地中海贫血是世界上最常见的单基因遗传性疾病，在中国南方高发，其中广西壮族地区最高，发病率约17.97%^[1]。患者由于肠道过多的铁吸收及接受长期反复输血治疗，不可避免的遭受铁沉积在肝脏、脾脏、心脏和内分泌器官，造成损伤。肝脏是过量的铁最主要沉积部位（70%～90%）^[2]，因此肝铁浓度（liver iron concentration, LIC）是反映体内铁含量最重要指标^[3]。去铁治疗可以显著改善患者的生存期和生存质量，测量肝脏铁含量对临床诊断、制定与修改治疗方案和评价去铁药物疗效等都非常重要。

       目前国内测量LIC常规使用肝脏穿刺，再用化学方法测定活检物铁含量。这种有创的方法虽能直接评估铁负荷，但每次只穿刺肝脏一个点（样本量必须>0.5 mg干重），存在变异误差，且不能频繁进行，患者难以常规检查。自从发现组织铁浓度与MR弛豫时间(T1、T2及T2^*)两者有相关关系以来，大量动物及临床研究已证实使用MRI检查方法可以准确及无创定量肝铁水平并已应用于临床，但这些研究主要都是应用1.5 T MRI^{[4,5,6,7,8,9]}。目前，3.0 T MRI数量增长迅速，尤其在我国有的医疗机构甚至只有3.0 T。由于弛豫时间具有场强依存性，1.5 T MRI获得的肝铁浓度与弛豫时间的标准曲线并不适用于3.0 T。目前只有少数1.5 T和3.0 T MRI肝脏铁定量的临床对比研究^[9,10,11]，尚需进行动物实验探讨3.0 T场强下弛豫时间与实际肝脏铁含量之间的关系作为基础。利用沙鼠建立的铁超负荷模型可以模拟人体的铁沉积过程^[12,13,14]，但是沙鼠的肝脏体积太小，难以使用临床用MRI进行扫描及测量。

       因此，本研究的目的是利用家兔建立肝铁超负荷模型探讨3.0 T场强下肝脏T2弛豫时间、肝脏／肌肉信号强度比值（signal intensity ratios, SIR）与LIC的关系，进而证明3.0 T MRI定量肝铁沉积的可行性。

1　材料与方法

1.1　动物模型

       广西医科大学动物实验中心提供的新西兰雄性家兔44只，3~5月龄，体重2.0~2.9 kg。随机分为3组，实验组30只，对照组2只，验证组12只。普通饲料喂养。实验组及验证组每周一注射1次右旋糖酐铁（含铁量150 000 mg/L，广西化工研究院兽药厂），剂量为15 mg/kg，两侧后大腿轮流肌注。实验组于1~15周周日随机选取2只行肝脏MRI检查；验证组分别在1 ～5、8、9及11~15周周日随机选取1只检查；对照组不注射铁剂，与实验组相同时间点检查。实验组2只与验证组1只家兔检查结束后即处死（第15周连同对照组一并处死），取出肝脏行病理、铁含量等检查。本研究通过广西医科大学动物福利伦理委员会批准。

1.2　LIC测定及病理学检查

       家兔处死后，取完整肝脏并在各肝叶随机取6块肝组织放入固定液固定12 h后，蜡埋、切片，行普鲁士蓝染色及HE染色。取完病理的肝脏每叶切成2块，去掉大的血管及胆管后，用双蒸水反复冲洗8~10次，于60℃烤箱烘干至肝脏组织重量不再改变。烘干后肝脏组织送广西分析测试研究中心经原子吸收分光光度计测定LIC。

1.3　MRI检查及数据采集

       使用荷兰产Philips Achieva 3.0 T MR扫描仪，膝关节软线圈及呼吸门控采集。T2值测量采用8回波SE序列：TR 2000.0 ms，TE 8.0~64.0 ms （间隔8 ms），偏转角度90° ，FOV 120 mm×100 mm，层厚4 mm，层距2 mm，扫描肝脏最大同层截面，最后生成T2-Map图。肝脏／肌肉SIR测量采用GRE序列：TR 48.0 ms，TE 2.5 ms，偏转角度60° ，FOV 120 mm×100 mm，层厚4 mm，层距2 mm，扫描4层肝脏。选用Philips MR自带软件测量。扫描后在肝脏T2-Map图像上，避开肉眼可见的血管、胆管分别画5个相同面积（约1 cm×1 cm）的ROI，以避免由于铁分布不均造成的影响，软件测得值即T2值。求5个ROI的T2平均值，即为肝脏平均T2值。R2值（R2弛豫率）为T2值的倒数（R2=1/T2）。在GRE扫描所得4层图像中选取肝脏最大截面一层，同样避开肉眼可见血管、胆管，画5个ROI，分别测信号强度(signal intensity, SI)后求其平均值，即为肝脏平均SI；在右侧竖脊肌避开脂肪组织，画1个ROI测值即为肌肉SI。SIR（肝脏／肌肉）=SI（肝脏平均）/SI（肌肉）。

1.4　统计方法

       使用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。用简单随机分组设计分组。实验组、验证组肝脏T2值、R2值及SIR（肝脏／肌肉）经正态性检验不符合正态分布。用完全随机设计两样本秩和检验比较实验组与对照组肝脏T2值、SIR（肝脏／肌肉）之间差异。用Spearman相关分析探讨肝脏R2值、SIR（肝脏/肌肉）和LIC之间的关系，并用直线回归分别获得其拟合直线的斜率、截距，得到通过R2值或SIR预测LIC的公式。计算验证组实际LIC与通过预测公式得到的LIC的组内相关系数（ICC）。用Bland-Altman图分析两种方法所得验证组的LIC之间是否一致性。P<0.05认为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　病理

       对照组家兔肝脏切片普鲁士蓝染色未见铁颗粒。注射右旋糖酐铁1周后，实验组家兔肝脏切片仅见少数肝小叶内有少量铁颗粒，大部分肝小叶未见铁染色（图1, 图2）。随着右旋糖酐铁注射次数增加，肝脏铁含量逐渐增高。3周后，不仅肝窦内有铁沉积，肝细胞内亦可看到铁沉积（图3, 图4）。10周后，肝窦、肝细胞的细胞质内都充满了含铁血黄素颗粒（图5, 图6）。

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图1~6  图1、3、5分别为第1、4、15周家兔肝脏镜下病理（普鲁士兰染色×40），图2、4、6为相应的肝脏MR图像。随着铁剂注射剂量增加，肝脏沉积铁颗粒（蓝色）逐渐增多，MR图像上肝脏信号减低
Fig. 1-6  An example Liver MR image (Fig. 2, 4, 6) and corresponding Prussian blue staining (Prussian blue ×40) of liver at the first (Fig. 1), forth (Fig. 3), and fifteenth (Fig. 5) week of iron dextran loading. As dextran iron injection increased over time, the liver iron deposits (blue) increased accordingly, and caused a decrease of signal intensity on liver MR image.

2.2　两组肝脏MRI测量和LIC测定结果

       对照组肝脏T2均值为（55.4±6.2） ms，SIR（肝脏／肌肉）均值为1.3±0.1。实验组肝脏T2值、SIR(肝脏／肌肉)及LIC的中位数、范围如表1。实验组与对照组肝脏T2值、SIR(肝脏／肌肉)相比，两者之间差异有统计学意义(T2：Z=-6.473, P=0.000；SIR：Z=-5.378, P=0.000)。

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表1  实验组30只家兔肝脏T2值、SIR肝脏/肌肉及LIC的中位数、范围
Tab. 1  Median, maximum, and minimum values of SIR, T2, and LIC in the Iron overloaded group

2.3　实验组肝脏R2值、SIR（肝脏／肌肉）与LIC相关性

       肝脏R2值与LIC呈显著直线正相关(r=0.948, P=0.000；图7)。SIR（肝脏／肌肉）与LIC呈显著直线负相关(r=－0.845, P=0.000；图8)。根据线性回归，分别得到R2、SIR（肝脏／肌肉）与LIC拟合直线的斜率为96.426、－5.924，截距为－0.920、10.581，建立两者之间的回归方程如下。

       以上X1为R2值，X2为SIR(肝脏／肌肉)，Y为预测的LIC。

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图7,8  分别为R2值、SIR与LIC之间的散点图。实线为两者之间的拟合直线，虚线为95.0% CI
图9,10  分别为利用公式1、2和原子分光光度计所得的LIC之间的Bland-Altman图。图中水平实线表示两种方法所得LIC差值的均数，水平虚线表示差值的95.0％的分布范围
Fig. 7, 8  Scatter plots of R2 (Fig. 7), SIR (Fig. 8) against LIC with the linear fit (solid line) and the 95% CI (dashed lines).
Fig. 9, 10  Bland-Altman plots showing the differences between LIC(R2) (Fig. 9) and LICSIR (Fig. 10) and LICspectrophotometer. The solid line shows the mean difference between the 2 measurements, whereas the dashed lines indicate the upper and lower 95% bounds of agreement between the 2 measurements.

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2.4　重复性及预测LIC公式的准确性

       12只验证组家兔经过以上预测公式所得的LIC与经分光光度计测量的LIC的中位数及范围见表2。通过所得公式，R2值、SIR （肝脏／肌肉）预测的LIC与实际的LIC之间ICC分别为0.953、0.914，经Bland-Altman图分析也具有高度的一致性（图9, 图10）

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表2  验证组12只家兔经预测公式所得的LIC与实际的LIC的中位数、范围
Tab. 2  Median, maximum, and minimum values of LIC by the equations and spectrophotometer of 12 iron overloaded rabbits

3　讨论

       通过建立铁超负荷兔模型，本研究证实了使用3.0 T MRI测量肝脏R2值、SIR（肝脏／肌肉）与LIC(<10 mg/g干重)之间高度线性相关，利用3.0 T MRI预测一定范围的LIC具有可行性。

       人体不能排出过量的铁，肝脏中的铁主要以铁蛋白和含铁血黄素的形式存在。然而，大多数其他哺乳动物却能以不同的速度排出体内多余的铁^[15]。因此难以选择适合的实验动物建立完全模拟人体组织铁沉积过程的动物模型。本研究通过病理证实发现使用家兔建立铁超负荷MRI定量肝铁模型确实可行。因为经过证实沙鼠可以较好模拟人体铁沉积，所以大多数临床铁负荷研究常常选用其作为实验对象。本研究中笔者发现病理上家兔肝脏铁沉积模式与沙鼠及人类非常相似。随着右旋糖酐铁注射剂量的增加，家兔铁超负荷加重，铁颗粒首先沉积在肝脏门静脉周围，然后逐渐在肝小叶的中心静脉旁沉积，直到累及整个肝实质细胞。家兔体重及肝脏体积[本研究中实验组兔肝脏经排水法测量体积为(91±16) ml)]相对沙鼠都较大，利于进行MRI扫描。此外，在其肝脏MR图像上避开主要的血管、胆管选取均一的肝实质区域作为ROI也较容易，减少了测量误差，提高准确性。

       使用3.0 T MRI这种无创的检查方法，本研究比较了R2值、SIR与实际LIC之间的关系。结果显示在一定范围的LIC内，R2值与LIC的相关性高于SIR。此结果与其他研究发现相似^[16]。原因可能是R2值更为直接地反映了沉积在组织中的铁造成的弛豫时间缩短，而SIR是对T2WI的间接评估。虽然通过铁超负荷动物模型证实使用SIR这种方法可以定量LIC，但由于不同MR扫描仪之间的差异性使SIR相互比较存在困难。而且采用仅1个回波时间的GRE序列测量SIR，对重度肝铁沉积敏感性减低，因此不能评估一些范围的重度铁沉积。

       使用3.0 T MRI定量肝脏铁沉积也存在一定局限。首先，与1.5 T MRI比较，3.0 T MRI磁敏感伪影和移动伪影更为显著，因此必须改进匀场方法^[17]。其次，在3.0 T MRI组织信号衰减加快，由于MR机器硬件对最小回波时间的限制，这也限制了可检测到组织铁沉积的最大含量，尤其不利于对铁沉积较多的肝脏检查^[9,10]。近期1篇文献报道患者的LIC> 37 mg/g干重时使用3.0 T无法准确定量^[9]。虽然有局限，但对于临床鉴别肝铁沉积严重程度的几个重要界值（1.8、3.2、7.0、15.0 mg/g干重^[18]），使用3.0 T还是可以准确测量，这些已经可以对临床诊断肝铁沉积及制定去铁方案提供帮助。最后，本研究通过探讨R2、SIR与实际LIC之间关系而推导的预测公式是在肝铁沉积动物模型上建立的，因此可能不能直接应用于铁超负荷患者。因为家兔铁沉积的病理生理特点可能与人类不尽相同，解决上述问题需要更进一步研究。

       综上所述，本研究通过建立肝铁沉积兔模型证明使用3.0 T MRI参数SIR、R2值在一定LIC范围内定量铁沉积具有可行性。随着3.0 T MR扫描仪在医疗机构数量逐渐增多，本研究对高场强下评估铁超负荷患者肝铁沉积的可行性奠定了基础。