静脉血栓栓塞（venous thromboembolism, VTE）是常见的公共卫生疾病。其发病率随着患者年龄的增长而增加，约为每年88/10万至112/10万^{[1, 2]}。VTE的主要危害在于由它引起的多种并发症，且复发概率极高。最新的指南指出：早期病程的VTE患者经过抗凝治疗后，其复发的风险远低于中晚期患者，因此静脉血栓的早期发现显得尤为重要^{[3, 4, 5]}。临床上VTE常采用肝素进行抗凝治疗，但肝素可能导致人体过敏或不耐受，如肝素诱导的血小板减少症，长期过量使用还可能导致严重的骨质疏松症^[1]。因此，在临床上按照风险级别的不同，其治疗方案的肝素用量有很大的差别，并需要随着病情变化不断地调节肝素用量：高风险的患者在VTE事件后仍有症状加重的风险，需长期抗凝；风险级别较低的患者，可不推荐抗凝治疗，但是根据最新的临床指南，低风险中有VTE复发可能的患者需长期进行超声或临床门诊随访检查[孤立的远端深静脉血栓（deep venous thrombosis, DVT）]，而不是没有目的的抗凝治疗^[6]。这说明可靠的诊断方式对患者治疗方案的制订有极为重要的作用。

       VTE常用的检测手段为两点式静脉超声检查，但患者的静脉血流速度和呼吸的相位变化都可能引起微小的多普勒信号改变，使得微小的静脉血栓信号无法与血流信号区别开来^{[7, 8]}。基于MRI的高分辨成像技术因其极高的空间分辨率，已逐渐被应用于VTE的早期检测，且临床随机对照结果较好^{[9, 10, 11, 12]}。但极早期的小静脉血栓检测仍然存在挑战^[13]。纤维蛋白是血栓的特异成分，在血栓的进展中有重要作用，美国EPIX制药公司研发的EP2104R是一种基于钆和靶向纤维蛋白多肽的分子影像探针，并且在血栓的成像研究中已经取得进展^{[14, 15]}。同时我们注意到钆在肾功能患者的应用受限及其潜在的副作用，由于氧化铁有信号对比度高和生物可降解等优势，本研究制备一种含氧化铁的靶向血栓纤维蛋白的探针，辅助血栓的MRI精准成像，提高VTE患者的检测效率，为临床提供精确的诊断信息，以指导高效的治疗，同时保证患者的安全性^{[16, 17, 18]}。

1 材料与方法

1.1 实验动物

       雌性SD大鼠25只购于重庆医科大学实验动物中心并于SPF级动物喂养中心饲养，10～12周龄；体质量（280±17.10）g，所有的实验均通过重庆医科大学动物伦理委员会审核（批准文号：2021〔203〕号）。

1.2 主要试剂和仪器

       分子量8000 Da的PLGA（50∶50，山东济南岱罡生物工程有限公司），油酸修饰的氧化铁纳米粒子（Fe3O4，美国大洋纳米科技有限公司），CREKA多肽及CREKA-FITC（江苏强耀生物科技有限公司）。聚乙烯醇（polyvinyl alcohol, PVA）、2-吗啉乙磺酸（MES）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（美国Sigma-Aldrich公司）；二氯甲烷、异丙醇（成都科龙化工试剂厂）、丙酮（川东化工集团有限公司）；DiI染色剂（上海碧云天生物技术有限公司）。

       马尔文粒径仪（Zetasizer Nano ZS90，英国马尔文仪器有限公司），超声波破碎仪（Sonics & Materials Inc., Newtown, CT, USA），流式细胞仪（FACS Vantage，美国Becton Dickinson公司），倒置荧光显微镜（CKX41，日本奥林巴斯公司），3.0 T MR扫描仪（Prisma，德国西门子公司），透射电子显微镜（Hitachi 7500，日本日立公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针制备

       采用改进的W/O/W法制备了载有Fe3O4的纳米探针^{[3, 4, 5, 6]}。该方法在3 mL二氯甲烷加入50 mg的PLGA和200 μL的油酸修饰的氧化铁，内水相为0.2 mL双蒸水，外水相为8 mL 4%聚乙烯醇溶液。首先，用超声波破碎仪对PLGA、Fe3O4与二氯甲烷乳化3 min，在上述溶液中加入4%的PVA溶液8 mL，继续乳化3 min，将2%的异丙醇溶液加入最终制得棕黄色悬浊液，连续磁力搅拌直至二氯甲烷完全挥发，纳米颗粒表面固化。

       接着采用碳二亚胺方法，使PLGA表面的羧基端与CREKA表面的氨基形成酰胺键制备了Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针。在0.1 M MES缓冲液（pH=5.5）中加入适量的EDC和NHS（摩尔比为2∶1）以活化Fe3O4-PLGA纳米颗粒的羧基，并将混合物放入摇床中孵育3 h。其次，用0.1 M MES缓冲液（pH=8）离心后再次溶解混合物（高速冷冻离心机，Eppendorf）。然后加入5 mg的CREKA多肽，反应12 h，用双蒸水清洗Fe3O4-PLGA-CREKA纳米粒子3次，用以除去未反应的物质，最后用双蒸水重悬稀释至10 mL。同时以不加CREKA多肽的NPs作为非靶向组，整个制作过程是在4°C的冰浴中进行的。

       制备携DiI的NPs时，加入PLGA与适量DiI到二氯甲烷中，以分别制备Fe3O4-PLGA/DiI-CREKA NPs（靶向组）、Fe3O4-PLGA/DiI NPs（非靶向组）。

1.3.2 Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针的理化特性

       首先，将200 μL的Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针或Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针在双蒸水中稀释至10 mL，用注射器提取1滴，沉淀在200目铜网上。当样品干燥后，采用透射电子显微镜观察纳米探针的结构和形态；将CREKA/FITC代替CREKA连接在Fe3O4-PLGA NPs后，使用流式细胞仪检测Fe3O4-PLGA-CREKA NPs对CREKA的连接率；使用马尔文粒径仪在25°C下测定不同纳米探针的大小和表面Zeta电位。

1.3.3 Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针的生物安全性

       选择对数生长期的HUVEC细胞，按照2×10⁴每孔，过夜后加入不同浓度的纳米探针（0、0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、1.25 mg/mL；n=6），孵育24 h后用PBS清洗三次，每孔加入10 μL的CCK-8检测液（北京索莱宝），待变色后置于酶标仪进行检测。根据CCK-8结果选取1.25 mg/mL的浓度进行凋亡实验，HUVEC按照每孔5×10⁵加入12孔板，过夜后分别加入1.25 mg/mL的Fe3O4-PLGA-CREKA及DMEM培养基，孵育24 h后，PBS清洗胰酶消化收集细胞，采用凋亡试剂盒染色（北京索莱宝），流式细胞仪上机检测。

       通过H&E染色评价Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针对主要器官的毒性作用，随机分组，注射纳米粒或者生理盐水3 h或24 h后收集大鼠的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏），进行H&E染色，观察有无细胞损伤以验证纳米粒的体内生物安全性。

1.3.4 靶向纤维蛋白Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针体外血栓的靶向性

       采用冷冻包埋剂包埋血凝块，制作厚度10 μm的冰冻切片，冰丙酮将切片固定10 min，以此来保持血凝块原有的结构，PBS冲洗两次。在37 ℃下，分别用5 mg/mL的靶向纳米探针和非靶向纳米探针，进行2 h孵育，PBS冲洗3次，然后在倒置荧光显微镜下观察。

1.3.5 Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针体外MRI

       首先行体外试剂显像，用T2序列（TR 3100 ms；TE 21 ms；FOV 95 mm），T2 mapping序列（TR 2090 ms；TE 14.6 ms；FOV 85 mm）对试剂进行检测。用线性回归分析样品浓度与相应弛豫率的关系。

1.3.6 Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针体内MR显像

       10～12周龄雌性SD大鼠颈静脉内建立静脉血栓模型。采用戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，然后将皮肤、筋膜和肌肉依次切开，显露大鼠的颈静脉，用10% FeCl3浸泡滤纸4 min诱导静脉血栓形成，生理盐水冲洗三次后缝合。靶向组大鼠尾静脉注射Fe3O4-PLGA-CREKA（5 mg/kg）纳米探针；非靶向组大鼠尾静脉注射Fe3O4-PLGA（5 mg/kg）纳米探针；生理盐水组大鼠尾静脉注射生理盐水（5 mg/kg）。注射前后30 min分别进行扫描，扫描所得图像导入西门子后处理工作站，测量血栓处T2值。

1.4 统计学分析

       应用SPSS 22.0统计软件，计量资料以x¯±s表示。靶向组打药前后的T2弛豫率比较与非靶向组打药前后的T2弛豫率比较分别采用配对t检验；打药后靶向组与非靶向组T2弛豫率比较采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 靶向纤维蛋白的Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针的理化特性

       TEM显示该纳米探针为均匀球体，分散性可（图1A）；制备的Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针粒径为（255.30±56.00）nm（图1B，表1），表面电位为（-18.90±5.84）mV（图1C，表1），多分散系数为0.054±0.038。接着，流式细胞计数结果显示，78.12%的纳米探针被成功连接上五肽（图2）。以上结果均已说明该纳米探针已被成功制备。

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图1  Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针的理化特性。1A～1B：Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针的透射电镜结果（标尺：1 μm）:1C：Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针的粒径分布图；1D：Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针的表面电位结果。
Fig. 1  Physicochemical properties of Fe3O4-PLGA-CREKA NPs. 1A-1B: TEM image of Fe3O4-PLGA-CREKA NPs; 1C: Size distributions of Fe3O4-PLGA-CREKA NPs; 1D: Zeta potentials of Fe3O4-PLGA-CREKA NPs.

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图2  Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针的流式结果。
Fig. 2  Flow cytometry results of Fe3O4-PLGA-CREKA NPs.

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表1  纳米粒理化特征结果
Tab. 1  Results of physical and chemical characteristics of nanoparticles

2.2 靶向纤维蛋白的Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针体外血栓的靶向性

       倒置荧光显微镜下可见Fe3O4-PLGA/DiI-CREKA 纳米探针在血栓切片的分布明显比Fe3O4-PLGA/DiI纳米探针要多（图3），说明Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针对静脉血栓具有较好的靶向性。

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图3  Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针体外血栓的靶向性结果。
Fig. 3  Fluorescence images of thrombus section with Fe3O4-PLGA-CREKA or Fe3O4-PLGA NPs in vitro.

2.3 靶向纤维蛋白的Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针的生物安全性

       CCK-8结果可以发现在所设置的浓度中细胞活力较好（图4A、4B）；在流式细胞的凋亡结果中，可以发现大部分细胞都位于左下象限，并且实验组和对照组没有明显的统计结果，说明材料有较好的生物安全性（图4C）。H&E切片可以观察到，在注射纳米探针后，心、肝、脾、肺和肾组织中细胞完整性没有受损，没有坏死或炎症反应的表现，与生理盐水组相比未见明显差异（图4D、4E），这表明我们制备的NPs在体内循环3 h和24 h内具有良好的生物相容性。

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图4  Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针体外及体内的生物安全性。4A：不同浓度Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针的CCK-8结果（0~1.25 mg/mL），单因素方差分析结果差异没有统计学意义；4B：1.25 mg/mL的Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针（实验组）和对照组的流式细胞凋亡结果；4C：统计结果可发现两组之间差异无统计学意义；SD大鼠分别注射Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针和生理盐水3 h（4D）和24 h（4E）的主要器官病理切片图。P＞0.05表示差异无统计学意义。
Fig. 4  Biosafety of Fe3O4-PLGA-CREKA nanoprobes in vitro and in vivo. 4A: There is no statistical difference shows in CCK-8 results of Fe3O4-PLGA-CREKA nanoprobes with different concentrations (0-1.25 mg/mL) under one-way ANOVA. 4B-4C: There is no significant difference between the flow cytometry apoptosis results of 1.25 mg/mL Fe3O4-PLGA-CREKA nanoprobe (experimental group) and the control group. In the pathological sections of major organs of SD rats injected with Fe3O4-PLGA-CREKA nanoprobe and normal saline at 3 h (4D) and 24 h (4E) respectively, P＞0.05 indicates no statistically significant difference.

2.4 Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针体外MRI结果

       线性回归结果发现纳米探针浓度与T2弛豫率存在线性关系（R2=0.9923，P＜0.05）（图5）。并且，T2弛豫率随着纳米探针浓度的升高而升高，说明该纳米探针已具备MR显像的能力，为后续的体内显像实验奠定了基础。

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图5  Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针体外MR显像。
Fig. 5  MR and pseudocolor images of Fe3O4-PLGA-CREKA NPs.

2.5 Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针活体MR显像

       可发现注射靶向纳米粒后，血栓区域在T2WI上信号下降，T2弛豫时间升高（图6），利用配对t检验对靶向组与非靶向组打药前后T2弛豫时间进行组间分析比较（表2），具有统计学意义（P＜0.05），再利用独立样本t检验对靶向组与非靶向组打药后的T2弛豫时间进行分析，发现差异具有统计学意义（P＜0.05）。

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图6  Fe3O4-PLGA-CREKA纳米探针活体MR显像。
Fig. 6  T2WI and T2 mapping images acquired at different group.

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表2  打药前后各组T2值
Tab. 2  T2 values of each group before and after injection

3 讨论

       VTE是一种临床常见的疾病，主要指DVT和肺栓塞^[1]。由于VTE病因病情复杂，患者的死亡风险差异极大，VTE的治疗需严格遵守早期治疗、一级治疗和二级预防的分级。其中，有远端深静脉血栓高发风险的患者，需要在确诊后1周和2周进行复查，一旦发现血栓的任何进展，将立即启动抗凝治疗^[17]。本项目修饰CREKA多肽在纳米探针，研究结果提示该方法是可以提高VTE的检测效率的，靶向组比非靶向组探针在血栓区域的蓄积更多，并且有良好的生物安全性，说明本研究有应用于临床的远期价值^[18]。

3.1 结果分析

       近年来，不断发展的MRI、光学成像和放射性核素成像等分子影像技术为血栓的非侵入性检查带来了曙光^[19]。MRI凭借其良好的空间和软组织分辨率，可以很好地展示血栓与周围组织的解剖关系，直观展示血栓的大小，并且因为其对Fe离子高度的敏感性，可以更好地检测Fe3O4浓度的变化，从而达到对血栓纤维蛋白含量的测定，以指导VTE治疗方式的选择^{[20, 21, 22]}。相对于超声检查，MRI的主观性影响较小，因此本研究选择基于MRI的分子探针去提高VTE的诊断效能是可行的^{[23, 24]}。

       前人的研究发现分子量越高的PLGA分子链比较长，它的降解速度缓慢，因此我们选择分子量相对较小的PLGA来制备纳米探针^{[25, 26]}。本研究的纳米探针粒径大小低于300 nm，与之前载药PLGA纳米粒的研究结果相似，说明我们的制备方式是可行的。以钆为MR显像分子，科学家采用固相和固溶混合工艺合成了EP-2104R。该对比剂在37 ℃、1.4 T条件下与纤维蛋白结合的弛豫率为每个EP-2104R分子71.4 mM（-1）s（-1）（17.4/Gd），约为相同条件下Gd-DOTA的25倍^[27]。通过强的纤维蛋白结合效率，纤维蛋白选择性和高分子弛豫性使EP-2104R能够在体内检测血凝块。但是我们也要注意到，基于钆的对比剂有加重患者肾功能损伤的风险，相对于钆这种外来元素，铁元素本就是人体必需的元素之一，因此，基于氧化铁颗粒的对比剂有望解决肾功能不耐受患者的检测问题^[28]。

       血栓形成包括血小板募集和纤维蛋白形成两个过程。因此，前述研究针对血小板激活产生的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（glycoprotein Ⅱb/Ⅲa,GPⅡb/Ⅲa）或者P-选择素以提高诊疗探针在血栓的局部蓄积，如通过cRGD或者EWVDV等多肽对分子探针进行修饰^[17]。虽然动静脉血栓在形成过程有相似之处，但在具体表现还是略有不同：动脉血栓主要由血小板组成，静脉血栓主要由红细胞组成，相同点在于二者都有纤维蛋白的产生，纤维蛋白原裂解引起的聚合反应通过凝血酶的介导，最终促使纤维蛋白形成，其暴露的区域可进一步导致纤维蛋白单元的交联^{[29, 30]}。并且，当血栓自发松脱或被溶栓药物溶解时，纤维蛋白仍然存在于表面。因此，以纤维蛋白为靶点的显像纳米探针有助于对VTE形成及进展的诊断与监测，在图6中，本研究结果也展示出以纤维蛋白为靶点的探针在提高VTE检测的优势，靶向组与非靶向组在注射相应的纳米探针后T2 mapping的信号都有下降，但是前者下降更多。VTE为一种慢性疾病，未来我们可以继续在已有VTE的大鼠中进一步监测，探究血栓的分型或是分期，以更好地辅助临床治疗方案的制订。

3.2 局限性

       本研究也存在一定的局限性：（1）由于VTE种类较多，本研究只在颈静脉进行了验证，同时样本量较小，可能对研究结果产生一定偏倚；（2）mapping图像的采集可能会受到大鼠呼吸运动影响；（3）T2弛豫率测量受多种因素的影响，可能存在一定的测量误差。

       综上所述，本实验成功制备靶向纤维蛋白的增强静脉血栓MR显像纳米探针。它可以特异和有效地靶向血栓中的纤维蛋白。并以此为靶点，通过血栓纤维蛋白含量的半定量测定，借助体内MRI，实现了在体内血栓区域的更多蓄积，具有极大的临床应用潜力，在VTE治疗方案制订中，为血栓分类提供有效地帮助，从而优化治疗方案，改善患者的预后，降低治疗的副作用。