE磁共振管壁成像可以量化区分兔腹主动脉粥样硬化病变管壁与正常管壁。根据标准化管壁指数一致性分析，DANTE CUB的T1WI和T2WI序列之间的一致性较好，而DANTE CUBE与病理的一致性欠佳，提示该技术在定量分析血管壁小病变或菲薄管壁时需要谨慎判断，为将来该技术运用于活体动脉粥样硬化斑块的量化研究提供了实验参考。