1　超极化磁共振的定义与动态核极化

       磁共振(magnetic resonance，MR)的两大主要应用是磁共振波谱(magnetic resonance spectroscopy，MRS)与磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)，MRS可获得分子动态结构以及分子间、分子内部的相互作用，是一种重要的分析技术；而MRI是临床上重要的非创伤性诊断技术，具有良好的软组织对比度和广泛的诊断应用价值^[1,2]。但是MR固有的低灵敏度限制着磁共振的应用。从根本上讲，MR低敏感性源于室温下原子核自旋极化的低磁能量，这一量级约为0.0001%~0.0005%。MRI能得以临床应用是因为人体脂肪和自由水中氢质子(¹H)含量高，从而能产生较高的时间、空间分辨率。然而其他可用于磁共振观察的同位素原子核由于自然丰度低，即天然存在比低，故其敏感性很低，比如¹³C与¹⁵N，并且这类原子核旋磁比低，如¹³C是¹H质子旋磁比的1/4，这意味着¹³C MR敏感性比¹H低4倍，而¹⁵N MR敏感性则更低，故采集其原子核的磁共振波谱很困难。因此，生物组织体内大量其他分子的生物信号与生物化学信息由于浓度低、信号低而很难探知。

       要解决¹⁵N、¹³C这些原子信号低问题，需要提高所观察分子的自旋极化能级。Overhauser在1953年首次提出动态核极化(dynamic nuclear polarization，DNP)的概念^[3]，即通过转移高度极化的电子自旋到原子核自旋，从而提高热平衡状态下原子核的极化来增加磁共振信号，目前被广泛称为"超极化"(hyperpolarization，HP)。在低温磁场下，将较高极化的电子自旋通过接近其共振频率的微波辐照，部分极化转移至可提供生物信息的自旋原子核上，例如¹³C。Jan Henrik Ardenkjaer-Larsen于2003年发明了溶解性动态核极化(dissolution-DNP，d-DNP)^[4]，使固态超极化探针溶解并可转移至生物体内，得到提高10,000倍以上的磁共振信号(图1)，因此可得到探针相关的生物灌注、代谢产物的运输和代谢反应等生物信息，在生物医学中引起了广泛关注^[4,5,6,7]。借助于传统磁共振设备扫描注射入靶生物体内的超极化生物探针并得到至少提高10,000倍的MR信号，称之为超极化磁共振。MRS、MRI和DNP的联合应用极大提高了MR检测的时间分辨率和空间分辨率，并且与PET、CT等检测方法相比，此联合应用无电离辐射，无毒性代谢物，化学特异性高，能够帮助区分母体复合物和代谢产物。

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图1  HP磁共振生物探针的生产与应用，¹³C标记的丙酮酸在SPINLAB中完成DNP超极化并被充分溶解，然后注射入靶生物体内通过MR扫描仪观察其代谢信息
Fig. 1  The polarization process and applications of HP-MR bio-probes. ¹³C-labelled pyruvate is hyperpolarized in a SPINLAB polarization system and subsequently injected intravenously with the target located in the MR-scanner. The outcome is highly detailed metabolic flux information.

2　超极化生物探针

       HP探针需要选择极化损失慢(长T1)的MR活跃原子核，可迅速完成检测(表1)。与质子相比，¹³C和¹⁵N旋磁比低但T1时间较长，在体内研究中¹³C和¹⁵N的一些分子位点T1可达数分钟^[8]。这类同位素生物体内自然丰度低，所以背景信号低，而且动态核极化使探针SNR增加超过10,000倍，因而易于定量监测^[4]。能用于超极化的候选探针很多，要求具备溶解度高、T1时间长、快速质膜转运、无毒性代谢产物等条件，且与代谢物之间具有明显的化学位移差异。多种HP探针已用于细胞内反应、信号通路动力学、探针摄取和输出、pH、氧化还原状态、活性氧、离子浓度、药物效力和癌基因信号等生物医学研究^[8,9]。

       临床磁共振扫描主要检测体内H2O中的¹H质子。¹H的很多特点使它成为热动力平衡状态下MRI和MRS最理想的原子核：高天然丰度、体内高浓度、大旋磁比γ、短T1。利用¹H-MRS测量细胞代谢，在疾病早期诊断和检测肿瘤对治疗反应方面具有较好的敏感性，但只能提供细胞代谢的静态图^[10,11,12]。HP生物探针能无创实时动态监测生物体内的代谢信息。

       目前，一线的HP生物探针主要是以¹³C为主，包括[1-¹³C]丙酮酸、[2-¹³C]丙酮酸、¹³C-醋酸盐、¹³C-碳酸氢钠和¹³C-延胡索酸盐等(表2)。本文也将主要介绍超极化¹³C在生物医学的应用。丙酮酸在细胞代谢的中心作用使得[1-¹³C]丙酮酸成为最主要的HP生物探针，其T1时间长(>60 s)，有希望广泛用于临床^[13]，它产生3种可用¹³CMR观察的代谢中间产物：乳酸、丙氨酸和CO2，分别由乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和丙酮酸脱氢酶复合物(PDH)介导，CO2可通过碳酸酐酶(CA)转化为HCO3-(图2)。[2-¹³C]丙酮酸可以观察线粒体的代谢。因此，¹³C丙酮酸是HP磁共振技术中重要的生物探针，在脑、心脏、癌症模型、内分泌疾病模型以及细胞培养等领域已取得了广泛的应用，在临床病人的试验中也取得了重要结果。

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图2  丙酮酸代谢途径。丙酮酸分别通过乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)以及丙酮酸脱氢酶(PDH)催化为乳酸、丙氨酸以及乙酰CoA和CO2，乙酰CoA进入线粒体三羧酸(TCA)循环，CO2在碳酸酐酶(CA)作用下转换为碳酸氢盐。丙酮酸分子的碳原子色码可以追踪相应的代谢产物。例如当丙酮酸的第一个碳原子(蓝色)被¹³C替换并被超极化后，磁共振波谱可以定量测得[1-¹³C]丙酮酸代谢为乳酸、丙氨酸或碳酸氢盐的代谢通量
Fig. 2  Pyruvate is transformed into lactate, alanine or acetyl-CoA and CO2. These processes are catalyzed by lactate dehydrogenase(LDH), alanine transaminase(ALT) and pyruvate dehydrogenase(PDH), respectively. Acetyl-CoA is transported into mitochondria to join in tricarboxylic acid(TCA) cycle. CO2 is interconverted with bicarbonate catalyzed by carbonic anhydrase(CA). The atom color codes circles in the pyruvate molecule allow tracing the flux into the corresponding metabolites. For example if carbon atom number one (blue) in pyruvate is exchanged with ¹³C and hyperpolarized then magnetic resonance spectroscopy allows quantification of the flux of [1-¹³C] pyruvate into the lactate, alanine or bicarbonate metabolites.

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表1  生物医学中应用的MR活跃核
Tab. 1  MR active nuclei in biomedical applications

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表2  ¹³C标记的超极化生物探针
Tab. 2  Hyperpolarized ¹³C-labelled bio-probes

3　超极化磁共振波谱

       以HP[1-¹³C]丙酮酸为例分析HP生物探针在体内的代谢信息(图3)，在采集到的¹³C磁共振波谱不同化学位移代表不同的代谢产物，波峰下覆盖面积的增減可用来检测代谢的变化^[14]。[1-¹³C]乳酸为糖酵解的终产物，糖无氧酵解过程加强时，乳酸含量增高，代表乳酸的MRS峰值会升高。[1-¹³C]碳酸氢盐是有氧代谢的产物，有氧代谢减弱时其含量降低，代表碳酸氢盐的MRS峰值会降低。

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图3  超极化¹³C丙酮酸和其代谢产物的MR波谱。波峰从左至右依次为乳酸(化学位移为183.2 ppm)、丙酮酸水合物(179.0 ppm)、丙氨酸(178.5 ppm)、丙酮酸(170.6 ppm)以及碳酸氢盐(160.9 ppm)。图片引用于文献Magn Reson Med. 2015 Aug;74(2):558-563，并获得许可
Fig. 3  The MR spectra of HP-13C pyruvate and its metabolites. The spectra peaks are lactate(183.2 ppm), hydrate-pyruvate(179.0 ppm), alanine(178.5 ppm), pyruvate(170.6 ppm) and bicarbonate(160.9 ppm), respectively. Adapted from Magn Reson Med. 2015 Aug; 74(2): 558-563, with permission from John Wiley and Sons.

4　超极化磁共振设备

       随着超极化磁共振的广泛应用，商业化的d-DNP极化器也应运而生。目前使用最广泛的两种极化器是针对体外实验以及小动物实验的HyperSense DNP极化器(Oxford instruments，UK)和由GE公司生产的安装无菌设备拟为临床使用的DNP偏振器，并将其命名为SPINLAB动态核极化器^[4,15]。SPINLAB可以同时产生4个大剂量样品，并安装质量控制装备以确保临床的使用流程与生物兼容性，最近SPINLAB在加利福尼亚大学初次用于人体实验并取得了成功^[13]。目前，包括加利福尼亚大学在内，剑桥大学、多伦多Sunnybrook健康科学中心、纪念斯隆-凯特琳癌症中心、美国国立卫生研究院、瑞士联邦理工学院、牛津大学、奥胡斯大学等几个国际站点已经安装了SPINLAB设备。在丹麦奥胡斯大学MR中心，主要应用超极化磁共振技术在肿瘤细胞、糖尿病肾病、脑卒中和动脉粥样硬化性心肌病等疾病模型中，并使用不同生物探针研究其代谢机制。

5　超极化磁共振波谱在生物医学中的初步应用

5.1　HP 13C在肿瘤细胞培养、肿瘤动物模型以及与生物反应器的联合应用

       乳酸含量增加可被用来帮助区分肿瘤组织和正常组织^[16,17]。在小鼠前列腺癌HP研究中发现，乳酸信号高低与肿瘤组织学分级具有强相关性，丙酮酸-乳酸交换通量可被用于肿瘤分级^[18]。对于评估肿瘤的治疗反应，HP[1-¹³C]丙酮酸MRS在前列腺癌和颅脑肿瘤治疗后早期即可检测到丙酮酸-乳酸转化降低^[19,20]，但采用FDG-PET-¹⁸F摄取率成像方法检测时，原发前列腺癌组织的摄取率低和背景摄取率高^[21]，癌细胞代谢反应观察较困难，因此，HP丙酮酸有可能提供早期评估肿瘤治疗效果的方法。HP丙酮酸也被证明是监测恶性胶质瘤和乳腺癌小鼠模型中PI3K抑制剂LY294002的一种有价值的工具，PI3K通路抑制导致LDH活性降低从而减少HP丙酮酸转换乳酸的信号^[22]。

       体外HP[1-¹³C]丙酮酸的代谢研究需要有能与磁共振相连接的组织培养系统，来确保实验的再现性和稳定性，此系统称之为"生物反应器"，它需要一个快速注射系统，具有调节流速重要参数的能力，并能维持磁场均匀性。Keshari KR等使用HP ¹³C丙酮酸联合生物反应器研究肾癌细胞，发现可实时观察代谢通路，并能控制氧化作用、流量、pH和底物等引起的微环境变化，这项研究揭示了MCT4转运在疾病发生和疾病进展的重要性，而且MCT4介导调节乳酸转运可用HP ¹³C MRS来检测^[23]。在使用生物反应器培养人体组织切片代谢研究中，也证明了生物反应器平台能在磁共振测量仪中保持组织活性，并观察HP探针的代谢^[24]。

       HP ¹³C延胡索酸盐已在体外癌细胞和体内的肿瘤移植物经化疗后被证明能水合成苹果酸，且苹果酸的产生水平和坏死水平相关，延胡索酸盐活细胞摄取率低，但在细胞膜通透性屏障破坏的地方，可快速被细胞摄取并水合形成苹果酸，是观察坏死的理想标志物，肿瘤间隙中同时存在被释放的延胡索酸酶，因此，HP ¹³C延胡索酸被认为是肿瘤细胞坏死的早期标志物^[25,26,27]。酸性环境介导肿瘤细胞迁移和侵入并影响抗肿瘤药物的摄取，但尚无实用的方法对体内pH进行分布成像。HP H ¹³CO3-和¹³CO2可用来计算肿瘤动物模型细胞外pH的空间分布^[28]，因此，H¹³CO3-可提供一种非侵入性探测人体细胞外pH成像的方法，成为一种用来检测疾病存在和对治疗反应的通用方法。很多肿瘤存在支链氨基酸上调，在小鼠淋巴瘤细胞模型中注射HP[1-¹³C]酮异己酸盐在支链氨基酸转移酶催化下产生[1-¹³C]亮氨酸^[29]，因此，使用HP¹³C酮异己酸盐可以探测支链氨基酸转移酶的活性以及细胞内谷氨酸的浓度。另外，谷氨酰胺代谢的升高被假定为肿瘤生长和细胞增殖的标志，谷氨酰胺代谢的改变可能被用于识别肝硬化内肝细胞癌或者在不能重复活检时帮助区分恶性和良性肿瘤。在体外肝癌细胞中已经证实[5-¹³C]谷氨酰胺在谷氨酰胺酶催化下实时转换为[5-¹³C]谷氨酸^[30]。

5.2　HP 13C在糖尿病的评估

       糖尿病肾病是糖尿病晚期并发症之一，也是引起晚期肾脏衰竭的主要原因之一。但其发病机制尚未完全探知，氧代谢紊乱引起的肾内组织低氧被认为是重要原因^[31]。Laustsen C等使用HP[1-¹³C]丙酮酸MRI观察1型糖尿病早期的肾脏代谢改变^[32]，发现[1-¹³C]乳酸/[1-¹³C]丙酮酸比值在糖尿病肾脏中明显升高，而[1-¹³C]碳酸氢盐/[1-¹³C]丙酮酸比值未改变，肾脏耗氧增高，有效耗氧率降低。在不同氧浓度条件下，急性低氧时糖尿病肾脏[1-¹³C]丙酮酸向乳酸、丙氨酸转化代谢增加，但未改变碳酸氢盐通量；而在高氧浓度时乳酸水平正常^[33]。这也许可以解释为何居住在高海拔地区的糖尿病患者中肾病患者更多^[34]。不规范的胰岛素治疗会增加肾脏负担，肾脏会增加[1-¹³C]丙酮酸的摄取，并同时增加无氧与有氧代谢的代谢通量(乳酸、丙氨酸、碳酸氢盐信号上升)，导致能量物质的消耗增加^[35]。这提示对于胰岛素依赖的糖尿病严格的血糖控制非常重要，血糖控制不佳时肾脏代谢紊乱依赖于能量基质的消耗，这或许预示针对糖尿病肾病的新治疗靶点。

       对于胰岛素抵抗的2型糖尿病，过度的肝脏糖异生与糖原分解会引起血糖上升，HP[1-¹³C]丙酮酸波谱可以无创动态实时地测量体内肝脏的代谢改变^[36]。糖尿病小鼠肝脏表现出更高信号的13C草酰乙酸、天冬氨酸与苹果酸，与正常小鼠注射胰高血糖素糖异生代谢增加类似。二甲双胍治疗两周后肝糖异生降低，¹³C标记的天冬氨酸与苹果酸量下降，丙酮酸与天冬氨酸、苹果酸的转换率也下降，血糖水平下降，这与糖异生下调是一致的。[1-¹³C]丙酮酸可作为诊断糖尿病肝功能紊乱的生物标记物，帮助评定治疗糖尿病药物对肝脏代谢的影响，也可以更好理解糖尿病药物的作用机制。HP¹³C代谢成像技术在糖尿病疾病模型中成功的运用，对临床糖尿病本身以及并发症的机制、治疗以及管理有着积极的作用。

5.3　HP 13C评估心脏和脑部疾病

       心肌氧化能量高达40%来源于血液中的葡萄糖和乳酸，通过其产生的丙酮酸进入三羧酸循环。已有研究显示HP[1-¹³C]丙酮酸可以评估体内外心脏丙酮酸脱氢酶(PDH)含量和通量^[37,38]，以提供心肌活性的重要信息。目前超极化MRS多应用于评估心肌梗塞、心脏衰竭、心肌肥大及心脏肿瘤等疾病的代谢变化^[39]。

       Dodd等应用HP[1-¹³C]和[2-¹³C]丙酮酸评估大鼠心肌梗塞后的线粒体代谢变化^[38]。心梗后第6周通过PDH产生的乙酰辅酶A含量正常，但其氧化减少(三羧酸循环减慢)；心梗后第22周发现PDH含量与心脏射血分数显著相关，乙酰辅酶A的产生及其氧化均减少。这预示着超极化MRS在评估心脏代谢方面具有重要的研究价值。

       HP ¹³C在脑卒中、脑肿瘤、神经退行性疾病及创伤性脑损伤等疾病中的应用前景广阔^[5]。Park等用HP ¹³C丙酮酸评估大鼠脑胶质瘤模型的预后^[17]。其¹³C-丙酮酸及其代谢产物¹³C-乳酸的信噪比均明显高于正常脑组织，正常脑组织的血脑屏障(blood brain barrier，BBB)能够限制丙酮酸进入脑细胞，而胶质瘤的BBB被破坏导致¹³C丙酮酸顺利进入脑组织。BBB阻碍丙酮酸转运限制了超极化MRS在脑部的研究，使其落后于在肿瘤学和心脏病学方面的研究。但Hurd等发现注射[1-¹³C]丙酮酸乙酯(亲脂性丙酮酸衍生物)能够比丙酮酸更快地跨越BBB且具有更高的极化比，脑组织内碳总量也显著增高^[40]，这为超极化MRS在脑部研究开辟了新的方向。

5.4　HP 13C的首例人体应用

       使用SPINLAB制备应用于人体的无菌HP探针需要过滤出二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)，完成温度、pH值、探针浓度等质量监控。首例[1-¹³C]丙酮酸MRI和MRS的临床试验在前列腺癌病人中得到成功应用^[13]。临床前期的研究表明，在前列腺癌动物模型中观察到癌灶[1-¹³C]乳酸升高，且随着癌症分期的增高，癌症部位的[1-¹³C]乳酸/[1-¹³C]丙酮酸的比值随之增高；而在得到有效治疗后这一比值会降低^[18,41,42]。这项临床试验研究首先证明：HP[1-¹³C]丙酮酸可以安全有效的运用于人体中，其次观测到病灶出现明显的[1-¹³C]乳酸峰，[1-¹³C]乳酸/[1-¹³C]丙酮酸的比值上升；而健康的前列腺组织和周围的血管组织未出现或出现很低的[1-¹³C]乳酸峰。这一结果与临床前期的实验研究结果相吻合^[18]。另一值得注意的是，对于一位活检证实为前列腺双侧癌灶病人，分期检查中常规T2WI、表观扩散系数成像以及¹H-MRS成像均只显示了腺体右侧的病变，而[1-¹³C]丙酮酸成像监测到腺体左右两侧均出现较高[1-¹³C]乳酸/[1-¹³C]丙酮酸信号比值的区域，后在MR引导下再活检证实为双侧癌灶。这预示着[1-¹³C]丙酮酸代谢成像技术对无创性肿瘤诊断具有重要价值。另外，HP[1-¹³C]丙酮酸成像技术可以探测到双边癌症这一惊奇发现，可能会成为癌症缓慢生长类病人的一种特别重要的监控手段。

6　小结

       超极化磁共振波谱能很好地探测¹³C且具有极高的灵敏性，HP¹³C生物探针能实时动态无创性地快速追踪生物体内的代谢过程，得到关键酶的代谢信息，且无电离辐射的危险，可用于检测临床疾病模型的代谢改变与治疗效果分析。前列腺癌病人的临床试验更是预示着[1-¹³C]丙酮酸应用于临床疾病诊断以及更进一步监测治疗效果的可能性。