传统的DWI建立在布朗运动基础上，即水分子的自由扩散。但事实上，除了自由扩散外，组织内的水分子不仅能够被动扩散，还能够通过水通道蛋白进行主动转运，水通道蛋白系统的提出，对传统DWI理论提出极大的挑战。水分子水通道蛋白磁共振分子成像（AQP MRI）技术是近年来提出的一种建立在水通道蛋白理论基础上全新的MR分子成像技术，它在分子谱获得数据的基础上对其进一步处理获得细胞膜上AQP信息^[1]。AQP MRI新技术的提出使在活体上研究水通道蛋白的活性及相对定量成为了可能，但目前这一创新性技术的应用尚处于起步阶段，需要更多的数据支持与论证。脑水肿是缺血性脑卒中的重要致病机制，已有大量研究表明，脑缺血后AQP4表达水平发生显著的改变^{[2,3,4,5,6,7]}，传统DWI对细胞毒性水肿存在高度敏感性^[8]，T2WI反映脑组织水含量，体现血管源性水肿^[9]，而对于AQP MRI对缺血性脑水肿的评价价值尚未见到报道。因此，本次实验通过建立大鼠短暂性脑缺血模型，探讨AQP MRI对缺血性脑卒中的应用价值。

1　材料与方法

1.1　动物建模

       雄性成年SD大鼠31只，体重180~250 g，购自上海伊莱克斯动物实验中心。大鼠随机分为两组：实验组（25只）和假手术组（6只）。

       如前文所述^[6,10]，应用线栓法经由右侧颈内动脉插入线栓进而栓塞右侧大脑中动脉来建立大鼠脑缺血模型，具体操作如下：大鼠术前24 h予禁食但不禁水，麻醉经5％异氟烷诱导，术中维持量为2~3％异氟烷。实验组大鼠切开颈部皮肤，分离右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，于颈外动脉近端近分叉处插入预先浸泡过2％肝素的线栓（直0.26 mm），插入线栓直至距离分叉处约1.8～2.0 cm ，1 h后拔出线栓恢复再灌注，缝合切口。假手术组仅分离出颈动脉而不进行任何栓塞。术中恒温垫保持大鼠体温在37℃。建模过程中应用激光多普勒血流仪（PeriFlux System 5000）监测大鼠脑血流灌注，下降至75％以上为建模有效，25只大鼠最后成模15只，成功率约60%。本实验经伦理委员会审查通过。

1.2　MRI检测

       在恢复再灌注后48 h行MRI(GE，Discovery MR750)检测，检查采用小动物专用线圈(WK602，Magtron Inc)，采集包括冠状位T2 FlAIR、常规DWI (b值1000 s/mm²)、AQP MRI (6个高b值：2000、2500、3000、3500、4000、4500 s/mm²)。T2 FlAIR序列：TR 8450 ms ，TE 145 ms，回波链长度32，矩阵256×256，视野10 cm×10 cm，层厚2 mm，间隔0，层数5，激励次数1，反转角111° ，带宽62.5 kHZ。AQP MRI序列扫描参数：TR 3300 ms，TE最小值，带宽166.7，矩阵128×128，视野10 cm×10 cm，层厚2 mm，间隔0，层数5。

1.3　数据后处理

       将图像传输至GE Advantage Workstation4.4工作站，应用Functool软件进行后处理测量常规ADC值以及T2信号值，应用AQP ADC后处理软件包得到AQP ADCmean值。ROI勾画原则：以T2 FLAIR图像为标准，实验组在有病灶的层面根据病灶区域手动勾画ROI，并镜像勾画出健侧的相应区域，避开脑室位置，勾画ROI工作均由同一个具有丰富神经影像诊断经验的医师执行，为避免手动误差，1周后复测，取两次平均值。单个个体间先计算出平均值。为消除由于个体差异造成的不均一性，参考其他脑功能类指标如DKI、DTI的测量方法^[11]，结果以100×（患侧-健侧）/健侧的差值百分比表示，无病灶的层面处理同假手术组。假手术组在每层的皮质区和白质区各随机采集5个ROI，镜像勾画对侧相应区域，结果以100×（右侧-左侧）/左侧的差值百分比表示。

1.4　Western Blot

       大鼠MRI检测完毕后，10％水合氯醛腹腔内注射（300 mg/kg）麻醉，固定四肢，4℃预冷的PBS缓冲液经心脏冲洗，断头取脑，分离出右侧半脑的梗塞区及健侧相应的区域，加入RIPA裂解液研磨，匀浆，离心收集蛋白样品。BCA法对蛋白进行定量。SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳后转PVDF膜。经漂洗和封闭后，加入兔抗大鼠AQP4抗体（1:500；Santa Cruz Biotechnology，SC-20812）孵育，内参为兔抗大鼠β-actin (1:1000；immunoway，YT0099)加入HRP标记的山羊抗兔IgG（北京中杉，ZB-2301），加入底物显影后，经凝胶成像系统显像（Chemidoc MP,Bio-rad），采集图像。

1.5　免疫荧光和共聚焦

       麻醉大鼠，PBS和4％多聚甲醛行心脏灌注，快速断头取出脑组织，预冷PBS漂洗。鼠脑置于4％多聚甲醛溶液中固定4~6 h，PBS漂洗，滤纸吸干后置于30％蔗糖溶液中，标本沉底后包裹包埋剂-80℃冰箱内保存。连续冠状切片，片厚40 um，连续5张片取1张，每一标本各取20张备用。冻存液-20℃冰箱内保存。免疫荧光法检测缺血组大鼠AQP4表达情况，而后进行共聚焦显微镜观察。

1.6　统计分析

       所有结果均以平均值±标准差表示，应用SPSS 17.0进行成组设计资料的t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1　激光多普勒脑血流灌注图

       为保证实验的一致性，对缺血性脑卒中的建模条件严格控制，并通过激光多普勒血流仪评判血流灌注改变情况，成模指标为栓塞后血流灌注下降75％以上。25只实验组大鼠最终符合建模成功条件的为15只，建模成功率为60%。脑血流灌注成像图见图1。

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图1  激光多普勒血流仪监控脑血流灌注
图2  假手术组（sham）及实验组（ischemia）的多模态MRI图像对比。实验组患侧病灶在T2 FLAIR上呈高信号（白线所示），相应的ADC （b=1000 s/mm²）图像上病灶信号减低，病灶的AQP ADC值亦较对侧明显减低。从伪彩图上对比，病灶在AQP ADC上的范围虽然与传统ADC基本一致，但AQP ADC图像显然更具层次感，能够为我们提供更多的信息，而该信息很可能就是提示了水通道蛋白的分布情况
Fig. 1  Brain perfusion was monitored by Laser Doppler Flowmeter.
Fig. 2  Multi-model MR imaging of sham group and ischemia group. T2 FLAIR showed signals of lesions were abnormally increased in ischemia group (depict by white line), the homologous ADC values and AQP-ADC values were both remarkably decreased. As seen in pcolor, although the range of lesions in AQP-ADC mapping were almost consistent with traditional ADC, but the color level of AQP ADC images was obviously more profuse ,which might provide us more information. This information would be likely to infer the distribution of aquaporin.

2.2　T2 FLAIR、DWI及AQP MRI结果分析

       从图2中可以看到，在恢复再灌注后48 h，实验组患侧在T2 FLAIR上可见明显的高信号，而假手术组双侧均无明显异常信号。实验组病灶在ADC (b=1000 s/mm²)图像上减低，病灶的AQP ADC值亦较对侧明显减低。对比实验组病灶在三个序列上的成像，可以看到病灶在三个序列上的分布较为一致，且从伪彩图上对比，实验组AQP ADC图像上病灶与健侧相应区域之间的颜色跨度差异比ADC图大。在接下来的T2值、ADC值及AQP ADC值的差值百分比的对比（表1，图3）中可以看到，实验组病灶的T2信号明显升高，显著高于假手术组(P<0.01)，而相应的ADC值降低(P<0.01)；AQP ADC结果显示实验组的AQP ADC值较假手术组显著降低(P<0.01)，说明在恢复再灌注后48 h，AQP ADC亦可以反映病灶的改变。

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图3  实验组与假手术组各指标的百分比变化柱形图。实验组病灶的T2信号明显升高，显著高于假手术组(P<0.01)，而相应的ADC值降低(P<0.01)；AQP ADC结果显示实验组的AQP ADC值较假手术组显著降低(P<0.01)
Fig. 3  Histogram of indexes percentage change between ischemia and sham group. The percent change of T2 values of lesions in ischemia group was much higher than that of sham group (P<0.01), whereas the homologous ADC values were remarkably decreased (P<0.01). The percent change of AQP ADC of ischemia group was significantly decreased than that of sham group (P<0.01).

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表1  实验组与假手术组各指标的百分比变化对比(±s)
Tab. 1  Comparison of percentage change of indexes between ischemia and sham group (±s)

2.3　AQP4的Western Blot、免疫荧光结果及与AQP-ADC的对比

       如图4所示，Western Blot实验组患侧的AQP4蛋白表达量较假手术组显著升高，提示AQP-ADC与AQP4的表达量可能为负相关，为进一步明确，将同一大鼠的AQP-ADC图像与免疫荧光结果做对比，AQP ADC值高的区域，AQP4阳性染色降低，而AQP ADC值低的区域，AQP4阳性染色增多。

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图4  AQP4的Western Blot、免疫荧光结果。A：为实验组单只大鼠的AQP-ADC图像。B、C：分别为患侧和健侧指定区域（图A中的白色方框）的AQP4免疫荧光染色图，可以看到AQP ADC值高的区域，其AQP4阳性染色降低，而AQP ADC值低的区域，其AQP4阳性染色增多。D: AQP4的Western Blot结果，可以看到实验组患侧的AQP4蛋白表达量较假手术组显著升高
Fig. 4  Western blot and immunofluorescence result of AQP4. A: AQP-ADC mapping of single rat of ischemia group. B and C showed immunofluorescence of AQP4 in affected side and healthy side respectively. Areas with high AQP ADC values presented low positive staining of AQP4, and areas with low AQP ADC values presented high positive staining. D: Western blot result showed that the AQP4 expression in affected side of ischemia group was higher than that of sham group.

3　讨论

       水通道蛋白（AQPs）是广泛存在于原核及真核生物细胞膜上，选择性高效转运水分子的特异孔道，对维持机体的水平衡及细胞微环境的稳定发挥关键作用，AQPs的出现彻底改变了传统观念上水在细胞膜扩散（被动转运）观念，创立了水在细胞膜主动转运全新理论基础^[12,13,14]。1988年，自Agre等在人血红细胞上分离纯化获得A0P1之后，目前已经陆续从哺乳动物组织中分离得到了13种AOPs(AQP0-AQP12)^[15,16]。而根据其一级结构及转运功能的不同，可以将AQPs分成三类：水特异性通道蛋白、水甘油通道蛋白以及超水通道蛋白。研究证实水通道蛋白广泛分布于全身各组织器官，介导着不同类型细胞膜上水和小分子物质的跨膜转运，对维持体内渗透压及内稳态的平衡具有十分重要的生理意义^[12]。目前，水通道蛋白已经成为包括脑卒中在内的许多疾病重要的治疗靶点，对其功能的调控具有十分重要的治疗意义。随着当今技术的飞速发展，高场强MRI在脑疾病诊断中的作用日益重要^[17,18]而AQP MRI技术正是建立在水通道蛋白理论基础上一种全新的高场强MR分子成像技术。AQP MRI的提出，为实现在体、实时、定量检测AQPs提供了可能。

       目前对于AQP-MRI研究多见于细胞以及肝纤维化模型^[19,20]，在神经系统中已有见到PD和胶质瘤的应用报道^[21,22]，但在脑缺血模型中的应用尚未见到相关报道。为实现活体上显示AQPs的表达情况，笔者应用AQP MRI对短暂性脑缺血大鼠模型进行检测，结果发现脑缺血病灶在AQP MRI上的分布与T2FLARI及传统DWI上基本一致，说明AQP MRI和T2WI以及传统DWI一样能够对脑梗死病灶做出准确显像，而值得注意的是，AQP-ADC伪彩图所呈现的色彩跨度较传统ADC图要大得多，说明由多个高b值（≥2000 s/mm²）计算得到的AQP-ADC相较于传统ADC蕴含着更多的微观信息。AQP-ADC是否反映的就是水通道蛋白的表达？从图3及表1中可以看出，实验组大鼠患侧的AQP ADC值显著较健侧降低，且实验组双侧的百分比变化较假手术组则显著降低(P<0.01)，Western Blot结果显示脑缺血后AQP4表达水平升高，这与国内外研究结果一致^{[2,3,4,5,6,7]}，该结果提示我们AQP ADC与可能与AQPs的表达有关。进一步对AQP-ADC图像与AQP4的免疫荧光染色进行对比发现，AQP ADC值高的区域，其AQP4阳性染色降低，而AQP ADC值低的区域，AQP4阳性染色增多（图4），说明AQP-MRI能够在一定程度上反映AQP4的表达情况。AOP4在脑内的表达最为丰富，属于水特异性通道蛋白，但除此之外，大脑还表达AQP1和AQP9，本次研究只对AQP4进行了检测，至于AQP-MRI是否反映能够对其他两种水通道蛋白尚不明确。AQP4在脑缺血后的作用非常复杂，首先其在脑缺血后的表达水平有升高^[7]，有降低^[23]，其次AQP4对水分子的转运具有双向性，既能够促进细胞毒性水肿的形成^[24]，但同时又抑制血管源性水肿^[25]。近来的研究表明，AQP4在脑缺血后的表达水平事实上是一个动态变化的过程^[26]，其水平的改变受到包括动物模型、建模方法等多种因素的影响^[27]。若能在活体中实现对AQP4的实时定量分析，能够极大帮助我们进一步探讨AQPs在脑缺血中的作用机制，因此AQP MRI的出现开拓了一个全新的研究方向。在进一步明确了AQPs在脑缺血中的作用机制后，若能够实现对AQPs的实时在体监控，这无疑能够对将来脑卒中的临床诊疗提供极大的指导意见。

       尽管本研究是国内外首次应用AQP MRI对缺血性脑卒中进行成像，但目前只进行了初步探讨，尚存在许多不足，所能展示的微观信息尚十分有限，仍需要进一步的研究以明确AQPs的作用机制。例如，本次研究仅选取了48 h作为检测点，尽管研究表明再灌注后48 h为缺血后AQP4的第二个表达高峰^[7,27]，但在今后的研究中，需要应用AQP MRI进行动态检测，以进一步发挥AQP MRI的检测优势。此外，目前有关AQP MRI的研究尚局限于离体研究，本次实验为缺血性脑卒中模型的在体研究，这为AQP MRI的临床应用转化进一步奠定基础，但目前还远远不够，我们还需要进一步对AQP MRI与AQPs的表达进行相关性研究，以进一步明确AQP MRI的诊断价值。

       综上，AQP MRI可以在体、实时、动态的进行AQPs分子成像，有利于推动AQPs基础研究向临床用的转化，具有广阔的应用前景，但目前对该成像技术的应用研究甚少，且是否能够对AQPs的精确定量仍需进一步的验证。本研究也仅对AQP MRI对缺血性脑卒中的成像进行了初步探讨，需要进一步开展更多的在体及相关临床应用研究。