多发性硬化（multiple sclerosis，MS）和视神经脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）是中枢神经系统常见的脱髓鞘疾病，东方人的MS以视神经和脊髓多受累^[1]，而NMO也是主要以视神经和脊髓病变为主，二者的诊断、鉴别诊断存在一定困难，而后期治疗有所不同。NMO曾经被认为是MS的一个亚型，自从NMO特异性自身抗体及靶抗原水通道蛋白4(aquaporin-4，AQP4)的发现，人们才逐渐认识到NMO是有别于MS的自身抗体介导的免疫性疾病^[2]。NMO疾病谱不仅仅包括符合NMO诊断标准的NMO，而且还包括伴随有长节段病灶的脊髓炎(longitude extensive transverse myelitis，LETM)，复发性视神经炎（recurrent optic neuritis，RON），视神经脊髓型MS(optical-spinal MS，OSMS)，伴有干燥综合症或系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematoses，SLE）等自身免疫性疾病的脊髓炎或视神经炎，后者这些常被称为高危NMO(high-risk NMO，HR-NMO)，即NMO的限定形式^[3]。

       本文旨在研究AQP4抗体在诊断、鉴别诊断及预后评估NMO，HR-NMO及经典MS中的临床应用价值。

1　资料与方法

       收集我院神经内科210例患者的血清及临床资料，2008年11月至2010年12月2年期间所有来门诊或者电话进行随访的患者。经伦理委员会批准审核，入选患者按照以下的诊断标准：53例NMO患者在不考虑NMO-IgG阳性的条件下按照2006年的NMO诊断标准^[3]。42例HR-NMO患者诊断按照以下标准中的任何一条：①OSMS；②没有脑部病灶的复发性视神经炎（RON） ；③不论有无脑部病灶的脊髓病灶超过3个节段的脊髓炎；④伴随有其他自身免疫性疾病的视神经炎（ON）或脊髓炎（TM）^[4]。86例经典的MS患者在排除了NMO和HR-NMO的前提下，均符合2005年的MS诊断标准^[5]。29例神经科其他疾病对照组包括：脑梗死9例，格林-巴利综合征5例，重症肌无力4例，病毒性脑炎2例，颈椎病3例，肌萎缩侧索硬化2例以及偏头痛4例，所有患者均按照各自的诊断标准诊断（表1）。

       临床病例资料包括性别，起病年龄，是否伴随有ON或TM，脑和脊髓MRI及扩展的残疾状态评分(expanded disability status score，EDSS)评分^[6]。每组患者的临床、MRI及血清学特点的比较如表2所示。所有患者至少做了一次以上的脑和脊髓MRI。所有患者血清AQP4抗体的检测均采用人AQP4转染细胞的间接免疫荧光法^{[2, 7]}。我们检测的最小滴度以64×作为阳性与阴性的界值。NMO，HR-NMO，MS及对照组患者的AQP4抗体滴度。

       所有统计学分析均采用SPSS11.0统计软件。采用χ²或Fisher精确检验分析计数资料，组间比较采用方差分析，同时采用Kaplan-Meier分析评估血清学阳性与阴性患者在第一次发作后随访的复发情况。P<0.05认为有统计学差异。

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表1  NMO，HR-NMO及MS患者的临床及血AQP4抗体特点比较
Table 1  The clinical features and serological AQP4 antibody in patients of NMO, HR-NMO and MS

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表2  AQP4抗体阳性与阴性患者的临床、MRI及随访后复发特点的比较
Table 2  The clinical and MRI features and relapsing status in patients with AQP4 antibody: positive and negative

2　结果

2.1　患者AQP4抗体的灵敏度、特异性及滴度分析

       在我们的研究中，阳性标本滴度的确定按照1:1000作为阳性最大值，阳性滴度的最小值64×作为界值（图1）。按照界定的标准(1:64)，53例NMO患者中有39(73.6%)例为阳性。NMO与HR-NMO患者抗体检出的灵敏度为71%，特异性为91%。此外，42例HR-NMO患者中有12(28.6%)为阳性，而86例经典MS患者中有4(4.7%)例阳性。其他疾病对照组中没有发现AQP4抗体阳性（图2）。AQP4抗体在NMO, HR-NMO和MS组中有明显的统计学差异(P<0.05)（图1）。

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图1  NMO，HR-NMO，MS及其他疾病组的AQP4抗体滴度分布图。NMO，HR-NMO组与MS组患者的AQP4抗体滴度有明显的统计学差异(P<0.05)。疾病类型：视神经脊髓炎（NMO），高危视神经脊髓炎（HR-NMO），多发性硬化(MS)，以及其他神经科疾病（Others）。采用间接免疫荧光法检测所有患者的血清标本，以滴度为64×为阳性与阴性的分界线
Fig 1  AQP4 antibody titres in patients with NMO, HR-NMO and other control diseases. There were significant differences among NMO, HR-NMO and MS with respect to AQP4 antibody (P<0.05). Diseases categories: NMO, neuromyelitis optica; HR-NMO, high risk NMO; MS, multiple sclerosis and other neurological diseases. All serum samples were detected anti-AQP4 antibody by indirected immunofluorescence. Serum samples below the level 64× of cut-off were negative.

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图2  每组anti-AQP4抗体分布疾病类型：视神经脊髓炎(NMO)53例，高危视神经脊髓炎（HR-NMO）42例，多发性硬化（MS）86例，其他神经系统疾病29例
Fig 2  The distrubion of anti-AQP4 antibody in each group. Diseases categories: NMO (n=53), neuromyelitis optica; HR-NMO (n=42), high risk NMO; MS (n=86), multiple sclerosis and other neurological diseases (n=29).

2.2　NMO，HR－NMO及经典MS患者的临床特点比较

       所有患者临床资料包括：性别、起病年龄，伴有严重的ON（最大20/100到20/200），TM，颅脑及脊髓MRI，以及AQP4抗体。我们设定将NMO和HR-NMO组合并为一组，与经典MS组患者在性别、起病年龄，伴随有严重的ON，TM，颅脑MRI正常，脊髓病灶超过3个节段，以及AQP4抗体等方面进行比较分析。结果发现，两组间在以上几个方面均有明显的统计学差异(P<0.05)(表1)。

       42例HR-NMO患者中有12例(28.6%)患者伴随有严重ON，28例（66.7%）伴随TM，23例（54.8%）患者颅脑MRI正常，33例（78.6%）脊髓病灶超过3个节段（见图3），以及12例（28.6%）AQP4抗体阳性（表1）。

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图3  女性，40岁，以急性脊髓炎入院，主要表现有小便潴留，双下肢麻木、无力并很快发展为双下肢完全瘫痪，深浅感觉消失。2年随访后患者先后出现左下肢无力、双下肢无力的脊髓炎(TM)复发。图中颈髓矢状面和轴面T2WI显示超过3个椎体节段的长病灶（箭），以脊髓中央受累为主
Fig 3  Female patient, 40 years old, was addmitted to hospital due to acute myelitis. Her main manifestation were urine retention, numbness and weakness of both lower limbs, and then progressed to paralysis, and disappearence of deep and superficial sensation afterwards. After 2 years follow-up, the patient successively presented with weakness of left lower limb and both lower limbs, which were reccurrence of transverse myelitis. Cervical sagittal and axial T2WI showed the longitude extensive lesion with more than 3 vertical segments that maily involved center of spinal cord.

2.3　AQP4抗体阳性与阴性患者的临床、MRI特点及生存分析比较

       所有患者血清样本均进行检测，AQP4抗体阳性(n=55)与阴性(n=126)的两组患者进行比较，包括性别、起病年龄，伴随有严重的ON，TM，颅脑及脊髓MRI，临床EDSS评分，以及2年随访期间ON或TM的复发等方面（表2）。在血清阳性的55例患者中，有36例（66.7%）伴有严重的ON，41例（75.9%）伴有TM，30例(55.6%)脊髓病灶超过3个节段，8例（14.8%）在2年随访中发展为ON的复发，19例(35.2%)TM的复发。而在126例阴性患者中有31例(24.4%)伴有严重的ON，46例（36.2%）伴有TM，37例（29.1%）脊髓病灶超过3个节段，仅有2例(1.6%)在2年随访中发展为ON的复发，5例(3.9%)TM的复发。在血清阳性与阴性患者中，伴有严重的ON，TM，脊髓病灶超过3个节段，及ON与TM的复发这几个方面两组间均有明显的统计学差异(P<0.05)(表2)。

       随访期限的界定既是复发又是终点时间，从12.5到35.1个月（平均24个月）。血清阳性组的完全随访平均值为24.5±5.8个月，而阴性组为23.8±8.0个月。两组的生存分析如图4所示。Kaplan-Meier生存分析表示出了2年内血清阳性患者的累积复发率与阴性组的比较。两年随访中，55例血清阳性患者有27例有复发（ON或者TM），而126例阴性患者仅有7例有复发，两组间有明显的统计学差异(P<0.05)。

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图4  AQP4抗体阳性与阴性患者生存曲线分析上面曲线代表了AQP4抗体阴性患者，而下面曲线代表了阳性患者的生存曲线。两年随访中，55例抗体阳性的患者中27例有视神经炎或者脊髓炎（ON或TM）的复发，而126例抗体阴性患者中仅有7例有复发(P<0.01，Fisher精确检验)
Fig 4  Survival curve showed the cumulative event rate at 2 years in anti-AQP4 antibody seropositive compared with seronegative patients. The upper curve presented AQP4 antibody negative patients, whereas the lower curve presented AQP4 antibody positive cases. In 2 years, 27 of 55 seropositive patients were followed up by experienced relapses (ON or TM), whereas 7 of 126 seronegative cases experienced relapses (P<0.01, Fisher exact test).

3　讨论

       我们在较大样本的国人NMO和MS中，独立验证了NMO特异性自身抗体的存在。这种AQP4自身抗体（NMO-IgG）的检测有较高的灵敏度和特异性，分别为71％和91%，同之前国外报道的（58到73％的灵敏度以及大于90％的特异性）相一致。在许多研究中，AQP4抗体（NMO-IgG）的高灵敏度和特异性有助于NMO的诊断，目前这种自身抗体也已成为NMO新的诊断标准中的一项^[3]。同时AQP4抗体成为一项实验室指标适用于NMO和其他中枢神经系统(CNS)免疫性疾病的鉴别。我们的研究结果表明AQP4抗体在NMO，HR-NMO及经典的MS患者中有明显的统计学差异，并且也大力支持了NMO-IgG的检测写入新的NMO诊断标准中的必要性。尽管AQP4抗体已作为NMO诊断标准中的一项支持条件，但这个诊断标准仍是建立在临床及MRI诊断的基础之上，而AQP4抗体作为一项支持诊断条件可大大提高诊断NMO/HR-NMO的特异性，可见AQP4抗体能够在一定程度上鉴别NMO及其他CNS疾病。尤为重要的是，在长节段脊髓病灶的患者（如LETM）或其他HR-NMO中，不满足MRI诊断MS的标准，AQP4抗体却是惟一具有高特异性的能够鉴别NMO与MS的指标。

       据我们所知，我们目前研究采用的方法是国内最敏感的AQP4抗体检测方法。由于东西方诊断的争论，在临床工作中我们往往很难将OSMS, RON及LETM这些患者分类。在日本，这样的患者诊断为MS，但在北美和欧洲这类患者诊断为NMO^[8]。与AQP4抗体(NMO-IgG)阳性相关的某些临床表型，在不满足NMO的诊断标准时，包括双侧或复发性ON，复发性LETM，以及AQP4抗体阳性并伴有其他自身免疫性疾病（也就是我们研究中指的HR-NMO），AQP4抗体有助于这些疾病的分类，从而有利于进一步的治疗和预后评估^[8,9,10]。

       一项回顾性的研究表明核糖核蛋白SSA抗体(anti-Ro)阳性，常常表现为没有任何症状的结缔组织病，也可能是TM复发的危险因素^[11]。在没有临床体征时，自身抗体的血清学标记物可以反映自身免疫病的发病过程，但并不是疾病的特异性标志。然而，血清AQP4抗体却被认为是NMO的特异性标记物。同时，这种自身抗体在复发性LETM(52%)和复发性ON(25%)中均能检测到^{[2, 12]}。以上两类疾病可归类于NMO的限定形式（即HR-NMO）。在研究中，78.6％的HR-NMO患者伴有脊髓病灶超过3个节段，66.7％伴有TM，28.6％伴有严重的ON，28.6%AQP4抗体阳性，以及9.4％的NMO，7.1％的HR-NMO伴有其他自身抗体。

       在一些疾病中，人们过去常认为TM是原发病的一种并发症，而不是独立的疾病实体。但当今认为长节段病灶的TM往往与AQP4抗体有关，并有可能意味着NMO谱系疾病与原发病是共存的^{[13, 14]}。在研究中，55.6％血清阳性患者的脊髓病灶在MRI上超过3个节段，并且较阴性患者更易发展为ON和TM。这表明LETM确实代表了NMO的一种限定形式，与Weinshenker等^[10]学者报道的相一致。这也提示我们在临床工作中遇到MRI表现为脊髓病灶超过3个椎体节段的LETM，可常规性地检测AQP4抗体，从而早期做出诊断及相应的治疗。

       之前也有研究表明AQP4抗体可能是ON及TM患者第一次发作后发展为NMO的危险因素的早期标记物。由于LETM或其他HR-NMO的病变可能在起病后不久进展，所以病变的发展只是个时间问题。本研究中的HR-NMO，包括复发性ON，LETM，OSMS以及伴有自身免疫性疾病的TM或ON中，28.6％的患者AQP4抗体阳性，78.6％脊髓病灶超过3个节段。我们推断AQP4抗体阳性可能对HR-NMO患者有一定的预测价值。

       本组病例在随访的2年中，4例AQP4抗体阳性的MS患者无1例复发，并且AQP4抗体滴度低于NMO患者，其中2例有持续的小脑、脑干症状。这可能推测到来自不同地域的患者（我国北方或南方的NMO或HR-NMO）的这种差异在临床表型上有某些不同的特点，或者AQP4抗体的检查方法的灵敏度和特异性有所不同^[15]。这也有待于我们如何理解较多的NMO和HR-NMO患者血清AQP4抗体是阴性的。

       Takahashi等^[7]学者认为AQP4抗体滴度与脊髓病灶长度有较强的正相关，在其他的日本研究中，多元回归分析发现AQP4抗体仅与高的复发率有正相关关系^[16]。在我们的研究中，按照生存分析血清阳性患者更易复发。此外，Nakashima坚持认为AQP4抗体阳性患者与阴性患者相比，往往多表现为严重的视神经受损及TM^{[16, 17]}。同样，我们也发现AQP4抗体阳性患者有较高的严重ON和TM的发生率，更易伴有脊髓长节段病灶，并且更容易有ON或TM的复发。因此，血清阳性患者往往视力较差，并且易出现ON和TM的复发，这也与其他学者报道的相一致^[9]。

       目前AQP4抗体的检测已越来越广泛地应用于临床，并且我们应该提倡将其作为复发性或严重ON，LETM及临床上伴有自身免疫病的ON或TM的常规检查。虽然NMO及AQP4相关疾病的最佳治疗及预防复发的临床试验还尚未完成，但仍有某些病例报道支持长期免疫抑制剂的治疗。

       AQP4抗体的发现无疑在脱髓鞘疾病领域研究中开辟了新的视野。本研究首次在较大样本的国人NMO，HR-NMO以及MS中报道了AQP4抗体的价值，并证实了AQP4抗体不仅是鉴别NMO和其他CNS免疫性疾病的特异性标记物，而且具有一定的预测预后的价值。AQP4抗体(NMO-IgG)血清阳性患者有发展为ON或TM及严重复发致残的危险性，因而，我们提倡检测血清AQP4抗体，并且对于AQP4抗体阳性患者侧重于免疫抑制剂的治疗^{[18,19,20,21]}。